СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРОТОНИНОВОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ Российский патент 2005 года по МПК G09B23/28 A61K35/18 A61P43/00 

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для моделирования хронической серотониновой недостаточности. Известно, что острая серотониновая недостаточность возникает при однократном поступлении в организм большого количества антагонистов серотонина, например психотропных препаратов. Клинически это проявляется в нарушении сознания, кишечной непроходимости и сосудистой недостаточности. Внутривенное введение серотонина позволяет снизить летальность в 2 раза и купировать вышеуказанные клинические проявления острой серотониновой недостаточности. Ряд отечественных авторов считают, что широко распространена и хроническая серотониновая недостаточность. Например, утверждают, что диабетическая и возрастная ангиопатия сопровождается хронической серотониновой недостаточностью, доказывая это тем, что во время внутривенного введения серотонина электрическая активность гладкой мускулатуры возрастает, и параллельно происходит уменьшение тканевой гипоксии (2). Это утверждение было бы бесспорным, при измерении концентрации серотонина и антагонистов серотониновых рецепторов в плазме, например, гемоглобина как до, так и после введения серотонина.

На сегодняшний день как в мировой, так и в отечественной литературе показан широкий физиологический диапазон действия серотонина. Известно, что серотонин участвует в регуляции общего уровня активности центральной нервной системы, циклов сна - бодрствования, общей двигательной активности, разных форм эмоционального поведения, процессов памяти и обучения. Кроме этого, серотонин имеет прямое отношение к нормальному кровоснабжению глаза, внутриглазному давлению, регуляции динамики камерной влаги, к восприятию, обработке и хранению зрительных образов, а также к трофике нейронов. Существует огромное количество экзогенных антагонистов серотонина, приводящих к нарушению ряда вышеуказанных функций. Описаны не известные ранее свойства ферропротеинов (гемоглобина и миоглобина) блокировать серотониновые рецепторы гладкой мускулатуры (2). В лаборатории фармакологии (рук. - акад. РАМН М.Д.Машковский) на изолированных отрезках кишки морских свинок и кроликов было показано, как на фоне добавления возрастающих концентраций гемоглобина происходит уменьшение амплитуды сокращений гладкой мускулатуры, вызываемых серотонином в одной и той же концентрации. Эти опыты показали, что гемоглобин является эндогенным антагонистом серотонина. Принимая во внимание широкую распространенность серотониновых рецепторов в центральной нервной системе, кровеносных сосудах и тканях различных органов, в том числе глазе, с одной стороны, и многообразие патологических состояний с геморрагическим компонентом (травматический гемофтальм, тромбозы вен сетчатки, экссудативно-геморрагическая стадия центральной хориоретинальной дистрофии, диабетическая ретинопатия), с другой стороны, при которых в кровь поступает дополнительное количество гемоглобина, возникает необходимость разработать модель хронической серотониновой недостаточности для понимания различных звеньев патогенеза и последующего адекватного лечения вышеуказанных патологических процессов.

Учитывая вышеизложенное, нами была поставлена задача разработать модель хронической серотониновой недостаточности, используя эритроцитарный аутогемолизат и эритроцитарную аутомассу.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение адекватной модели хронической серотониновой недостаточности.

Технический результат достигается за счет блокады серотониновых рецепторов, расположенных в кровеносных сосудах и стекловидном теле, в результате этого повышается концентрация серотонина в плазме крови и стекловидном теле глаза кролика. Интравитреальное введение трижды отмытой эритроцитарной аутомассы или парентеральное введение эритроцитарного аутогемолизата, содержажего ферропротеины, блокирующие серотониновые рецепторы, обеспечивает адекватную модель хронической серотониновой недостаточности. В результате блокады серотониновых рецепторов серотонина оказывается больше, чем не занятых ферропротеинами свободных серотониновых рецепторов, за счет этого увеличивается его концентрация в исследуемых биологических образцах (периферическая кровь, стекловидное тело). Выбор того или иного пути введения зависит от условий эксперимента, в котором необходимо использовать эту модель.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Забор крови, приготовление отмытой эритроцитарной аутомассы и получение эритроцитарного аутогемолизата.

Кровь забирают, например, из краевой вены уха кролика гепаринизированным шприцем в количестве 2,0 мл. Затем кровь центрифугируют при 1000 оборотов в минуту в течение 10-15 минут. Супернатант удаляют, а к оставшейся эритроцитарной массе добавляют 8,0 мл физиологического раствора. Получившуся эритроцитарную взвесь несколько раз тщательно перемешивают и центрифугируют в указанном режиме. Затем жидкость выше уровня эритроцитов удаляют, оставляя в пробирке эритроцитарную массу. Указанный процесс отмывания эритроцитов повторяют еще 2 раза, таким образом получают отмытую эритроцитарную аутомассу, готовую для инравитреального введения. При помещении отмытой эритроцитарной массы в холодильник с температурой минус 17 на одни сутки с последующим размораживанием получают эритроцитарный аутогемолизат.

2. Способ интравитреального введения эритроцитарной аутомассы и определение концентрации серотонина в стекловидном теле.

А) премедикация - внутримышечно кролику вводят литическую смесь, состоящую из 1,0 мл баралгина и 0,5 мл 1-процентного димедрола. Эпибульбарно - 0,5-процентный дикаин.

Б) под бинокулярным микроскопом в верхнем наружном квадранте глазного яблока отсепаровывают конъюнктиву и на 12 часах в 3,0 мм от лимба инъекционной иглой осуществляют прокол склеры и сосудистой оболочки и вводят трижды отмытую эритоцитарную аутомассу в дозе 0,2 мл на 1,0 кг животного. В эту часть эксперимента были включены 9 кроликов. У всех 9 кроликов, которым вводили трижды отмытую эритроцитарную аутомассу, осуществляли забор стекловидного тела для определения в нем концентрации серотонина. Контрольный забор стекловидного тела осуществляли перед введением трижды отмытой эритроцитарной аутомассы. Повторные заборы проводили на 3, 5 и 6 сутки один раз в каждой из 3 подгрупп, включавшей 3 кролика. Контрольный забор периферической крови для определения в ней концентрации серотонина осуществляли непосредственно до интравитреального введения трижды отмытой эритроцитарной аутомассы с последующим забором крови для этой цели на 3, 5, 6 и 25 сутки. Концентрацию серотонина определяли распространенным флюориметрическим методом по Б.М.Когану (1).

В) Способ введения эритроцитарного аутогемолизата. После размораживания при комнатной температуре эритроцитарной аутомассы она превращается в гемолизат, который в дозе 0,2 мл на 1,0 кг животного вводили одной группе кроликов (5 кроликов) внутривенно, другой - внутримышечно (5 кроликов), один раз в сутки, в течение 5 дней. Концентрацию серотонина определяли в периферической крови до введения эритроцитарного аутогемолизата и на 3, 5, 6 и 25 сутки после окончания введения эритроцитарного аутогемолизата.

Предпринятые нами исследования показали следующее:

1. При внутривенном введении эритоцитарного аутогемолизата была выявлена следующая динамика концентрации серотонина в периферической крови - интактная плазма содержала 1,34±0,08 мкмоль/л серотонина, на 3, 5 и 6 сутки его концентрация достоверно повысилась (р<0,01) и составила 2,01±0,11; 2,8±0,12 и 3,08±0,16, соответственно. На 25 сутки концентрация серотонина в периферической крови еще оставалась достоверно (р<0,01) повышенной - 1,61±0,03 мкмоль/л.

2. При внутримышечном введении эритроцитарного аутогемолизата динамика изменения концентрации серотонина была следующей: интактная плазма - 1,27±0,11; третьи сутки - 2,24±0,16; пятые сутки - 2,67±0,12; шестые сутки - 2,83±0,14; 25 сутки - 1,56±0,12 мкмоль/л.

3. Однократное интравитреальное введение трижды отмытой эритроцитарной аутомассы показало нарастание концентрации серотонина как в стекловидном теле, что свидетельствует о ранее неизвестном факте - наличии серотониновых рецепторов в стекловидном теле, так и в периферической крови. Концентрация серотонина в стекловидном теле до введения в него эритроцитарной аутомассы - 0,67±0,004 мкмоль/л; на 3 сутки концентрация составила - 1,0±0,01; на 5 сутки - 1,34±0,05; на 6 сутки уровень серотонина повысился до 1,41±0,07. Параллельно с повышением уровня серотонина в стекловидном теле повышалась его концентрация и в периферической крови: интактная плазма содержала 1,31±0,09 мкмоль/л серотонина, на 3 сутки уровень повысился - 1,92±0,1; на 5 сутки - 2,12±0,07; на 6 сутки - 2,52±0,04. Через 25 суток после однократного интравитреального введения трижды отмытой эритроцитарной аутомассы уровень серотонина оставался существенно выше уровня серотонина в интактной плазме - 1,83 мкмоль/л.

Таким образом, стойкое и длительное повышение концентрации серотонина как в стекловидном теле глаза кролика, так и в периферической крови после вышеуказанного способа введения эритроцитарной аутомассы или эритроцитарного аутогемолизата свидетельствует о создании адекватной модели хронической серотониновой недостаточности за счет блокады серотониновых рецепторов дополнительным количеством аутогемоглобина, находящемся в эритроцитарном аутогемолизате и высвобождающемся из эритроцитарной аутомассы, введенной в стекловидное тело, при деградации содержащихся в ней эритроцитов.

Пример 1.Кролику породы Шиншилла весом 2,5 кг интравитреально ввели 0,5 мл трижды отмытой эритроцитарной аутомассы. Показатели динамики концентрации серотонина в стекловидном теле до введения эритроцитарной аутомассы - 0,71 мкмоль/л; на 3 сутки концентрация серотонина возросла до 1,1 мкмоль/л; на 5 сутки составила - 1,8 мкмоль/л; на 6 сутки - 1,44 мкмоль/л. Параллельно повышению концентрации серотонина в стекловидном теле наблюдалось повышение уровня серотонина и в периферической крови: концентрация серотонина в периферической крови до введения трижды отмытой эритроцитарной аутомассы в стекловидное тело была равна 1,33 мкмоль/л, на 3, 5, 6 и 25 сутки составила 1,89; 2,3; 2,64 и 1,69 мкмоль/л, соответственно. Полученные результаты свидетельствуют о стойком и длительном повышении концентрации серотонина как в стекловидном теле, так в периферической крови, что указывает на развитие хронической серотониновой недостаточности у подопытного кролика.

Пример 2. Кролику породы Шиншилла весом 2,5 кг внутривенно вводили 0,5 мл эритоцитарного аутогемолизата один раз в сутки в течение 5 дней. Результаты - содержание серотонина в периферической крови до внутривенного введения эритроцитарного аутогемолизата составило 1,41 мкмоль/л; на 3, 5, 6 и 25 сутки уровень серотонина повысился и составил - 2,21; 2,63; 2,95 и 1,78 мкмоль/л, соответственно. Таким образом, курсовое введение эритроцитарного аутогемолизата привело к развитию хронической серотониновой недостаточности, на что указывает существенное повышение концентрации серотонина в периферической крови в течение длительного (25 суток) срока.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об адекватности модели хронической серотониновой недостаточности, что позволяет использовать ее для оценки лечения, выбора фармакологических препаратов, для научных исследований, связанных с изучением патогенеза различных заболеваний.

Литература

1. Коган Б.М., Нечаев Н.В Чувствительный и быстрый метод одновременного определения ДОФА, норадреналина, серотонина и 5-ОИЦК в одной пробе.// Лабораторное дело. - 1979. - №5. - С.301-303.

2. Симоненков А.П., Федоров В.Д. Является ли хроническая серотониновая недостаточность основой диабетической и возрастной ангиопатий? // Бюлл. Экспериментальной биологии и медицины. - 1997. - т. №1. - С.103-110.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и предназначено для моделирования хронической серотониновой недостаточности. Для этого в течение 5 дней парентерально вводят эритроцитарный аутогемолизат или интравитреально однократно вводят трижды отмытую эритроцитарную аутомассу. Доза для обоих путей введения составляет 0,2 мл на 1,0 кг животного. Способ обеспечивает блокаду серотониновых рецепторов, что приводит к развитию серотониновой недостаточности. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ моделирования хронической серотониновой недостаточности, включающий введение эритроцитарного аутогемолизата парентерально или трижды отмытой эритроцитарной аутомассы интравитреально один раз в сутки в дозе 0,2 мл на 1,0 кг животного для обоих путей введения.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что интравитреально эритроцитарную аутомассу вводят однократно.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что парентерально эритроцитарный аутогемолизат вводят в течение 5 дней.