ШТАММ "52/70-М" ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ И ОЦЕНКИ ИХ ИММУНОГЕННОСТИ Российский патент 2005 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и может быть использовано при производстве инактивированной вакцины против инфекционной бурсальной болезни птиц (ИББ), а также в качестве контрольного вирулентного штамма для оценки иммуногенных свойств вакцинных штаммов указанного заболевания.

Основным направлением профилактики ИББ является применение вакцинных препаратов. Для этого используют живые и инактивированные вакцины, эффективность которых определяется качеством, главным образом их высокой иммуногенностью и безвредностью.

Вируссодержащая жидкость с высоким содержанием вируса является исходным материалом при производстве вакцин, оценки их качества и получении диагностических препаратов, а также инактивированной вакцины. Дальнейшая последовательная обработка вирусной жидкости зависит от требуемого конечного продукта и технологических условий. Вируссодержащая жидкость используется как составная часть диагностического или вакцинного препарата; антиген для иммунизации животных при получении гипериммунных диагностических сывороток; исходный материал для получения преципитирующего антигена вируса ИББ и изготовление инактивированной вакцины.

При оценке иммуногенной активности вакцинных штаммов учитываются результаты сероконверсии и данные по устойчивости привитой птицы к заражению вирулентным штаммом вируса ИББ. Штамм, предназначенный для контрольного заражения для оценки иммуногенности, должен быть стабильным, свободным от контаминации, достаточно вирулентным и обладать высокой биологической и антигенной активностью.

Согласно данным литературы для производства различных иммунобиологических свойств вируса ИББ используют различные штаммы вируса ИББ - штамм "СТ" [1], штамм "БГ" вируса ИББ [2] и штамм "Винтерфильд" [3].

Вместе с тем инфекционная активность штаммов вируса ИББ, приведенная в работах [1] и [3], не превышает 10^6,0 ТЦД₅₀/мл, а преципитирующей активностью вовсе не обладают.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм "БГ" вируса ИББ птиц, предназначенный для производства иммунобиологических препаратов [2]. Штамм "БГ" культивируется заражением 10-суточных СПФ куриных эмбрионов при 37,7°С и влажности 54-66%. В течение 72-96 часов инкубирования вирус накапливается до 5,25-6,0 lg ЭИД_50/0,2 мл, при этом преципитирующий титр не в одном из экспериментов не превышал 1:16. Следует отметить, что преципитирующая активность штамма "БГ" часто некоррелировала со значением инфекционного титра. Титр активности антигена в РДП составлял 1:4-1:16, причем максимальный титр 1:16 был установлен только в 3 из 10 опытов.

Нестабильность полученных результатов и низкий титр преципитирующей активности антигена затрудняют производство иммунобиологических препаратов вируса ИББ на основе этого штамма. Штамм "БГ" вследствие многократных пассажей на СПФ-эмбрионах потерял свои инфекционные свойства и по этой причине не может быть использован как контрольный вирулентный вирус в опытах по оценке рммуногенности вакцинных препаратов против ИББ.

Цель изобретения достигается получением стабильного вирулентного штамма вируса ИББ, обладающего высокой преципитирующей и инфекционной активностью, пригодного для изготовления инактивированной вакцины и в качестве контрольного вирулентного штамма при оценке иммуногенности вакцин против ИББ.

Штамм "52/70-М" депонирован в Государственной коллекции вирусов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 03.04.1992 г. под регистрационным номером - вирус ИББ - "52/70-М-ДЭП".

Получение штамма. Материалом для выделения вируса ИББ служит гомогенат фабрициевых сумок больных или павших цыплят. Пораженные сумки гомогенизируются в 0,001 М фосфатно-буферном растворе (рН 7,2-7,4) в соотношении 1:1 (вес на объем), трижды замораживают и оттаивают, центрифугируют при 4000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную жидкость стерильно отсасывают, проверяют на стерильность, биологическую и антигенную активность (таблица 1).

Выделение вируса проводят на СПФ-куринных эмбрионах 11-дневного возраста. Вирусный материал в объеме 0,2 мл инокулируют на хориоаллантоисные оболочки (ХАО) и инкубируют при 37-38°С в течение 96-120 часов. Просмотр эмбрионов осуществляют ежедневно, павшие эмбрионы в течение 3-5 суток гомогенизируют в фосфатно-солевом буфере (рН 7,2-7,4), трижды замораживают и оттаивают, центрифугируют при 4000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость стерильно отсасывают, проверяют на стерильность, биологическую и антигенную активность.

Характеристика штамма. Штамм "52/70-М" соответствует единной структуре вируса ИББ и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ИББ: форма вириона экосаэдрическая, размер вириона - 58-60 нм. Его инфекционная активность подавляется физическими и химическими средствами (рН, тепло, ацетон, формалин, Уф-облучение). Вирус не проявляет геммаглютинирующей активности.

Типичным проявлением штамма является активное размножение на 11-суточных СПФ-эмбрионах, получение вируссодержащей жидкости с титром инфекционности 10^6,0-10^6,5 ЭИД₅₀/мл и преципитирующей активности 1:32-1:64. Определение титра инфекционности проводят методом титрования на СПФ-куриных эмбрионах с 10-кратным разведением вирусной суспензии на физиологическом растворе. Окончательный учет проводят на 7-8 день путем учета патологоанатомических изменений в органах зараженных эмбрионов. Штамм "52/70-М" вируса ИББ нейтрализуется специфическими антителами. Реакцию нейтрализации проводят на куриных СПФ-эмбрионах.

Пример 1. В качестве специфической сыворотки используют гипериммунную сыворотку к вирусу ИББ, Для получения гипериммунной сыворотки к вирусу ИББ цыплят заражают вирулентным штаммом "52/70-М" в возрасте 35-40 суток и через 15 суток повторно вводят вирус в объеме 0,5 см в грудную мышцу. Сыворотку от цыплят получают через 14 суток после повторного введения штамма. Сыворотку проверяют на активность и специфичность в реакции диффузной преципитации и реакции нейтрализации (таблица 2).

Пример 2. Использование штамма "52/70-М" для оценки иммуногенности вакцин против ИББ.

Одним из требований в производстве вакцин является их проверка на иммуногенность, т.е. определение степени устойчивости вакцинированной птицы к заражению вирулентному штамму вируса гамологичного путем заражения птицы контрольным вирулентным штаммом данного возбудителя.

В таблице 3 представлены результаты контрольного заражения цыплят, привитых вакцинами разного производства, вирулентным штаммом "52/70-М". Вирулентный вирус вводили интраназально цыплятам всех групп в дозе 0,2 мл через 21 суток после иммунизации. После окончания наблюдения птиц убивали и производили вскрытие для выявления патологоанатомических изменений, характерных для вируса ИББ. Результаты опытов свидетельствуют, что вирулентный штамм "52/70-М" одинаково пригоден для оценки иммуногенности как живых, так и инактивированных вакцин против ИББ.

Пример 3. Изготовление и испытание инактивированной вакцины.

Инактивированную вакцину против вируса ИББ готовят из штамма вируса "52/70-М", выращенного в развивающихся СПФ-эмбрионах кур. Вируссодержащий материал инактивируют 0,1%-ным раствором В-пропиолактона с последующей проверкой на полноту инактивации. Готовится масляная эмульсия на основе минерального масла Маркол-52 с добавлением арлацела.

Результаты исследований по оценке иммуногенной активности инактивированной вакцины из штамма "52/70-М" представлены в таблице 4.

Источники информации

1. Годизов П.Х. Иммунобиологические свойства вакцинного штамма "СТ" и эффективность специфической профилактики бурсальной болезни птиц. - г. Тарту, Эстония СХА, 1990, с.21.

2. Патент РФ № 2127602, с.12, 24.11.1997 г.

3. Патент РФ № 2127604, с.12, 14.04.1998 г.

Таблица 1
Преципитирующая и биологическая активность штамма "52/70-М" вируса ИББ№№ опытовПреципитирующая активность в РДПБиологическая активность на СПФ-эмбрионах (ЭИД 50/мл)11:326,021:165,7531:165,7541:165,7551:646,561:646,571:325,7581:325,591:325,5101:646,5

Таблица 2
Активность иммунных сывороток в РДП и РН№№ опытовТитр антителРДПРН11:1261:102421:641:51231:1261:102441:2561:204851:1261:102461:1261:102471:641:51281:641:51291:641:512101:641:512

Таблица 3
Результаты контрольного заражения штаммом "52/70-М" СПФ-цыплят, привитых против ИББГруппа цыплят, привитая вакцинойВсего головРезультаты заражения, заболело/палоПроцент иммуногенностиД-78201/195КБК200/0100Бюр-706200/0100Инактивированной201/095Контроль, невакцинированной2020/50

Таблица 4
Иммуногенная активность инактивированной вакцины против ИББ из штамма "52/70-М"№/№ опытовДоза вируса на 1 гол. в ЭИД 50/млВакцинированноРезультаты контрольного зараженияЗараженоЗаболелоПроцент сохранностиПервый опыт     110101028021010100100310101001004Контроль1010100Второй опыт     110101019021010100100310101001004Контроль1010100Третий опыт     110101028021010100100310101001004Контроль1010100

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Штамм вируса инфекционной бурсальной болезни (ИББ) «52/70-М» выделен из фабрициевых сумок больных и павших цыплят. Штамм обладает выраженной преципитирующей и инфекционной активностью. Изобретение может быть использовано для производства инактивированной вакцины против вируса ИББ и для оценки иммуногенных свойств вакцин против вируса ИББ. 4 табл.

Штамм вируса инфекционной бурсальной болезни птиц Bursitis infectiosa gallinal cem. Birnaviridal, pog. Avibirnavirus, ВГНКИ серотип «52/70-М» для изготовления инактивированной вакцины и оценки иммуногенности вакцин против инфекционной бурсальной болезни.