СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ КУР Российский патент 2006 года по МПК A61K39/12 

Изобретение относится к птицеводству и может быть, в первую очередь, применено для профилактики инфекционной бурсальной болезни кур как в благополучных, так и в неблагополучных птицехозяйствах.

Известные вирус-вакцины из штаммов БГ производства ВНИИЗЖ, Д-78 производства фирмы Интервет Голландия, Бюр-706 производства фирмы Рон-Мерье (Франция) относятся к вирус-вакцинам, приготовленным из средних штаммов, и они оказываются малоэффективными, иммунный ответ при их использовании недостаточен для удержания высококонтагиозных полевых штаммов ИББ.

Появление высоковирулентных штаммов вируса ИББ, обусловливающего вспышки заболевания в условиях неоднократного применения живых вакцин, послужило основанием для поиска новых штаммов.

Проблема заключается в том, что в зонах распространения высокопатогенного вируса заражение им птиц происходит до того, как применяющиеся умеренно иммуногенные вакцинные штаммы могут преодолеть барьер материнских антител.

Поэтому разработанная вирус-вакцина из более реактогенного штамма «СТ» представляет определенный интерес в профилактике ИББ.

Цель изобретения - вирус-вакцина из штамма «СТ» эффективна при вакцинации цыплят с высоким уровнем материнских антител.

Эта цель достигается рядом последовательных мероприятий, первое из которых определение биологической активности вируса ИББ на уровне разных пассажей на СПФ куриных эмбрионах.

Пассирование на СПФ-эмбрионах кур проводили до 10 пассажей, Заражение СПФ-эмбрионов на хао показало, что изучаемые штаммы, из которых «52/70» и «27/94» являются эталонным и эпизоотическим, а штамм «СТ» для производства вируса вакцины, являются патогенными для 10-суточных СПФ-эмбрионов. Характерна 80-100% гибель эмбрионов на 3-6 сутки после заражения их эталонным и вакцинным штаммом в разведении 1:10.

Результаты исследований биологической активности штаммов вируса ИББ на уровне разных пассажей на СПФ-эмбрионах кур приведены в таблице 1.

Таблица 1
Биологическая активность вируса ИББ на уровне разных пассажей на КЭ (lg ЭИД₅₀/ мл)№ШтаммыНомер пассажа123456789101«52/70»4,52±0,145,0±0,205,47±0,246,00± 0,296,00±0,315,93±0,316,07±0,306,02±0,236,00±0,225,97±0,232«СТ»3,98±0,214,00±0,194,42±0,354,49±0,285,55± 0,275,50±0,35,50±0,395,43±0,375,39± 0,415,5± 0,233«27/94»2,97±0,193,00±0,183,50±0,234,00±0,364,50±0,115,00±0,195,5±0,165,40±0,415,50±0,165,47±0,31

Данные, представленные в таблице, показали что по мере увеличения числа пассажей вируса на эмбрионах повышается его титр, что связано с адаптацией его к данной системе. Однако биологическая активность вируса колебалась в зависимости от исследуемого штамма и количества проведенных пассажей.

Максимальное накопление вируса (штамма «52/70» и «СТ») было на 5-том пассаже соответственно 10^6,5 и 10^5,5 ЭИД₅₀/мл.

В целях определения чувствительности клеточных культур к изучаемым штаммам вируса ИББ пассировали их в первичной культуре ФЭК и ПЭК и в перевиваемых клетках типа VERO и ВСМ-70 с применением сред и сывороток отечественного производства.

Исходным материалом для заражения культуры клеток служила недостаточная жидкость гомогената зародышей СПФ-эмбрионов, зараженных каждым из исследуемых штаммов.

При этом установлено, что штаммы («52/70», «СТ» и «27/94») вируса ИББ во всех 5 пассажах в культуре ФЭК и ПЭК размножались с выраженным цитопатическим эффектом и накапливались в высоких титрах. Однако они значительно различались по способности размножаться в первичных перевиваемых культурах клеток.

В результате 5 последовательных пассажей на ФЭК и ПЭК наблюдали адаптацию штаммов. В культуре VERO и ВСМ-70, хотя титр вируса от пассажа к пассажу и увеличивался, он не достигал уровня, установленного в культуре ФЭК и ПЭК.

Штаммовые различия имели место также и при репродукции их в культуре ФЭК и ПЭК. Наиболее максимальные титры вируса выявлены в культуре ФЭК и ПЭК и составили 6,68 и 5,98 ТЦД₅₀/мл соответственно.

Таблица 2.

Результаты исследования внутриклеточного и внеклеточного накопления вируса «СТ» в культуре ФЭК при множественности заражения 0,01 ТЦД₅₀ на клетку показали, что размножение вируса ИББ в клетках начинается через 4 ч после заражения. Количество вируса постоянно нарастает и к 12 часам составляет 5.5 ТЦД₅₀/мл, но в дальнейшем повышение клеточно-связанного вируса не наблюдался, и активность его сохранилась примерно на одинаковом уровне, несколько снижаясь к 48 ч.

В культуральной жидкости вирус был установлен спустя 2 ч после начала его активной репродукции в клетках; количество вируса постепенно нарастало, и через 16 часов его активность была на уровне внутриклеточного вируса.

Таблица 2
Биологическая активность штаммов вируса ИББ в различных клеточных культурах№Штамм вирусаТитр вируса (lg ТЦД₅₀/мл)ФЭКПЭКVEROВ G M - 70123451234512345123451«СТ»5,00±0,275,18±0,006,02 ±0,226,32±0,126,68±0,113,98 ±0,234,40 ±0,124,96±0,185,60±0,185,98±0,152,00±0,452,6±0,083,02±0,164,00±0,144,00±0,122,00±0,311,98±0,182,52 ±0,113,00±0,083,98±0,232«52/70»3,00±0,063,00±0,173,44±0,123,98±0,194,04±0,202,00±0,182,54±0,182,50±0,103,00±0,254,96±0,202,06±0,262,02±0,102,00±0,153,00±0,143,00±0,192,50±0,142,42 ±0,162,46±0,103,00±0,233,00±0,183«27/94»2,00 ±0,301,95 ±0,112,50 ±0,132,54±0,053,00±0,142,00±0,302,50±0,122,50±0,183,00±0,093,00±0,172,00±0,152,51±0,102,52±0,213,00±0,363,00 ±0,202,00±0,172,50±0,132,52 ±0,113,00 ±0,113,50±0,14

Однако даже на 4 сутки, когда на все клетки распространилось цитопатогенное действие вируса, содержание его. в культурной жидкости оказалось больше, чем в клеточной взвеси.

Известно, что в некоторых культурах клеток вирус ИББ вызывает образование бляшек под средой, содержащей агарозу.

Для определения оптимальных условий получения бляшек под агаром в культурах, зараженных вирусом ИББ, использовали агар Дифко, а также дополнительные компоненты: аминопептид и химопепсин.

Результаты показали, что при заражении куринных фибробластов вирусом ИББ образовались бляшки размером 0,5-3 мм.

Они обычно появлялись на 3-4 сутки после заражения культуры.

При изучении популяций вируса ИББ была выявлена ее неоднородность по признаку размера бляшек. Частота распределения бляшек различного диаметра были такова, что приблизительно 70% составляли бляшки диаметром 0,5-1,5 мм и около 30% диаметром 3 мм, то есть вирусная популяция имела в основном мелкобляшечную характеристику.

В связи с этим для определения кореляции между размером бляшек вируса образуемых под агаровым покрытием и патогенностью его для цыплят провели клонирование вариантов вируса ИББ, образующих крупные и мелкие бляшки под агаром.

Бляшки диаметром 1±0,5 мм считали мелкими и обозначали S^-. Бляшки диаметром 2,5±0,5 мм считали крупными и обозначали S⁺.

Было изучено по 6 клонов каждого варианта вируса в процессе 5 пассажей.

Клон считали однородным, если пассируемый вариант вируса индуцировал образование только крупных или мелких бляшек.

Результаты проверки патогенности вариантов культурального вируса ИББ в сравнении с патогенным штаммом «27/94» на чувствительных цыплятах приведены в таблице 3.

Таблица 3
Патогенность для СПФ - цыплят эпизоотического штамма «27/94» и двух вариантов штамма «СТ» в культур ФЭК№ПоказателиПроцент поражения цыплят, зараженных разными штаммами вирусаконтрольная«27/94»шт. «СТ» S^-шт. «СТ» S⁺1Гибель-2--2Клиника-80--3Патанатомия-100-104Патоморфология клоакальной сумки-100-60

Из таблицы видно, что крупнобляшечные варианты, как правило, вызывают поражения клоакальной сумки, которые выявляются при вскрытии зараженных цыплят в 10% случаях и около 60% случаев при гистологическом исследовании. Варианты вируса ИББ, образующие мелкие бляшки, оказались апатогенными для СПФ цыплят, и в дальнейшем использовались для приготовления вирус-вакцины против ИББ.

В дальнейшем вакцинный штамм «СТ» прошел контроль на стерильность, контаминацию микоплазмами, гемаглютинирующими и другими вирусами, определение генетической однородности и контроль на реверсибельность, а также стабильность всех его свойств при длительном культивировании, хранении и транспортировании.

Реактогенные и иммуногенные свойства штамма «СТ» изучали на СПФ-цыплятах 14-дневного возраста, которым перорально вводили нативный вирус (5-го пассажа в культуре ФЭК) в дозах 10^4,0-10^5,0 ТЦД₅₀/мл.

Через 14 дней после иммунизации всем цыплятам опытной и контрольной групп ввели вирулентный штамм «52/70» в дозе 100 ИД₅₀/мл.

Результаты исследований показали,что штамм «СТ» вируса ИББ в дозах 10^4,0-10^5,0 не вызывал поствакцинальных осложнений у СПФ цыплят в течение 14 дней.

Все цыплята, привитые штаммом «СТ», были устойчивы к контрольному заражению, тогда как невакцинированные - переболели с характерной клиникой заболевания и 3 цыпленка пали на 4 сутки после контрольного заражения.

На вскрытии у павших цыплят наблюдали кровоизлияния в грудных мышцах.

Клоакальные сумки были увеличены и на разрезе наблюдали множество точечных кровоизлияний. Результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4
Реактогенные и иммуногенные свойства штамма «СТ» вируса ИББ№ГруппаДоза прививки ТЦД₅₀Количество цыплят в гр.Реакция на прививкуРезультаты контрольного заражениязаболелопало% защиты1Опытная10/420нет--1002Опытная10/520нет--1003Контрольная-20-203-

Известно, что пассирование вируса в культуре клеток может привести к снижению или полной потерей его иммуногенных свойств. Поэтому для определения стабильности иммуногенных свойств при длительном культивировании штамм «СТ» последовательно пассировали в культуре ФЭК. Вирус на уровне 5-, 10-, 15-, и 20-го пассажа проверили на инфекционную и иммуногенную активность.

Биологическую и иммуногенную активность штамма «СТ» различных пассажей определяли в двух повторностях (п=2).

Таблица 5
Биологическая и иммуногенная активность штамма «СТ» вируса на уровне разных пассажей в культуре ФЭК№Активность вирусаНомер пассажаМ±Т51015201Биологическая (lg)(ТЦД₅₀/мл)5,86,056,26,16,04±0,032Иммуногенная.(ИмД₅₀/мл)5,75,75,65,55,6±0,12

Данные, приведенные в таблице 5, показывают, что штамм «СТ» вируса ИББ сохраняет биологическую и иммуногенную активность в течение 20 последовательных пассажей в культуре ФЭК.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что штамм «СТ» является ареактогенными для СПФ-цыплят, обладает выраженной иммуногенной активностью и стабилен при пассировании в культуре клеток.

С учетом вышеизложенного нами была проведена работа по изготовлению экспериментальной серии вакцин из штамма «СТ», ее контролю и испытанию в лабораторных и производственных условиях.

Лабораторные испытания проведены в соответствии с рабочей программой, утвержденной директором ВНИНИП, которые полностью подтвердили высокую иммуногенность и безвредность вакцины из штамма «СТ».

В экспериментальных условиях нами была установлена безопасность и высокая иммуногенная активность вирус-вакцины против инфекционной бурсальной болезни. Это послужило основанием для испытания вакцины из «СТ» в производственных условиях на птицефабрике «Рязанская» Рязанской области (см., например, Сборник научных трудов, Владикавказ, ООО АНВШ РФ, №1(11), с.81-82).

Лабораторными исследованиями были исключены известные вирусные и бактериальные инфекции птиц, а также установлена доброкачественность кормовых компонентов, включаемых в рацион цыплят бройлеров.

В хозяйстве проводят профилактику ньюкаслской болезни по схеме благополучного хозяйства с применением вакцины из штамма ЛА-СОТА.

В суточном возрасте цыплят вакцинируют против болезни Марека. На основании эпизоотических, клинических, патолого-анатомических данных и лабораторных исследований, проведенных в отделе вирусологии ВНИВИП, был поставлен диагноз - инфекционная бурсальная болезнь. В связи с этим хозяйству было предложено применение экспериментальный вирус-вакцины против ИББ.

Перед вакцинацией были исследованы сыворотки крови у цыплят на наличие у них пассивного иммунитета. Серологические показатели исследованных сывороток крови от цыплят перед вакцинацией представлены в таблице 6.

Таблица 6
Результаты исследования сыворотки крови у цыплят до вакцинации по данным РДП И РНВозраст цыплят (сут.)Количество пробКоличество положительных пробСредний геометрический титр вируснейтрализующих антител log 2РДП%Вируснейтрализующие антитела log201234567891011010100   12221 2 5,8310880   222 111 5,0510540 1 34  11  3,8710220212211 1   2,010100032131      1,715100041111      1,021100042222      1,2301000010         1,0

Из данных таблицы 6 видно, что до 7-суточного возраста у цыплят установлен достаточно высокий уровень пассивных антител к вирусу ИББ.

Вируснейтрализующие антитела выявляли у них в титре 5,8 log 2. При этом у отдельных цыплят титр антител составлял 7,0 log 2.

Снижение титра вируснейтрализующих антител до 1,7 наблюдали к 15 дню их выращивания, у цыплят в 21-дневном возрасте специфические антитела обнаруживали в разведении 1:2-1:16. У цыплят 30-суточного возраста антител не обнаруживали.

На птицефабрике испытание вирус-вакцины из штамма «СТ» проводилось с одновременным применением (для сравнения эффективности) импортной вакцины из штамма «П-2» (Германия).

Для проведения предварительных испытаний были созданы три группы бройлеров. Опыты проведены на 64381 цыпленке.

Цыплят первой группы в количестве 22951 голов вакцинировали двукратно в 14- и 21-дневном возрасте вирус-вакциной из штамма «СТ» (зал №3). Цыплят второй группы в количестве 21430 голов вакцинировали двукратно в 15- и 25-дневном возрасте вакциной производства - Германия (зал №2). Третья группа в количестве 20000 цыплят служила в качестве контроля (зал №4).

Вирус-вакцину из штамма «СТ» выпаивали в дозе 10^3,5 ТЦД₅₀ в 10 мл воды из стеклянных поилок емкостью 3 л. Перед вакцинацией поилки тщательно мыли.

Вакцину П-2 применяли согласно наставлению.

Поствакцинальных осложнений среди цыплят обеих групп после прививки не наблюдалось.

Условия кормления и содержания во всех группах цыплят были одинаковыми. Продолжительность откорма цыплят-бройлеров согласно существующей технологии на птицефабрике составила 57 суток.

За период выращивания в первой группе пало 826 цыплят, что составило 3,6%, во второй группе - 1307 цыплят или 6,1%, в третьей группе 1400 цыплят или 7%. Средняя масса одной головы при убое в первой группе составила 1676 г, во второй - 1621 г, а в контрольной - 1610 г.

Показатели среднесуточного привеса соответственно по 1, 2, 3 группам составили - 34,2, 32,1, и 31,3 г.

Из приведенных данных следует, что сохранность птицы, вакцинированной отечественной вакциной из штамма «СТ», была выше на 3,4% по сравнению с контролем и 2,5% по сравнению с сохранностью цыплят, привитых вакциной производства - Германия.

Таким образом, производственные испытания опытных серий вирус-вакцины против инфекционной бурсальной болезни из штамма «СТ» показали ее безвредность и экономическую эффективность.

Изобретение относится к области микробиологии. Способ включает вакцинацию цыплят вакциной из вируссодержащего материала авирулентного штамма вируса бурсальной болезни кур. При этом используют вируссодержащий материал из мелкобляшечного штамма "СТ" вируса бурсальной болезни кур. Вакцинацию цыплят осуществляют двукратно в 14- и 21-дневном возрасте. Вакцину вводят перорально в дозе 10^3,5 ТЦД₅₀ в 10 мл воды. Способ обладает высокой эффективностью, позволяет создать у цыплят напряженный иммунитет, увеличить среднесуточный привес цыплят и повысить их сохранность. 6 табл.

Способ профилактики инфекционной бурсальной болезни кур, включающий вакцинацию цыплят вакциной из вируссодержащего материала авирулентного штамма вируса бурсальной болезни кур, отличающийся тем, что вакцинацию цыплят осуществляют двукратно в 14- и 21-дневном возрасте вакциной, включающей вируссодержащий материал из мелкобляшечного штамма "СТ" вируса бурсальной болезни кур, которую вводят перорально в дозе 10^3,5 ТЦД₅₀ в 10 мл воды.