СПОСОБ НЕИНВАЗИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ СТЕПЕНИ ВЫРАЖЕННОСТИ ФИБРОЗА ПЕЧЕНИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/49 G01N33/52 G01N33/86 

Изобретение применяется в медицине, а именно в клинике внутренних болезней (гастроэнтерологии).

Определение экспрессии фиброза у пациентов с хроническим вирусным гепатитом является важной задачей, так как быстрое прогрессирование фиброза приводит к развитию цирроза или рака печени у одной трети больных в течение 20 лет [1, 2]. С другой стороны, определение степени выраженности фиброза (стадии гепатита) является важным моментом для определения показаний к проведению противовирусной терапии.

Определение прогрессирования фиброза печени возможно без проведения пункционной биопсии - на основе клинических и ультрасонографических параметров [3, 4].

Однако четких предикторов, указывающих на ту или иную степень фиброза по сравнению с гистологическими результатами, полученными путем пункционной биопсии печени, в настоящее время нет. Так, по данным S.A.Coverdale и G.Borroni [2, 5], выявляется незначительная корреляция между рутинными печеночными биохимическими и ультрасонографическими тестами и фибротической стадией хронического гепатита. К.Mattiello и М.Penz [3, 4] при использовании этих данных выявили достаточную корреляцию для определения стадии фиброза. С быстрым развитием фиброза ассоциируются мужской пол, длительность заболевания, 1 генотип вируса, полиморфизм гена V фактора свертывания, Р-селектин [6].

Содержание тромбоцитов в периферической крови [7, 8, 9] в комбинации с возрастом может быть предиктором развития значительных гистологических изменений при хроническом вирусном гепатите [10]. Согласно данным S.A.Coverdale [2], клиренс антипирина и уровень тромбоцитов для детекции фибротической прогрессии вирусного гепатита являются более чувствительными, чем альбумин и другие биохимические тесты. По мнению G.Borroni [5] из 3 клинических и 6 биохимических факторов уровень тромбоцитов и концентрация иммуноглобулинов значительно и независимо коррелировали с наличием цирроза при хронической патологии печени с инфицированием вирусом гепатита С, причем уровень тромбоцитов менее 134×10⁹/л имел 100% специфичность.

Исходя из изложенного выше следует охарактеризовать взаимосвязь между уровнем тромбоцитов и структурными изменениями в печени и обозначить роль тромбоцитов в прогрессировании хронических вирусных заболеваний печени.

Под влиянием липополисахарида, интерлейкина-1, фактора некроза опухоли-α тромбоциты проникают через печеночные синусоидальные пространства и контактируют с гепатоцитами [11], что приводит к их активации, высвобождению АТФ и АДФ [12]. Активация тромбоцитов является потенциальным триггером ремоделирования печеночной ткани при хроническом вирусном гепатите [13]: выделяемые в избыточных количествах из ос-гранул тромбоцитарный фактор роста [14], трансформирующий фактор роста β и тромбин стимулируют пролиферацию фибробластов и развитие фиброза печени, нарушение архитектоники печени даже после прекращения воздействия инициирующего фактора [15, 16, 17, 18, 19]. Таким образом, имеется отчетливая связь между процессами воспаления и коллагенообразования в печени и функциональной активностью тромбоцитов.

Однако снижение уровня тромбоцитов в периферической крови при хронической вирусной патологии печени может быть связано не только с фиброзом печени, но и обусловливаться прямым влиянием вирусов на тромбоцитопоэз, снижением уровня матричной РНК тромбопоэтина, низкой его продукцией печеночной тканью, повышением уровня антитромбоцитарных IgG. Поэтому для более точной оценки степени фиброза на основе критерия тромбоцитов необходимо использовать показатели их функциональной активности, включая продукты реакции высвобождения компонентов α-гранул.

Достоверным методом определения степени фиброза печени (стадии гепатита) является гистологический метод исследования печени, полученной путем пункционной биопсии печени, выполняемой чрескожным или лапароскопическим путем [1].

Применяемый метод имеет многочисленные недостатки:

1. Инвазивность процедуры, что снижает комплаентность больного.

2. Необходимость проведения ультрасонографического исследования перед процедурой для исключения очаговых образований печени.

3. Многочисленные противопоказания к проведению пункционной биопсии печени: очаговые образования (кисты, гемангиомы), снижение уровня тромбоцитов в периферической крови, увеличение длительности кровотечения, времени свертывания, снижение протромбиновой активности и др.

4. Необходимость пребывания пациента в стационаре в течение суток после проведения процедуры.

5. Осложнения биопсии: абдоминальные и торакальные кровотечения, пневмоторакс, ранения желчного пузыря и протоков, кист, перитонит.

6. Невозможность частого проведения процедуры для динамической оценки выраженности фиброза.

7. Необходимость наличия у врача сертификата (хирургической специализации) на проведение исследования врачом терапевтического (гастроэнтерологического) отделения.

При этом лапароскопическая биопсия фактически приравнивается к малому оперативному вмешательству на органах брюшной полости.

Поставлена задача неинвазивной диагностики степени выраженности фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом.

Поставленная задача достигается определением показателей спонтанной и индуцированной (адреналином, коллагеном) агрегации тромбоцитов и активности тромбоцитоспецифических пептидов (β-тромбоглобулина, тромбоцитарного фактора 4) в плазме.

Способ осуществляется следующим образом.

Критерием включения является наличие доказанного хронического вирусного гепатита. Для определения фиброза используются показатели индуцированной агрегации тромбоцитов (индукторы: адреналин, коллаген), уровень спонтанной агрегации тромбоцитов, активность тромбоцитоспецифических пептидов в плазме (β-тромбоглобулин, тромбоцитарный фактор 4). Критериями исключения являются сопутствующая патология (острые или хронические заболевания в стадии обострения), прием лекарственных препаратов в течение 7 дней до проведения исследования.

Забор крови производят из кубитальной вены в утренние часы, натощак, иглой с широким просветом без наложения жгута и массажа предплечья с дальнейшим использованием цитратной плазмы богатой или бедной (в зависимости от определяемого параметра) тромбоцитами. Агрегация тромбоцитов регистрируется на агрегометре АР2110 («СОЛАР», Беларусь), сопряженном с IBM-совместимым компьютером. Для исключения контактной активации тромбоцитов используется только пластмассовая посуда. Спонтанную агрегацию тромбоцитов регистрируют с момента начала перемешивания богатой тромбоцитами плазмы (без индуктора) в течение 10 минут с определением максимальной степени агрегации. В норме спонтанная агрегация составляет 0,67±0,07%. Индуцированную агрегацию изучают путем добавления индукторов к богатой тромбоцитами плазме: адреналин (5 мкМ/мл, «А.О.Гедеон Рихтер», Венгрия), коллаген (0,2 мг/мл, «НПО Ренам», Россия) в указанных конечных концентрациях в системе теста с оценкой максимального уровня агрегации в %, который у здоровых равен 64,70±1,94% и 60,01±1,35% соответственно.

Активность β-тромбоглобулина в плазме определяют с помощью стандартных тест-наборов фирмы «Roche» методом ИФА. Кровь (4,5 мл) помещают в пластиковые пробирки с добавлением 0,5 мл 3,8% раствора трехзамещенного цитрата натрия, 2 мг/мл теофиллина и дипиридамола, центрифугируют 30 минут (4000 об/мин, 4°С), плазму отбирают и хранят при температуре -25°С. Метод определения активности 4 тромбоцитарного фактора основан на учете действия безтромбоцитарной прогретой плазмы, содержащей термостабильный фактор 4, на тромбин-гепариновое время свертывания контрольной безтромбоцитарной плазмы. Степень укорочения тромбин-гепаринового времени свертывания служит критерием активности 4 фактора. У здоровых людей плазменный уровень β-тромбоглобулина составляет 146,12±8,13 IU/мл, активность 4 тромбоцитарного фактора - 3,02±0,67 с. Данные агрегации тромбоцитов и активности тромбоцитоспецифических пептидов у здоровых лиц, а также больных представлены в таблице 1. Определение показателей функциональной активности тромбоцитов с целью последующей оценки фиброза проводилась с учетом результатов гистологического исследования ткани печени, полученной путем пункционной биопсии.

Таблица 1ПоказателиЗдоровыеБольныеиндекс фиброза0-1 балл2-3 балла4 баллаАдреналиновая n=32n=13n=30n=10 агрегация64,70±1,9476,92±2,9240,35±4,4320,261±5,95тромбоцитов (%) **/***/**/***Коллагеновая n=32 n=13n=30n=10агрегация60,01±1,3573,68±2,1243,58±3,5417,92±6,66тромбоцитов (%) **/***/**/***Спонтанная n=10 n=17n=21n=6агрегация0,67±0,071,64±0,252,30±0,171,18±0,21тромбоцитов (%) **/*****β-тромбоглобулинn=10 n=17n=21n=6(IU/мл)146,12±8,13176,82±6,91206,10±7,68168,22±6,04  **/*****Тромбоцитарныйn=10n=17n=21n=6фактор 4(сек)3,02±0,575,16±0,657,30±0,514,45±0,35  **/*****Примечание, n - количество пациентов. * - р<0,05 по сравнению с контролем, ** - р<0,05 по сравнению с минимальным фиброзом, *** - р<0,05 по сравнению с умеренным фиброзом.

Хронический вирусный гепатит с минимальными проявлениями фиброза по Десмету (0-1 балл) характеризуется повышением (по сравнению с контролем) показателей спонтанной агрегации тромбоцитов, индуцированной адреналином и коллагеном агрегации тромбоцитов, уровней β-тромбоглобулина и тромбоцитарного фактора 4. Однонаправленные изменения в сторону повышения значений функциональной активности тромбоцитов служат отличием хронического вирусного гепатита с минимальными проявлениями фиброза от хронического вирусного гепатита с умеренным и тяжелым фиброзом. При этом абсолютные значения данных параметров следующие:

- адреналиновая агрегация тромбоцитов >76%,

- коллагеновая агрегация тромбоцитов >68%,

- спонтанная агрегация тромбоцитов >0,9%,

- β-тромбоглобулин >170 IU/мл,

- 4 тромбоцитарный фактор >4,7 сек.

Хронический вирусный гепатит с умеренным и тяжелым фиброзом печени (2-3 балла) характеризуется снижением индуцированной адреналином и коллагеном агрегации тромбоцитов, в противоположность повышению (как при минимальном фиброзе) показателей спонтанной агрегации тромбоцитов, β-тромбоглобулина и тромбоцитарного фактора 4. При этом абсолютные значения спонтанной агрегации тромбоцитов, уровня β-тромбоглобулина и активности тромбоцитарного фактора 4 превышают соответствующие показатели у больных хроническим вирусным гепатитом с минимальным фиброзом. Показатели функциональной активности тромбоцитов следующие:

- адреналиновая агрегация тромбоцитов 54-16%,

- коллагеновая агрегация тромбоцитов 52-24%,

- спонтанная агрегация тромбоцитов >2,6%,

- β-тромбоглобулин >204 IU/мл,

- 4 тромбоцитарный фактор >7,8 сек.

Индекс фиброза 4 балла (наличие цирроза печени как минимум класса А по Child-Pugh) (помимо клинико-инструментальных признаков портальной гипертензии) характеризуется максимальным (по сравнению с индексом фиброза 2-3) ингибированием индуцированной адреналином и коллагеном агрегации тромбоцитов, уровнем β-тромбоглобулина в пределах нормы или слегка увеличенным, повышением тромбоцитарного фактора 4 и увеличением спонтанной агрегации тромбоцитов. При этом абсолютные значения данных параметров следующие:

- адреналиновая агрегация тромбоцитов <16%,

- коллагеновая агрегация тромбоцитов <24%,

- спонтанная агрегация тромбоцитов 0,9-1,5%,

- β-тромбоглобулин в пределах нормы или слегка увеличен,

- 4 тромбоцитарный фактор 4,7-5,2 сек.

В таблице 2 приведены показатели функциональной активности тромбоцитов для оценки выраженности фиброза печени.

Таблица 2  БольныеПоказателиЗдоровыеиндекс фиброза  0-1 балл2-3 балла4 баллаАдреналиновая       агрегация54-76%>76%↑54%-16%↑<16%↑тромбоцитов       Коллагеновая       агрегация52-68%>68%↑52%-24%↓<24%↓тромбоцитов       Спонтанная       агрегация0,5-0,9%>0,9%↑>2,6%↑0,9-1,5%↑тромбоцитов             170-182 IU/млNβ-122-170>170↑>204↑или в пределахилитромбоглобулинIU/млIU/мл IU/мл нормы↑Тромбоцитарный1,3-4,7>4,7↑>7,8 сек↑4,7-5,2 сек↑фактор 4сексек     Примечание: ↑ - повышение по сравнению с нормой, ↓ - снижение по сравнению с нормой, N - в пределах нормы.

Выработанные неинвазивные диагностические критерии тяжести фиброза в равной мере информативны для любых этиологических форм вирусного заболевания печени (В, С, В+С, В+Д).

Клинический пример

Больной А., 27 лет. История болезни №71. Находился в гастроэнтерологическом отделении краевой клинической больницы с 04.01.01 по 18.01.01 г. Диагноз: хронический вирусный гепатит С (aHCV +, RNA HCV +) с умеренной степенью активности. Сопутствующий диагноз: серологические признаки перенесенной HBV-инфекции.

Жалобы на общую слабость, снижение работоспособности. Считает себя больным с 1999 года, когда перенес острый вирусный гепатит В+С (HBs Ag +, aHCV +). В сентябре 2000 года стала беспокоить общая слабость. При обследовании обнаружено трехкратное повышение уровня трансаминаз. Из анамнеза: тонзиллэктомия в 7 лет. Употребление наркотиков с 1998 по 2000 год.

Объективно: кожные покровы, склеры обычной окраски. Легкие и сердце без особенностей. АД - 125/80 мм рт. ст., пульс 64 в 1 минуту. Размеры печени по Курлову: 10×9×8 см. Печень мягко-эластической консистенции, безболезненная, гладкая, нижний край выступает из-под реберной дуги на 1,5 см. Селезенка не пальпируется.

Общий анализ крови: эр. 4,2×l0¹²/л; Нв 142 г/л; тромб. 210×10⁹/л; лейк. 4,2×10⁹/л; э. 2%; п. 2%; с. 62%; лимф. 28%; мон. 4%; СОЭ 6 мм/ч.

Общий анализ мочи: отн. плотность 1,019; без отклонений от нормы; диастаза мочи 128 ед,

Биохимические исследования. Общий белок 72 г/л; альбумины 44%; глобулины: α 20%; β 17%; γ 19%. Глюкоза крови 4,1 ммоль/л. Билирубин: общий 13,76 мкмоль/л. АсАТ 44 ед/л; АлАТ 126 ед/л; ЛДГ 254 ед/л; ГГТ 21 ед/л; ЩФ 169 ед/л. Тимоловая проба 7,7 ед; ЦИК 180 УЕ; Церулоплазмин 41,7 мг/дл; холестерин 4,5 мкмоль/л. Коагулограмма: ПТИ 87%; время свертывания 5 мин 43 с; длительность кровотечения 40 с.

Маркеры гепатита: HBs Ag (-); aHBs (+); HBe Ag (-); aHBe (+); aHBc Ig M (-); aHBc сумм. (+); aHCV (+); HCV-PHK (+).

УЗИ. Печень: правая доля 108 мм, левая доля 79 мм, эхогенность обычная, ткань однородная. Внутрипеченочные протоки не расширены. Воротная вена 10 мм, селезеночная 5 мм, холедох 5 мм. Желчный пузырь 71×13 мм, толщина стенки 3 мм. Поджелудочная железа: головка 22 мм, тело 15 мм, хвост 23 мм, эхогенность повышена. Селезенка 127×52 мм.

Биопсия печени. Дольковое строение сохранено. Портальные тракты неравномерно расширены за счет выраженной лимфомакрофагальной инфильтрации с образованием лимфоидных фолликулов. Отмечается пролиферация желчных протоков, значительная очаговая пролиферация купферовских клеток. Лобулярный компонент и в виде цепочек, и на территории 3-4 гепатоцитов. Фиброз стромы стенок всех центральных вен и стромы долек в 3 зоне. Гидропическая дистрофия гепатоцитов. Заключение: хронический гепатит с умеренной степенью активности. Индекс Кноделя 7 баллов. Индекс Десмета 1 балл.

Исследуемые показатели: индуцированная адреналиновая и коллагеновая агрегация тромбоцитов 78,6%, 70,0% соответственно, спонтанная агрегация тромбоцитов 1,49%, содержание β-тромбоглобулина 172,2 IU/мл, активность 4 тромбоцитарного фактора 4,88 с. Как видно из примера, у больного с минимальной степенью фиброза определяются повышенные показатели спонтанной и индуцированной агрегации тромбоцитов и показателей тромбоцитоспецифических пептидов.

Использование предлагаемого способа оценки степени фиброза печени позволяет не прибегать к пункционной биопсии печени. Исследование безопасно для пациента, отсутствует необходимость в инвазивных вмешательствах, доступно для практических учреждений здравоохранения, не трудоемко.

Источники информации:

1. Шерлок Ш., Дули Дж. Заболевания печени и желчевыводящих путей. - М., 1999. - 864 с.

2. Coverdale S.A., Samarasinghe D.A., Lin R., Kench J., Byth K., Khan M.H., Crewe E., Liddle C., George J., Farrell G.C. Changes in antipyrine clearance and platelet count, but not conventional liver tests, correlate with fibrotic change in chronic hepatitis C: value for predicting fibrotic progression // Am. J. Gastroenterol., 2003. - Vol.98 (6).- P.1384-1390.

3. Mattiello К., Favaro A., Bemardinello E., Cavaletto L., Mezzocolli I., Luise S., De Carlo S., Sacerdoti D., Gatta A., Chemello L. Non-invasive diagnosis of liver fibrosis progression by clinical and usdoppler predictive model during chronic HCV infection // J. Hepatol. - 2003. - Vol. 38, Suppl. 2. - P.155.

4. Penz M., Oesterreicher C., Wrba F., Datz C., Gschwandtler M., Hofer H., Novacek G., Gangl.A., Ferenci P. Routine serum laboratory parameters for the staging of fibrosis in patients with chronic hepatitis С // J. Hepatol. - 2003. - Vol.38, Suppl. 2. - P.163.

5. Borroni G., Ceriani R., Tommasini M.A., Maltempo C., Fellini C., Contu L., Cazzaniga M. Platelet count: a simple marker of liver cirrhosis in chronic hepatitis C (CHC) infection // J. Hepatol. - 2002. - Vol.36, Suppl. 1. - P.47.

6. Wright M., Goldin R., Thursz M. Construction of a predictive model to identify rapid fibrosis progression in patients with chronic hepatitis C virus infection // J. Hepatol. - 2003. - Vol.38, Suppl. 2. - P.17.

7. Ceriani R., Borroni G., Tommasini M.A. et al. Platelet count and AST/ALT ratio can predict liver cirrhosis in chronic HCV infection // Hepatology Rapid Literature Rewiew. - March 1999. - P/C02/17.

8. Fasoli A., Romagnoli P., Botta F. et al. Platelets/spleen area ratio reflects progressive liver disease // Hepatology Rapid Literature Rewiew. - March, 1999. - P/C 11/13.

9. Renou С., Muller P., Halfon Ph. et al. Relevance of moderate isolated thrombocytopenia as a strong predictive marker of cirrhosis in patient with chronic hepatitis С vims // Hepatology Rapid Literature Rewiew. - March 1999. - P/C02/17.

10. Poynard Т., Bedossa P. Age and platelet count: a simple index for predicting the presence of histological lesions in patients with antibodies to hepatitis С virus. METAVIR and CLINIVIR Cooperative Study Groups // J. Viral Hepat, 1997. - Vol. 4. - P.199-208.

11. Nakamura N., Shibazaki M., Nitta Y., Endo Y. Translocation of platelet into Disse spaces and their entry into hepatocytes in response to lipolysaccharides, interleukin-1 and tumor necrosis factor: the role ofKupffer cells // J. Hepatol. - 1998. - Vol.(6). - P.991-999.

12. Takemura S., Minamiyama Y., Kawada N. et al. Extracellular nucleotides modulate the portal circulation with generation of nitric oxide // Hepatology Research. - 1998. - Vol. 13 (1). - P.29-36.

13. Papatheodoridis G., Papakonstantinou E., Andtioti E., Cholongitas E., Petraki К., Kontopoulou I., Hadziyannis S. Thrombotic risk factors and extent of liver fibrosis in patients with chronic viral hepatitis (CH) // J. Hepatol. - 2002. - Vol.36, Suppl. 1. - P.175.

14. Shiraishi Т., Morimoto S., Koh E. et al. Increased release of platelet-derived growth factor from platelets in chronic liver disease // Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. - 1994. - Vol. 32 (1). - P.5-9.

15. Gressner A.M. Hepatic fibrogenesis: the puzzle of interacting cells, fibrogenic cytokines, regulatory loops and extracellular matrix molecules // Z. Gastroenterol., 1992. Vol. 30, Suppi 1. - P.5-16.

16. Gressner A.M. Cytokines and cellular crosstalk involved in the activation of fat-storing cells J. Hepatol. - 1995. - Vol.22 (2 Suppl). - P.28-36. 17.Gressner A.M., Chunfang G. A cascade-mechanism of fat storing cell activation forms the basis of the fibrogenic reaction of the liver // Verh. Dtsch. Ges. Pathol. - 1995. - Vol. 79. - P.1-14.

18. Mallat A., Gallois C., Tao J.C. et al. Platelet-derived growth factor-BB and thrombin generate positive and negative signals for human hepatic stellate cell proliferation. Role of a prostaglandin/cyclic AMF pathway and cross-talk with endothelin receptors // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273 (42). - P.27300-27305.

19. Pinzani M., Milani S., Herbst H. et al. Expression of platelet-derived growth factor and its receptors in normal human liver and during active hepatic fibrogenesis // Am. J. Pathol. - 1996. - Vol.148 (3). -P.785-800.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинике внутренних болезней. Диагностику степени выраженности фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом осуществляют на основании показателей спонтанной и индуцированной адреналином и коллагеном агрегации тромбоцитов, активности тромбоцитоспецифических пептидов β-тромбоглобулина и тромбоцитарного фактора 4 в плазме. Использование предлагаемого способа позволяет оценить степень фиброза печени при любой этиологической форме вирусного гепатита, не прибегая к пункционной биопсии печени. 2 табл.

Способ диагностики степени выраженности фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом, включающий определение фиброза печени, отличающийся тем, что определяют показатели спонтанной и индуцированной адреналином и коллагеном агрегации тромбоцитов, активности β-тромбоглобулина и тромбоцитарного фактора 4 в плазме и при значениях параметров: адреналиновой агрегации тромбоцитов >76%, коллагеновой агрегации тромбоцитов >68%, спонтанной агрегации тромбоцитов >0,9%, активности β-тромбоглобулина >170 IU/мл, 4 тромбоцитарного фактора >4,7 с - определяют хронический вирусный гепатит с минимальным фиброзом по Десмету (0-1 балл), при значениях параметров: адреналиновой агрегации тромбоцитов 54-16%, коллагеновой агрегации тромбоцитов 52-24%, спонтанной агрегации тромбоцитов >2,6%, активности р-тромбоглобулина >204 IU/мл, 4 тромбоцитарного фактора >7,8 с - определяют хронический вирусный гепатит с умеренным и тяжелым фиброзом по Десмету (2-3 балла), при значениях параметров: адреналиновой агрегации тромбоцитов <16%, коллагеновой агрегации тромбоцитов <24%, спонтанной агрегации тромбоцитов 0,9-1,5%, активности β-тромбоглобулина в пределах нормы 122-170 IU/мл или слегка увеличенной, 4 тромбоцитарного фактора 4,7-5,2 с - определяют фиброз по Десмету 4 балла (наличие цирроза печени как минимум класса А по Child-Pugh).