Способ прогнозирования формирования цирроза печени у пациентов с хроническим гепатитом C Российский патент 2025 года по МПК A61B5/00 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к области гастроэнтерологии и гепатологии, диагностике инфекционных болезней и сопутствующих им патологических состояний организма, и может быть использовано для прогнозирования формирования цирроза печени у пациентов с хроническим гепатитом С.

Вирусный гепатит С распространен повсеместно. По данным ВОЗ в мире примерно 58 миллионов человек болеют хроническим гепатитом С. Каждый год выявляется около 1,5 миллиона, зараженных вирусом гепатита С. По неофициальным данным в РФ это число составляет от 3,5 до 5 млн человек. За 2019 год от гепатита С умерли приблизительно 290000 человек. В РФ хронические вирусные гепатиты являются причиной летальных исходов не менее чем у 20 тыс. человек ежегодно. Основной причиной смерти являются цирроз печени и гепатоцеллюлярная карцинома. Доля смертей от вирусных гепатитов в трудоспособном возрасте составляет почти 70%. По информации ВОЗ число смертей, ассоциированных с вирусными гепатитами, сопоставимо с уровнем смертей от ВИЧ-инфекции [Информационный бюллетень ВОЗ, 2023 г. https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/riepatitis-с]. Хронический гепатит С (ХГС) преобладает в этиологической структуре впервые зарегистрированных случаев хронического вирусного гепатита в Российской Федерации: его доля составляет 78,1% [О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2022 году: государственный доклад. - М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2023. - 368 с.].

Хронический вирусный гепатит С представляет собой важнейшую проблему для практического здравоохранения, т.к. нередко выявляется на стадии цирроза печени и приводит к развитию первичного рака печени - гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). Поэтому крайне важным является своевременное выявление данного заболевания, прогнозирование его исходов и развития осложнений.

К настоящему времени известны различные способы прогнозирования течения хронического гепатита С и диагностики фиброза и цирроза печени, основанные на разных методах исследования.

«Золотым стандартом» диагностики фиброза и цирроза печени у пациентов с хроническим течением вирусных гепатитов традиционно считается чрескожная пункционная биопсия печени, так как именно она дает представление о точной структуре печени, о степени развития в ней воспаления и фиброза, а также играет ключевую роль при проведении дифференциальной диагностики в сложных случаях. При этом, несмотря на то, что эта процедура внедрена в учреждения здравоохранения, она, как и любой инвазивный метод диагностики, сопряжена с риском развития осложнений: по данным литературы, частота развития различных кровотечений (от незначительных до тяжелых внутренних) колеблется от 0% до 10,9%, хотя в подавляющем большинстве случае составляет менее 2% [Laursen, Т.L. Liver-related effects of chronic hepatitis С antiviral treatment / Tea L Laursen et al. // World journal of gastroenterology. - 2020. - vol. 22 (26). - P. 2931-2947; Midia, M., Predictors of bleeding complications following percutaneous image-guided liver biopsy: a scoping review / M. Midia, D. Odedra, A. Shuster, R. Midia, J. Muir // Diagn Interv Radiol. - 2019. -№25(1). P. 71-80; Zhou, K. Assessment of fibrosis in chronic liver diseases / Zhou, Kun, and Lun Gen Lu. // Journal of digestive diseases. 2009. - vol. 10(1). p. 7-14].

Известен способ прогнозирования возможности возникновения цирроза при хроническом вирусном гепатите, включающий проведение пункционной биопсии печени, отличающийся тем, что в биоптате печени определяют продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ): диеновые конъюгаты (ДК); активность антиоксидантных ферментов: каталазы (КАТ) и супероксиддисмутазы (СОД), рассчитывают коэффициент по формуле К=ДК/(СОД⋅КАТ)⋅100, где ДК - содержание диеновых конъюгатов; СОД - активность супероксиддисмутазы; КАТ - активность каталазы, и при его значениях более 65 прогнозируют высокую вероятность возникновения цирроза печени, при 46-65 - умеренную, при 14-45 - низкую, а при значении менее 14 - отсутствие вероятности возникновения цирроза печени [Патент RU 2244306, дата приоритета 26.06.2003, дата публ. 10.01.2005].

Недостатком вышеописанного метода является инвазивность, сопряженная с развитием осложнений и неприятных ощущений у пациента, в связи с этим крайне трудно использовать их для динамического наблюдения. Стоит отметить, что пункционная биопсия печения доступна не во всех лечебных организациях, является дорогостоящим методом, требует подготовки и дальнейшего наблюдения за пациентом, поэтому имеет ограничения для широкого применения.

Кроме того, данные литературы свидетельствуют о том, что около 24-38% биопсий показывают ошибочный результат, что связано с недостаточной длиной забираемого образца, а интерпретация может быть ненадежной, поскольку во многом зависит от исследователя, так как распределение некроза и фиброза в тканях печени не является однородным. В 14,5-26% случаев это может способствовать неверной постановке диагноза [Colling, R. Discrepancy rates in liver biopsy reporting / Colling, Richard et al. // Journal of clinical pathology. 2014. - vol. 67 (9). - p. 825-827; 17) Regev, A. Sampling error and intraobserver variation in liver biopsy in patients with chronic HCV infection / Regev, Arie et al. // The American journal of gastroenterology. 2002. - vol. 97 (10). p. 2614-2618].

С целью решения данной проблемы были предложены полуколичественные балльные системы, например, Knodell [Knodell R.G., Ishak K.G., Black W.C., Chen T.S., Craig R., Kaplowitz N., Kiernan T.W., Wollman J. Formulation and application of a numerical scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis. Hepatology; 1981; 1: 431-435. doi: 10.1002/hep.1840010511], METAVIR [Bedossa P., Poynard T. An algorithm for the grading of activity in chronic hepatitis C. Hepatology. 1996; 24(2): 289-293. doi:10.1002/hep.510240201], Ishak [Ishak K., Baptista A., Bianchi L., Callea F., De Groote J., Gudat F., Denk H., Desmet V., Korb G., MacSween R.N., Phillips M., Portmann B.G., Poulsen H., Scheuer P.J., Schmid M., Thaler H. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol. 1995; 22(6): 696-699. doi:10.1016/0168-8278(95)80226-6], Desmet [Desmet V. Classification of chronic hepatitis: Diagnosis, grading and staging. Hepatology. 1994; 19(6): 1513-1520. doi:10.1016/0270-9139(94)90250-XH]. Однако в них оцениваются только качественные гистопатологические изменения, что также зависит от исследователя и может приводить к ошибкам. В некоторых случаях имеются трудности в сравнении степеней фиброза, определенных по разным шкалам.

Внедряется компьютерный анализ изображений, полученных в процессе микроскопии, что может способствовать повышению диагностической точности пункционной биопсии печени [Watson, A. Liver fibrosis phenotyping and severity scoring by quantitative image analysis of biopsy slides. / Watson, Adam et al. // Liver Int.- 2024.- №44(2). - p. 399-410; Zhou, K. Assessment of fibrosis in chronic liver diseases / Zhou, Kun, and Lun Gen Lu. // Journal of digestive diseases. - 2009. - vol. - 10(1). - p. 7-14].

В связи с этим, разработаны неинвазивные методы оценки состояния воспаления, фиброза и цирроза печени: они включают методы визуализации и исследование серологических маркеров.

Методы визуализации основаны на исследовании жесткости ткани печени, особенностей кровотока, затухании волн различной природы в ней. Используются ультразвуковые методы, КТ и МРТ. Преимуществом методов визуализации является то, что они оценивают истинное морфологическое состояние печени вне зависимости от сопутствующей патологии. Актуальным методом визуализации на текущий момент является транзиторная эластометрия (FibroScan®) [EASL Clinical Practice Guidelines on noninvasive tests for evaluation of liver disease severity and prognosis - 2021 update / European Association for the Study of the Liver // Journal of hepatology. - 2021. - №75 (3). - p. 659-689]. Данные литературы свидетельствуют о высокой информативности FibroScan® в плане определения степени фиброза и цирроза печени, особенно в сочетании с другими методами, в том числе определением серологических маркеров, что позволяет во многих случаях избежать пункционной биопсии печени.

Однако чувствительность этих методов может быть ограничена, а структурные изменения в печени нередко выявляются только в запущенных случаях фиброза и цирроза, так как методы визуализации могут быть неточными на ранних стадиях фиброза. Помимо этого, интерпретация полученных изображений также зависит от исследователя, ультразвуковые исследования сильно зависят от наличия ожирения у пациента, газа в брюшной полости. МРТ ограничено у пациентов с металлоконструкциями в организме; КТ сопровождается воздействием ионизирующего излучения [Imbert-Bismut, F. hitra-laboratory analytical variability of biochemical markers of fibrosis (Fibrotest) and activity (Actitest) and reference ranges in healthy blood donors [Thibaut, V., published correction appears in Clin Chem Lab Med. 2004. - 42(6). p. 681, Thibaut, Vincent [corrected to Thibault, Vincent]]. / Imbert-Bismut. F, Messous D, Thibault V, et al. // Clin Chem Lab Med. - 2004. - 42(3). - p. 323-333.].

Таким образом, методы визуализации и пункционная биопсия печени не обладают прогностическим значением в отношении развития фиброза и цирроза печения, они используются для подтверждения диагноза. Возможность прогнозировать развитие указанных морфологических изменений в печени является преимуществом серологических методов исследования, т.е. определения различных биологических маркеров в крови. Эти методы считаются наиболее безопасными для пациента, они могут использоваться для динамического наблюдения, повторяться неограниченное количество раз. Кроме того, их стоимость дешевле по сравнению с чрескожной пункционной биопсией печени и эластометрией (особенно при широком внедрении). Поэтому эти методы активно используются в лечебных учреждениях во многих странах мира, на фоне чего резко сократилось рутинное использование инвазивных методов оценки фиброза и цирроза.

Для обеспечения средств мониторинга течения заболевания печени и ее реакции на терапию определение стадии фиброза печени должно выполняться неинвазивным и воспроизводимым способом. Тот факт, что процесс фиброгенеза является компонентом нормальной реакции заживления, препятствует разработке биомаркеров, специфичных для конкретного заболевания; вот почему поиск подходящего неинвазивного биомаркера фиброза печени стал одной из значимых проблем в гепатологии.

Прогнозирование степени фиброза и цирроза печени путем определения биомаркеров обосновано тем, что печень является важнейшим метаболическим и синтетическим органом. При хроническом гепатите С эти функции изменяются, что отражается в изменении различных показателей крови. В рутинной клинической практике для оценки функции печени часто используются стандартные параметры крови, такие как альбумин и факторы свертывания крови, однако прогностическая роль их неясна. Более детальные данные можно получить, используя различные факторы, играющие роль в патогенезе фиброза и цирроза.

Стоит учитывать, что изолированное определение одного маркера не имеет диагностической значимости, она появляется только при сочетанном исследовании нескольких маркеров (так называемые «панели маркеров»).

В клинической практике применяются несколько панелей косвенных биомаркеров, прогнозирующих развитие фиброза. Среди неинвазивных методов, получивших наиболее широкую клиническую поддержку, стоит выделить APRI, Индекс Форнса и FibroTest, использующие сывороточные маркеры.

Так, индекс отношения ACT к тромбоцитам (APRI (англ.) - Aspartate aminotransferase to Platelet Ratio Index) рассчитывается по формуле:

(АСТ/верхняя граница нормального диапазона) / количество тромбоцитов (10⁹/л) × 100.

Этот показатель ранее использовался как вспомогательный маркер выраженного фиброза печени у ВИЧ-инфицированных пациентов при ко-инфекции ВГС, а недавно был использован для определения прогрессирующего фиброза у ВИЧ-моноинфицированных пациентов. Однако недавний крупный мета-анализ показал, что APRI может выявлять фиброз, связанный с гепатитом С, лишь с умеренной степенью точности [DallaPiazza, М. Prevalence and risk factors for significant liver fibrosis among HIV-monoinfected patients / DallaPiazza M., Amorosa V.K., Localio R., Kostman J.R., Lo Re V 3rd // BMC Infect Dis. - 2010. -№10; Lin, Z.H. Performance of the aspartate aminotransferase-to-platelet ratio index for the staging of hepatitis C-related fibrosis: an updated meta-analysis / Lin Z.H., Xin Y.N., Dong Q.J., et al. // Hepatology.-2011. -№53(3).-p. 726-736].

Индекс Форнса основан на 4 рутинных клинических показателях: возрасте, количестве тромбоцитов, уровне холестерина и ГГТП. Данный индекс можно использовать для дифференциации легкого (F0-F1) и тяжелого (F2-F4) фиброза, но он менее точен при дифференциации пациентов со степенями фиброза F2 и F4. Индекс Форнса также был валидирован в других группах пациентов в качестве прогностического инструмента для ответа на анти-ВГС терапию [Rossi, Е. Assessing liver fibrosis with serum marker models. / Rossi E., Adams L.A., Bulsara M., Jeffrey G.P. // Clin Biochem Rev. - 2007. - №28(1). - p. 3-10].

Индекс фиброза FIB-4, определяемый на основе числа тромбоцитов, АЛТ, ACT и возраста, был изначально разработан для использования при ко-инфекции ВИЧ и ХГС.

Использование этого индекса позволило правильно классифицировать 87% пациентов со значениями FIB-4 за пределами 1,45-3,25 (значения индекса FIB-4 <1,45 говорят об отсутствии высокого риска фиброза, а значения >3,25 с высокой вероятностью свидетельствуют о выраженном фиброзе) и избежать биопсии в 71% случаев при AUROC 0,765, чувствительности 70% и специфичности 97% для дифференциации индекса Ishak 0-3 от 4-6. Впоследствии эта модель была проверена Vallet-Pichard на большой выборке пациентов с моноинфекцией ВГС, и оказалось, что при использовании этих диапазонов индекса 78% из 847 биопсий были правильно классифицированы (AUROC 0,85 для тяжелого фиброза и 0,91 для цирроза) [Sterling, R.K. Development of a simple noninvasive index to predict significant fibrosis in patients with HIV/HCV coinfection / Sterling R.K., Lissen E., Clumeck N., et al. // Hepatology. - 2006. - №43(6). - p.1317-1325; Vallet-Pichard, A. FIB-4: an inexpensive and accurate marker of fibrosis in HCV infection, comparison with liver biopsy and fibrotest / Vallet-Pichard A., Mallet V., Nalpas B., et al. // Hepatology. - 2007. - №46(1). - p. 32-36].

FibroTest и FibroSure - идентичные тесты, распространяемые под разными наименованиями в Европе и Америке для оценки фиброза и некровоспалительной активности. Показатель FibroTest рассчитывается на сайте разработчика, где вводится возраст, пол пациента и результаты анализов на гаптоглобин, а2-макроглобулин, аполипопротеин А1, ГГТП и билирубин в сыворотке крови. FibroTest позволяет получить оценку, коррелирующую со степенью поражения печени у людей с различными заболеваниями печени. Из-за вариабельности компонентов анализа и анализаторов FibroTest может проводиться только в сертифицированных лабораториях. В недавнем исследовании AUROC составил 0,69 и 0,91 для диагностики значительного фиброза (F>2) и цирроза печени у 74 пациентов, в том числе у 36 с HCV, 10 с HBV и 28 с первичным билиарным циррозом. Чувствительность и специфичность при выявлении первичного тяжелого фиброза с помощью FibroTest составили 75% и 85% соответственно. [Friedrich-Rust, М. Comparison of ELF, FibroTest and FibroScan for the non-invasive assessment of liver fibrosis / Friedrich-Rust M., Rosenberg W., Parkes J, Herrmann E., Zeuzem S., Sarrazin С. // BMC Gastroenterol. - 2010. - №10(103); Imbert-Bismut, F. Intra-laboratory analytical variability of biochemical markers of fibrosis (Fibrotest) and activity (Actitest) and reference ranges in healthy blood donors [Thibaut, V., published correction appears in Clin Chem Lab Med. 2004. - 42(6). - p. 681, Thibaut, Vincent [corrected to Thibault, Vincent]]. / Imbert-Bismut. F., Messous D., Thibault V., et al. // Clin Chem Lab Med. - 2004. - 42(3). - p. 323-333; Koda, M. Fibrolndex, a practical index for predicting significant fibrosis in patients with chronic hepatitis С. / Koda M., Matunaga Y., Kawakami M., Kishimoto Y., Suou T., Murawaki Y. // Hepatology. - 2007. - №45(2). - №297-306; Lu, L.G. Relationship between clinical and pathologic findings in patients with chronic liver diseases / Lu L.G., Zeng M.D., Mao Y.M., et al. // World J Gastroenterol. - 2003. - №9(12). - p. 2796-2800].

Упомянутые выше тесты включают довольно много показателей и требуют значительное время для их оценки.

Известен способ прогнозирования динамики фиброза печени у пациентов с хроническим гепатитом С, не ответивших на лечение пегилированными интерферонами и рибавирином. (RU 2623151, опубл. 2017). Согласно известному способу определяют групповую принадлежность крови у пациентов с ХГС С, генотипом 1, в сочетании с исследованием полиморфизма гена IL28B, при этом в 100% случаев отмечалось прогрессирование фиброза печени у пациентов с группой крови А(3 (II) и одно- или двухнуклеотидной заменой цитозина на тимин (ОТ) в локусе rs 12979860 и одно- или двухнуклеотидной заменой тимина на гуанин (T>G) в локусе rs 8099917 гена IL28B. Способ направлен на отбор пациентов для безинтерфероновой терапии с целью исключения отрицательной динамики фиброза печени у данной категории пациентов.

Недостатком данного способа является прогноз только в отношении больных ХГС с 1 генотипом и только с целью определения тактики терапии интерферонсодержащими схемами. Известный способ позволяет прогнозировать только благополучный исход лечения.

Известен способ прогноза отсутствия регресса фиброза печени у больных хроническим гепатитом С (патент RU 2723387, дата приоритета 20.12.2019, опубл. 11.06.2020), который предусматривает иммунологическое исследование показателей Т-клеточного иммунитета с высоким коэффициентом информативности Кульбака, где при определении снижения уровней клеток CD19+ менее 11% и CD56+ менее 6% в сочетании с повышением количества CD4+CD119+ более 85% и уровня клеток CD45+CD4+CD119+ более 38% прогнозируют отсутствие регресса фиброза печени. Данный способ используется у больных хроническим гепатитом С без отягощенного преморбидного фона после противовирусной терапии.

По патенту RU 2317335 (дата приоритета 28.07.2006, дата регистрации 20.02.2008) предложена предсказательная модель, позволяющая оценить вероятность прогрессирования фиброза печени (развития цирроза) при ХГС, где в основу данной модели положено суммирование результатов анализа ДНК пациентов на наличие полиморфизмов генов цитокинов: (-511) С/Т гена IL-1b, (-174) G/C гена IL-6 и (+915) G/C гена TGF-b1. В способе используется метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, что делает его ресурсозатратным.

Способ определения риска развития гепатоцеллюлярной карциномы у больных хроническим гепатитом С [патент RU 2723891, дата приоритета 23.09.2019, дата регистрации 18.06.2020] позволяет определить риск развития гепатоцеллюлярной карциномы у больных хроническим гепатитом С за счет совместного использования сывороточных белковых маркеров - альфа-фетопротеина и остеопонтина как прогностических критериев. Для этого используют совокупность лабораторных показателей венозной крови пациента и его биологические показатели. Остеопонтин выбран в качестве дополнительного информативного критерия, который показал высокую чувствительность при диагностике гепатоцеллюлярной карциномы на ранних стадиях.

Данный способ основан на использовании комплекса лабораторных исследований, например, гематологические, биохимические, иммунохимические, иммуноферментные, что делает его трудоемким и ресурсозатратным.

При всех достоинствах выше описанных моделей, они обладает существенными недостатками, которые состоят в сложности практического применения, определяемой необходимостью проведения анализа слишком большого числа маркеров.

Хронический гепатит С сопровождается неуклонным прогрессированием заболевания и формированием фиброза печени различной выраженности. Определить критерии прогрессирования фиброза печени у больных ХГС - сложная и чрезвычайно актуальная задача, решение которой определяет выбор адекватной тактики ведения больного. Поиск и использование различных прогностических маркеров для оценки исхода хронического гепатита С является крайне важным для практического здравоохранения.

С учетом этого основной задачей настоящего изобретения стало создание предсказательной модели формирования цирроза печени у пациентов с ХГС, которая, обладая достаточной степенью надежности, основывалась бы на изучении небольшого числа биологических маркеров.

Технический результат заключается в возможности проведения быстрой, доступной, точной и достоверной оценки риска развития цирроза печени у больных ХГС, а именно простого и доступного в выполнении прогноза формирования цирроза печени, исключающего побочные явления и обеспечивающего своевременный выбор оптимальной тактики ведения пациентов, направленной на антифибротическую терапию.

Технический результат достигается за счет осуществления предложенного способа прогнозирования формирования цирроза печени у пациентов с хроническим гепатитом С путем иммуноферментного анализа серологических показателей в сыворотке крови с целью определения содержания биологических маркеров фиброза - остеопонтина (OPN) и фактора роста гепатоцитов (HGF). Выявление показателей OPN выше 23 нг/мл и HGF выше 935 нг/мл свидетельствует о наличии риска развития цирроза печени у больных ХГС.

Остеопонтин (OPN) представляет собой сильно отрицательно заряженный цитокино подобный белок, который регулирует обмен внеклеточного матрикса. Остеопонтин высоко экспрессируется в большинстве тканей и жидкостей организма и участвует в биоминерализации, ремоделировании костей и заживлении ран. У пациентов с гепатитом С при прогрессировании заболевания наблюдается усиленное иммуноокрашивание на OPN биоптатов печени, которое коррелирует со стадией фиброза, тогда как у пациентов, не прогрессирующих по стадии заболевания, оно остается неизменным. После повреждения печени гепатоциты и воспалительные клетки секретируют OPN. Остеопонтин в сыворотке крови значительно выше у пациентов с циррозом печени и коррелирует со степенью фиброза печени. Уровни OPN в сыворотке постепенно повышаются от стадии фиброза F0 до F4 у пациентов с гепатитом В и С [Song, Z. Osteopontin Takes Center Stage in Chronic Liver Disease / Song, Zhuolun et al. // Hepatology (Baltimore, Md). - 2021. - vol. 73,4. - p. 1594-1608].

Фактор роста гепатоцитов (HGF) представляет собой многофункциональный цитокин, который действует на различные эпителиальные клетки, регулируя рост, движение и морфогенез клеток, а также регенерацию. Когда печень теряет свою массу, объем или физиологические и биохимические функции по разным причинам, HGF связывается со своим специфическим рецептором c-Met и передает сигналы в клетки, что запускает внутреннюю киназную активность. HGF имеет важное клиническое значение для развития фиброза печени, регенерации гепатоцитов после воспаления и регенерации печени после трансплантации [Zhao, Yang. HGF/c-Met: A Key Promoter in Liver Regeneration / Zhao, Yang et al. // Frontiers in pharmacology. - 2022. - №13].

Таким образом, опубликованные данные свидетельствуют о том, что OPN и HGF могут являться прогностическими маркерами цирроза печени у пациентов с ХГС.

В основе создания предложенного решения лежит исследование ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, при котором были проведены соответствующие клинические исследования и в результате обследования 60 пациентов с хроническим гепатитом С получены собственные данные.

В исследовании принимали участие пациенты, соответствующие критериям включения: лабораторно подтвержденный диагноз хронического вирусного гепатита С, а именно: маркеры HCV-инфекции, определенные методом ИФА, и наличие РНК HCV методом ПЦР; возраст пациентов от 18 до 75 лет; отсутствие других заболеваний печени; наличие информированного согласия на участие в исследовании.

Критерии исключения: возраст младше 18 и старше 75 лет; употребление внутривенных психоактивных веществ за 6 месяцев до начала исследования.

Все пациенты были обследованы в соответствии со стандартами оказания медицинской помощи больным с хроническим гепатитом С.

Пациенты были разделены на две группы: 37 пациентов (61,7%) включили в группу ХГС - группу пациентов с хроническим гепатитом С; 23 пациента (38,3%) составили группу ЦП - группу пациентов с циррозом печени в исходе хронического гепатита С вне зависимости от стадии. Медиана возраста в каждой группа совпала и составила 47 лет.

У каждого пациента проводилось определение в сыворотке крови методом ИФА содержания серологических биомаркеров - остеопонтина, фактора роста гепатоцитов.

Иммуноферментный анализ (ИФА) относится к иммунохимическим методам исследования и основан на специфическом взаимодействии антиген-антитело и представляет собой стандартную методику количественного определения таких аналитов, как остеопонтина, фактора роста гепатоцитов.

Регламент постановки реакции с целью количественного определения остеопонтина включает внесение образца в лунку полистиролового планшета, сорбированную антителами к остеопонтину, биологического образца (плазма крови), инкубацию №1, отмывку, внесение биотинового конъюгата, инкубацию №2, отмывку, внесение стрептавидина, инкубацию №3, отмывку, внесение субстратного буфера, инкубацию №4, внесение стоп-реагента (кислота), считывание результатов с помощью фотометра (ридера) при длине волны 450 нм [https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN 0016520-2066-HuOsteopontin-ELISA-UG.pdf].

Для количественного определения фактора роста гепатоцитов регламент постановки реакции включает внесение биологического образца (плазма крови) в лунку полистиролового планшета, сорбированную антителами против человеческого фактора роста гепатоцитов (иммуносорбент), инкубацию №1, во время которой человеческий фактор роста гепатоцитов, присутствующий в образце, связывается с иммуносорбентом, внесенным одновременно с конъюгатом (антитела против человеческого фактора роста гепатоцитов, связанные с биотином), далее производят отмывку и внесение субстратного раствора (стрептавидин-HRP), инкубацию №2, внесение стоп-реагента, считывание результатов при длине волны 450 нм [https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets. thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0016521_2069INST_HuHGF-ELISA_UG.pdfJ].

Статистический анализ полученных данных проводился с использованием программы StatTech v. 3.1.10 (разработчик - ООО "Статтех", Россия). Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Колмогорова-Смирнова, так как число исследуемых составило более 50. Количественные данные описывались с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q1-Q3), так как данные не соответствовали нормальному распределению. Сравнение двух групп выполнялось с помощью U-критерия Манна-Уитни. При анализе показателей OPN, HGF в зависимости от диагноза, были выявлены существенные различия (Табл. 1 и 3).

Так, был проведен сравнительный анализ уровня OPN (нг/мл) у больных ХГС и циррозом печени (ЦП) с использованием метода U критерий Манна Уитни (табл. 1, рисунок 1).

Для оценки диагностической значимости количественных признаков при прогнозировании определенного исхода, применялся метод анализа ROC-кривых. Разделяющее значение количественного признака в точке cut-off определялось по наивысшему значению индекса Юдена. При оценке зависимости вероятности развития цирроза печени (ЦП) от уровня OPN (нг/мл) с помощью ROC-анализа была получена ROC-кривая (Рисунок 2). Площадь под ROC-кривой составила 0,819±0,071 с 95% ДИ: 0,679-0,959. Полученная модель была статистически значимой (р<0,001).

Пороговое значение показателя OPN (нг/мл) в точке cut-off, которому соответствовало наивысшее значение индекса Юдена, составило 23,000 (табл. 2). Цирроз печени прогнозируется при значении OPN (нг/мл) выше данной величины или равном ей. Чувствительность и специфичность модели составили 87,5% и 82,1%, соответственно (Рисунок 3).

Так же был выполнен анализ показателя Human HGF instant ELISA KIT (нг/мл) у больных ХГС и ЦП (табл. 3, рисунок 4).

Согласно представленной таблице при анализе уровня HGF (нг/мл) в зависимости от нозологии, были выявлены статистически значимые различия (р<0,001).

При оценке зависимости вероятности развития ЦП от уровня HGF (нг/мл) с помощью ROC-анализа была получена кривая (Рисунок 5). Площадь под ROC-кривой составила 0,858±0,057 с 95% ДИ: 0,746-0,970. Полученная модель была статистически значимой (р<0,001).

Пороговое значение показателя HGF (нг/мл) в точке cut-off, которому соответствовало наивысшее значение индекса Юдена, составило 935,000. Цирроз печени прогнозировали при значении показателя HGF (нг/мл) выше данной величины или равном ей. Чувствительность и специфичность модели составили 77,3% и 88,0%, соответственно (Рисунок 6). Пороговые значения уровня HGF (нг/мл) приведены в табл. 4.

Кроме того, был выполнен корреляционный анализ взаимосвязи между уровнями HGF (нг/мл) и OPN (нг/мл). Результаты корреляционного анализа приведены в табл. 5.

Это дает возможность рассматривать данные иммунологические показатели как критерии прогноза течения и прогрессирования ХГС.

На основании полученных данных такие серологические биомаркеры фиброза -остеопонтин (OPN) и фактор роста гепатоцитов (HGF), были определены как значимые для формирования цирроза печени при ХГС, анализ комбинации которых и предлагается использовать в новом способе определения предрасположенности больных ХГС к агрессивному течению заболевания.

Таким образом, поставленная задача разработки простого, достоверного и доступного в выполнении способа прогнозирования формирования цирроза печени у пациентов с хроническим гепатитом С была решена за счет использования новой комбинации серологических биомаркеров фиброза при проведении исследования сыворотки крови методом ИФА. Заявленный способ включает: а) получение биологического материала у больного ХГС, а именного сыворотки крови; б) проведение иммуноферменого анализа с целью определения показателей OPN и HGF; в) оценку результатов, где при выявлении OPN выше 23 нг/мл и HGF выше 935 нг/мл делают вывод о наличии риска развития цирроза печени у больных ХГС.

Краткое описание рисунков.

Рисунок 1 - Уровень OPN (нг/мл) у больных ХГС и ЦП, где:

1 - уровень OPN (нг/мл) при хроническом гепатит С;

2 - уровень OPN (нг/мл) при циррозе печени.

Рисунок 2. ROC-кривая, характеризующая зависимость вероятности развития ЦП от уровня OPN (нг/мл), где:

3 - ROC-кривая, характеризующая зависимость вероятности развития ЦП от уровня OPN (нг/мл).

Рисунок 3. Анализ чувствительности и специфичности модели в зависимости от пороговых значений уровня OPN (нг/мл), где:

4 - специфичность;

5 - чувствительность.

Рисунок 4. Уровень HGF (нг/мл) у больных ХГС и ЦП, где:

6 - уровень HGF (нг/мл) при хроническом гепатите С;

7 - уровень HGF (нг/мл) при циррозе печени.

Рисунок 5. ROC-кривая, характеризующая зависимость вероятности развития ЦП от показателя HGF (нг/мл), где:

8 - ROC-кривая, характеризующая зависимость вероятности развития ЦП от уровня HGF (нг/мл).

Рисунок 6. Анализ чувствительности и специфичности модели в зависимости от пороговых значений показателя HGF (нг/мл), где:

9 - специфичность;

10 - чувствительность.

Сущность заявляемого решения поясняется следующими клиническими примерами:

Клинический пример №1

Пациент Н.Т.А., 58 лет, поступил в ИКБ №2 19.11.2021 г. с жалобами на слабость, жидкий стул, дискомфорт в животе.

Анамнез заболевания: с 09.11.21 г. ежедневно жидкий стул 3-4 р/д, температура до 37°С. Обращался к терапевту по месту жительства, назначено УЗИ ОБП (патологии не выявлено). Принимал мезим, левомицетин. В связи с отсутствием эффекта от проводимого лечения, 19.11.2021 г. обратился за СМП, госпитализирован в ИКБ №2.

Анамнез жизни:

Аллергический анамнез: со слов, не отягощен.

Хронические заболевания: гипертоническая болезнь 2 ст., риск ССО 2.

Эпидемиологический анамнез: холецистэктомия (2011 г. ); травмы, переливание крови и ее компонентов, употребление ПАВ и алкоголя, половые контакты отрицает.

При поступлении: состояние средней тяжести. Сознание ясное. Цвет кожного покрова - смуглый. Краевая субиктеричность склер. ЧДД 18 /мин. Дыхание везикулярное, хрипов нет. АД 120/80 мм рт.ст. ЧСС: 78 /мин. Тоны сердца приглушенные. Пульс ритмичный. На языке налет белого цвета. Живот при пальпации мягкий. Болезненность живота при пальпации по ходу толстого кишечника. Симптомов раздражения брюшины нет. Стул был накануне, кашицеобразный, без патологических примесей. Печень, селезенка не пальпируются. Мочеиспускание свободное, безболезненное. Моча обычного цвета. Психоневрологический статус без особенностей. Данные лабораторного обследования приведены в табл. 6.

Anti-HCV (ИФА) - обнаружены. РНК HCV - 5,93×10*5 МЕ/мл (генотип 2 HCV).

Инструментальное обследование:

Компьютерная томография органов грудной полости (19.11.2021 г.): на серии томографических срезов определяются плотные кальцинаты размерами до 4 мм в S2 левого легкого Свежих очагов и инфильтратов не выявлено. В плевральных полостях жидкости, свободного газа не выявлено.

Ультразвуковое исследование органов брюшной полости (22.11.2021 г.): увеличение и диффузные изменения в паренхиме печени. Диффузные изменения в паренхиме поджелудочной железы.

Компьютерная томография органов брюшной полости и забрюшинного пространства с внутривенным болюсным контрастированием (30.11.2021 г.): КТ-картина гиподенсивного образования 7 сегмента печени (гемангиома), дивертикулеза нисходящего и сигмовидного отделов с признаками дивертикулита.

Основной диагноз: Энтероколит неуточненного происхождения.

Конкурирующий диагноз: Дивертикулярная болезнь кишечника, неуточненной части, без прободения и абсцесса.

Сопутствующие заболевания: Хронический вирусный гепатит С. Гипертоническая болезнь 2 ст., риск ССО 2.

На фоне проведенной терапии наблюдалась положительная клиническая и лабораторная динамика. Пациент выписывается с клиническим улучшением под амбулаторное наблюдение по месту жительства.

Клинический пример №2

Пациент О.Ю.С., 59 лет, поступил в ИКБ №2 26.01.2022 г. с жалобами на общую слабость, субфебрильную температуру, сухой кашель.

Анамнез заболевания: заболел остро 19.01.2022 г., когда появился сухой кашель, насморк, лихорадка до 37,2°С. Лечился симптоматически. В связи с отсутствием эффекта от терапии, 26.01.2022 г. обратился за СМП, госпитализирован в ИКБ №2. Накануне начала болезни отметил переохлаждение.

Анамнез жизни:

Аллергический анамнез: со слов, не отягощен. Хронические заболевания: отрицает

Эпидемиологический анамнез: постоянно проживает в центре социальной адаптации для лиц без определенного места жительства. Не употребляет алкоголь с 2018 г.

При поступлении: состояние средней тяжести. Сознание ясное. Кожный покров физиологической окраски. Гиперемия задней стенки ротоглотки. Миндалины не увеличены, налетов нет. Лимфатические узлы не пальпируются. ЧДЦ 18/ мин. Дыхание везикулряное, хрипов нет. АД 115/70 мм рт.ст. Пульс 82/мин. Тоны сердца звучные. Живот при пальпации мягкий, безболезненный. Симптомов раздражения брюшины нет. Печень не выступает из-под края реберной дуги. Мочеиспускание свободное, безболезненное. Моча светлая. Психоневрологический статус без особенностей. Данные лабораторного обследования приведены в табл. 7.

Anti-HCV (ИФА) - обнаружены. РНК HCV - 1,96×105 МЕ/мл (генотип За HCV).

Инструментальное обследование:

КТ органов грудной полости (26.01.2022 г.): Легкие без очаговых и инфильтративных изменений. КТ-0. Правосторонний сколиоз грудного отдела позвоночника, высотой угла на уровне Th7.

УЗИ органов брюшной полости (04.02.2022 г.): Увеличение и диффузные изменения в паренхиме печени. Диффузные изменения в паренхиме поджелудочной железы. Единичный увеличенный лимфатический узел ворот печени.

УЗИ почек, надпочечников, забрюшинного пространства (04.02.2022 г.): полостное образование (синусная киста) левой почки.

Эластометрия печени (04.02.2022 г.): Эластичность печени 11,9 кПа. Эластичность печени соответствует F 3 по шкале METAVIR. Степень стеатоза S 0.

Основной диагноз: Хронический вирусный гепатит С, впервые выявленный, генотип За, стадия репликации, умеренной степени активности, фиброз F3 (F 3 по шкале METAVIR, стеатоз S0).

Конкурирующий диагноз: Острая инфекция верхних дыхательных путей неуточненная, средней степени тяжести

Сопутствующие заболевания: Правосторонний сколиоз грудного отдела позвоночника Th7

Заключение: на фоне терапии положительная динамика - катаральные явления, лихорадка регрессировали. Гемодинамика стабильная. Пациент выписывается под наблюдение инфекциониста, терапевта, гастроэнтеролога/гепатолога в поликлинику по месту жительства. Рекомендовано проведение противовирусной терапии препаратами прямого противовирусного действия.

Клинический пример №3

Пациентка Д.А.И., 42 лет, поступила в ИКБ №2 27.08.2022 г. с жалобами на лихорадку до 38°С, желтушность кожи, потемнение мочи, увеличение живота в объеме, отеки нижних конечностей.

Анамнез заболевания: 05.08.2022 г. появилась лихорадка до 38°С, общая слабость. С 14.08.2022 г. отметила появление тошноты, желтухи, потемнение мочи, нарастание слабости. С 18.08.2022 г. стала отмечать увеличение живота в объеме, появились отеки нижних конечностей. Со слов, в начале августа 2022 г. при амбулаторном обследовании были выявлены anti-HCV.

Анамнез жизни:

Аллергический анамнез: со слов, не отягощен.

Хронические заболевания: хронический бронхит;

Перенесенные заболевания: новая коронавирусная инфекция (2021 г.); Вредные привычки: ранее злоупотребляла алкоголем, табакокурением. На текущей момент отрицает.

Эпидемиологический анамнез: регулярно выезжает в Московскую область, раннее злоупотребляла алкоголем, табакокурением. На текущий момент отрицает.

При поступлении: состояние тяжелое. Сознание ясное. Цвет кожного покрова желтушный. Отеки стоп и голеней по типу пастозности. Цвет слизистой полости рта желтушный. Множественные сосудистые звездочки по коже туловища. ЧДД 20/ мин. Дыхание везикулряное, хрипов нет. АД 110/70 мм рт.ст. Пульс 98/мин. Тоны сердца приглушенные. Объем живота увеличен за счет асцита. Живот при пальпации безболезненный. Симптомов раздражения брюшины нет. Стул полуоформленный. Печень выступает из-под края реберной дуги на 2 см. Мочеиспускание свободное, безболезненное. Цвет мочи темный. Психоневрологический статус без особенностей. Данные лабораторного обследования приведены в табл. 8.

Anti-HCV (ИФА) - обнаружены.

Инструментальное обследование:

Рентгенография органов грудной клетки (27.08.2022): очаговых и инфильтративных изменений не выявлено.

УЗИ органов брюшной полости (27.08.2022): увеличение и выраженные диффузные изменения в паренхиме печени. Расширение воротной и селезеночной вен. Утолщение стенок и эхогенная взвесь в полости ЖП. Диффузные изменения в паренхиме поджелудочной железы.

Эластометрия печени (29.08.2022): эластичность печени соответствует F4 по шкале METAVIR (75,0 кПа). Степень стеатоза - S3.

Основной диагноз: Хронический вирусный гепатит С с исходом в цирроз печени класса С по Чайлд-Пью.

Осложнения основного заболевания: Асцит. Синдром портальной гипертензии. Печеночно-клеточная недостаточность.

Заключение: пациентка с циррозом печени в исходе ХГС нуждается в переводе в профильное отделение ИКБ №1.

Клинический пример №4

Пациентка Ш.И.Н., 47 лет, поступила в ИКБ №2 26.11.2022 г. с жалобами на лихорадку до 39°С, разлитую боль по всему животу, увеличение живота в объеме.

Анамнез заболевания: 21.11.2022 г. лихорадка до 40°С, озноб, выраженная общая слабость, также заметила желтушность склер, отметила потемнение мочи. 21-22.11.2022 г. отметила запор. 23.11.2022 г. самостоятельно стала принимать лактулозу, иубпрофен, ципрофлоксацин. На фоне приема препаратов началась водянистая диарея до 15 раз в сутки. 26.11.2022 г. сохранялась лихорадка, жидкий стул. Обратилась за СМП, госпитализирована в ИКБ №2.

Анамнез жизни:

Аллергический анамнез: со слов, не отягощен.

Хронические заболевания: рак левой молочной железы (терапия тамоксифеном в 2021 г.). ЖДА. Хронический геморрой

В настоящее время принимает: софосбувир, велпатасвир.

Эпидемиологический анамнез: С 27.08.22 по 31.08.22 находилась на стационарном лечении в ГКБ им. В.В. Виноградова с диагнозом «Цирроз печени смешанной этиологии (вирусный С + алиментарный + метаболический) класса В по Чайлд-Пью. ВРВП 2-3 ст. с признаками продолжающегося кровотечения. Постгеморрагическая анемия. Вторичная тромбоцитопения». С 13.09.22 по 27.09.22 находилась на стационарном лечении в ИКБ №1 с диагнозом «Хронический гепатит С с исходом в цирроз печени класс С по Чайлд-Пью. Портальная гипертензия. ВРВП 2 ст. Лигирование от 2021 г. Кровотечение из ВРВП от августа 2022 г. Асцит». Употребление ПАВ (героин в/в) с 1992 г. по 1994 г.

При поступлении: состояние средней тяжести. Сознание ясное. Цвет кожного покрова желтушный. Склеры иктеричные. ЧДД 18/ мин. Дыхание везикулряное, хрипов нет. АД 120/80 мм рт.ст. Пульс 88/мин. Тоны сердца звучные. Белый налет по центру языка. Объем живота увеличен за счет асцита. Живот при пальпации болезненный в эпигастрии и околопупочной области. Симптомов раздражения брюшины нет. Стул водянистый, без патологических примесей. Печень не выступает из-под края реберной дуги. Мочеиспускание свободное, безболезненное. Цвет мочи темный. Психоневрологический статус: речь замедленная, инверсия сна. Данные лабораторного обследования приведены в табл. 9.

Anti-HCV (ИФА) - обнаружены. РНК HCV - <1200 копий в мл. Инструментальное обследование:

УЗИ органов брюшной полости (26.11.2022 г.): увеличение и диффузные изменения в паренхиме печени. Утолщенная диффузно измененная стенка желчного пузыря. Начальные признаки расширения воротной вены. Диффузные изменения поджелудочной железы. Увеличение и диффузные изменения в паренхиме селезенки. Свободная жидкость в брюшной полости в большом количестве.

КТ органов грудной полости (26.11.2022 г.): цирротическая трансформация печени, гепатоспленомегалия, асцит в небольшом количестве, поствоспалительные изменения в легких.

УЗИ органов брюшной полости (14.12.2022 г.): увеличение печени, диффузные изменения по типу хронического процесса, диффузные изменения в поджелудочной железе, увеличение селезенки, добавочная долька селезенки, расширение селезеночной вены.

УЗИ ОБП на свободную жидкость (14.12.2022 г.): небольшой асцит, в динамике с 26.11 значительное уменьшение количества жидкости.

УЗИ плевральной полости (14.12.2022 г.): небольшой гидроторакс справа.

Основной диагноз: Хронический вирусный гепатит С, вне репликации, низкой степени активности, с исходом в цирроз печени класса С по Чайлд-Пью.

Осложнения основного заболевания: Портальная гипертензия: ВРВП 2 ст. Лигирование от 2021 г. Кровотечение из ВРВП от августа 2022 г.

Заключение: на фоне терапии отмечается улучшение, проведены инъекции лейкостима с целью купирования агранулоцитоза. Выписывается с улучшением под амбулаторное наблюдение по месту жительства.

Исходя из приведенных данных, представляется возможным констатировать, что концентрации OPN выше 23 нг/мл и HGF выше 935 нг/мл, определенные в сыворотке крови методом ИФА, у пациентов с ХГС свидетельствуют о трансформации фиброза печени в цирроз, поэтому использование указанных показателей как ранних маркеров развития цирроза печени будет способствовать своевременному началу противовирусной терапии, что поможет избежать появления осложнений, развития гепатоцеллюлярной карциномы в исходе цирроза печени, улучшит качество жизни и уменьшит смертность пациентов.

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии и гепатологии. Может использоваться для прогнозирования формирования цирроза печени у пациентов с хроническим гепатитом С. Методом иммуноферментного анализа сыворотки крови пациента определяют количественные показатели остеопонтина и фактора роста гепатоцитов. При выявлении показателей остеопонтина выше 23 нг/мл и фактора роста гепатоцитов выше 935 нг/мл прогнозируют риск развития цирроза печени. Способ не инвазивен, доступен, обеспечивает своевременный выбор оптимальной тактики ведения пациентов, направленных на антифибротическую терапию.1 з.п. ф-лы, 6 ил., 9 табл., 4 пр.

1. Способ прогнозирования формирования цирроза печени у пациентов с хроническим гепатитом C путем проведения исследования методом иммуноферментного анализа биологического образца пациента, включающего количественное определение показателей остепонтина и фактора роста гепатоцитов, где при выявлении показателей остепонтина выше 23 нг/мл и фактора роста гепатоцитов выше 935 нг/мл прогнозируют риск развития цирроза печени у больных хроническим гепатитом С.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве биологического образца используют сыворотку крови пациента.