Способ дифференциальной диагностики хронического гепатита В и аутоиммунных заболеваний печени у пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени Российский патент 2025 года по МПК G01N33/68 G01N33/573 

Изобретение относится к медицине, в частности к способам лабораторной диагностики патологических состояний печени, и может найти применение в клинико-лабораторных условиях для дифференциальной диагностики хронического гепатита В (ХГВ) и аутоиммунных заболеваний печени (АИЗП), включающих аутоиммунный гепатит и первичный билиарный цирроз у пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени.

Хронические заболевания печени являются причиной примерно двух миллионов смертей в год во всем мире и представляют собой актуальную проблему глобального здравоохранения. К наиболее распространенными причинам этих заболеваний относятся вирусные - гепатит В и гепатит С, а также алкогольный и неалкогольный стеатогепатит, аутоиммунные и генетические заболевания печени. Для хронических заболеваний печени характерно развитие фиброза печени - патологического процесса при котором нормальная ткань печени замещается соединительной. При этом, развивающийся фиброз печени определяет ухудшение качества жизни, является основной причиной клинических осложнений и значимой причиной смертности во всем мире т.к. его степень коррелирует с функцией печени и представляет собой основной фактор риска развития гепатоцеллюлярной карциномы [Roehlen N., Crouchet Е., Baumert T.F., Liver Fibrosis: Mechanistic Concepts and Therapeutic Perspectives. Cells. 2020, 9, 875; doi: 10.3390/cells9040875; Asrani, S.K.; Devarbhavi, H.; Eaton, J.; Kamath, P.S. Burden of liver diseases in the world. J. Hepatol. 2019, 70, 151-171. https://doi.org/10.1016/j.jhep.2018.09.014; Llovet, J.M.; Zucman-Rossi, J.; Pikarsky, E.; Sangro, В.; Schwartz, M.; Sherman, M.; Gores, G. Hepatocellularcarcinoma. Nat. Rev. Dis. Primers 2016, 2, 16018. https://doi.org/10.1038/nrdp.2016.18].

В настоящее время диагностика фиброза печени, помимо компьютерной томографии и ультразвуковой эластографии, а также биопсии печени, включает оценку состояния печени по системе специальных тестов. Для их осуществления, проводят лабораторный анализ комплекса из десяти лабораторных и четырех антропометрических параметров (возраст, пол, вес и рост). В зависимости от необходимости, по этим данным могут быть рассчитаны значения для шкал следующих тестов - ФиброТеста, СтеатоТеста, АктиТеста (при вирусном гепатите С и В), НэшТеста (при ожирении, сахарном диабете) и ЭшТеста (при злоупотреблении алкоголем). Также существует комплексный тест, включающий в себя все вышеперечисленные - ФиброМакс [Morra R., Munteanu М., Imbert-Bismut F., Messous D., Ratziu V., Poynard Т. FibroMAX: towards a new universal biomarker of liver disease? Expert Rev. Mol. Diagn. 2007 Sep;7(5):481-90.doi: 10.1586/14737159.7.5.481]. Ультразвуковая эластография печени позволяет оценить наличие фиброза печени по результатам компьютерного анализа проницаемости ткани печени для ультразвуковых колебаний [Павлов Ч.С., Глушенков Д.В., Ивашкин В.Т. Современные возможности эластометрии, Фибро- и АктиТеста в диагностике фиброза печени, «Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии» 2008; 16 (4): 43-52.]. Исследование позволяет с высокой точностью дифференцировать выраженные и тяжелые степени фиброза или цирроз печени, но не обладает достаточной чувствительностью при определении и дифференцировании ранних стадий фиброза. В сложных клинических случаях выполняют пункционную биопсию печени. К сожалению, биопсия печени, оставаясь «золотым стандартом» определения стадии фиброза, является инвазивным методом с определенным процентом осложнений, проводится в госпитальных условиях, имеет ряд противопоказаний и трудностей трактовки результата. По итогам этих обследований устанавливается стадия фиброза по шкале METAVIR, отражающая тяжесть процесса и форму фиброзного поражения. Согласно этой шкале выделяют пять стадий фиброза (F0-4), где F0 соответствует отсутствию фиброза, a F4 - циррозу печени [Poynard Т., Bedossa P., Opolon P. Natural history of liver fibrosis progression in patients with chronic hepatitis C. The OBSVIRC, METAVIR, CLINIVIR and DOSVIRC groups. Lancet. 1997; 349 (9055): 825-832, doi: 10.1016/s0140-6736(96)07642-8].

Аутоиммунные заболевания печени (АИЗП) представляют собой группу заболеваний, включающую аутоиммунный гепатит и первичный билиарный цирроз. Аутоиммунный гепатит - хроническое заболевание печени неизвестной этиологии, характеризующееся перипортальным или более обширным воспалением и появлением в сыворотке широкого спектра аутоантител. Первичный билиарный цирроз - хронический негнойный деструктивный холангит неясной этиологии, поражающий главным образом мелкие внутрипеченочные желчные протоки [Шварц В.Я., Ногаллер A.M., Кольберг Б. Аутоиммунный гепатит КЛИНИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА, 2013, №9: 57-61; Christen U., Hintermann Е., Immunopathogenic Mechanisms of Autoimmune Hepatitis: How Much Do We Know from Animal Models? Int. J. Mol. Sci. 2016 Dec 1;17(12):2007. doi: 10.3390/ijms17122007; Подымова С.Д. Перекрестные аутоиммунные синдромы в гепатологии ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ, 2013, №4: 3-12]. АИЗП поражают преимущественно лиц трудоспособного возраста и при отсутствии надлежащего лечения приводят к инвалидизации и высокому риску смерти больных, что определяет важность своевременной диагностики. Схожесть клинических, лабораторных и даже морфологических проявлений аутоиммунных заболеваний печени между собой и с другими видами гепатобилиарной патологии обусловливает сложности их дифференциальной диагностики.

Гепатит В представляет собой инфекционное заболевание печени развивающееся в результате инфицирования вирусом гепатита В, отличающимся чрезвычайно высокой устойчивостью к факторам окружающей среды и обладающим высокой тропностью к гепатоцитам. Заболевание может быть острым, либо хроническим, вероятность развития хронической формы снижается с увеличением возраста пациентов. Исходом хронизации заболевания является развитие фиброза, а затем и цирроза печени, а также увеличение вероятности развития гепатоцеллюлярной карциномы [Гончикова С.Ч., Убеева И.П., Николаев С.М. Иммунологические аспекты патогенеза вирусных гепатитов, Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2010, №2 (72): 17-22; Ganem D., Prince A.M. Hepatitis В virus infection - natural history and clinical consequences. The New England Journal of Medicine. 2004;350(11):1118-1129].

Вирусные гепатиты В и С, а также аутоиммунные заболевания печени сопровождаются активацией собственных клеток печени, а также клеток иммунной системы, которые в случае вирусных гепатитов атакуют зараженные, а в случае аутоиммунных - здоровые клетки печени. Эти процессы сопровождаются взаимодействием различных клеточных групп, которое регулируется сложным сочетанием рецепторных и растворимых факторов. К основным растворимым факторам относятся цитокины - специальные регуляторные пептиды, обеспечивающие коммуникацию иммунных клеток между собой и с другими клетками организма [Ефремова Н.А., Грешнякова В.А., Горячева Л.Г. Современные представления о патогенетических механизмах фиброза печени, ЖУРНАЛ ИНФЕКТОЛОГИИ, 2023, Том 15, №1, DOI: 10.22625/2072-6732-2023-15-1-16-24; Pellicoro A, Ramachandran Р, Iredale JP, Fallowfield JA. Liver fibrosis and repair: immune regulation of wound healing in a solid organ. Nat Rev Immunol. 2014, 14:181-94. doi:10.1038/nri3623; Seki E, Schwabe RF. Hepatic inflammation and fibrosis: functional links and key pathways. Hepatology. 2015;61:1066-79. doi:10.1002/hep.27332; Krenkel O, Tacke F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nat Rev Immunol. 2017;17:306-21. doi: 10.1038/nri.2017.11]. При высокой интенсивности либо длительности локальных иммунных процессов, некоторые из цитокинов могут быть обнаружены в сыворотке или плазме крови. Благодаря этому, изменения уровней специфических цитокинов в периферической крови могут отражать степень активности различных процессов с участием иммунных клеток и, в том числе, интенсивность формирования фиброза печени, а сами цитокины - выступать в роли биомаркеров различных форм поражений печени [Семенов А.В., Арсентьева Н.А., Любимова Н.Е., Тюленев С.В., Басина В.В., Эсауленко Е.В., Тотолян А.А. Роль цитокинов и хемокинов в лабораторной диагностике хронического вирусного гепатита С, Клиническая лабораторная диагностика. 2015; 60 (8): 45-51; Li МН, Lu Y, Zhang L, Wang XY, Ran CP, Hao HX, Zhang D, Qu XJ, Shen G, Wu SL, Cao WH, Qi TL, Liu RY, Hu LP, Chang M, Hua WH, Liu SA, Wan G, Xie Y. Association of Cytokines with Alanine Aminotransferase, Hepatitis В Virus Surface Antigen and Hepatitis В Envelope Antigen Levels in Chronic Hepatitis B. Chin Med J (Engl). 2018 Aug 5;131(15):1813-1818. doi: 10.4103/0366-6999.237394].

Известен способ диагностики степени выраженности фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом, включающий определение показателей спонтанной и индуцированной адреналином и коллагеном агрегации тромбоцитов, активности тромбоцитоспецифических пептидов β-тромбоглобулина и тромбоцитарного фактора 4 в плазме [Способ неинвазивной диагностики степени выраженности фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом (RU 2261441 С2), опубликован 27.09.2005]. Способ позволяет определить степени выраженности фиброза печени, но не причину его развития.

Известен способ диагностики фиброза печени, включающий определение у пациента уровней экспрессии плазминогена урокиназного типа, матричной металлопротеиназы 9 и β2-микроглобулина и вычисление на их основании балльной оценки и постановку диагноза [Биомаркеры, пригодные при диагностике фиброза печени (RU 2505821 C2), опубликован 27.01.2014]. Способ также относится к малоинвазивным методам определения степени фиброза печени по биомаркерам в плазме крови, однако не позволяет определить причину его развития.

Наиболее близкими по своей сущности к методу, предлагаемому в данном изобретении, являются способы дифференциальной диагностики для пациентов с фиброзом печени начального уровня по концентрациям нескольких цитокинов между ХГВ и АИЗП [Способ дифференциации фиброза печени при хроническом вирусном гепатите В и аутоиммунных поражениях печени (RU 2701723 С1), опубликован 01.10.2019] и между ХГВ и ХГС [Способ дифференциации причин развития фиброза печени начального уровня при хронических вирусных гепатитах В и С (RU 2759672 С2), опубликован 16.11.2021]. В первом случае, способ основан на определении в плазме крови пациентов трех цитокинов CCL8/MCP-2, CXCL10/IP-10, IFNγ и сравнением с пороговыми значениями; во втором - CCL2/MCP-1, CCL8/MCP-2, IFNγ и сравнением с пороговыми значениями. Методы позволяют провести дифференциальную диагностику при определении причин развития фиброза начального уровня (F0-1 METAVIR), между ХГВ и АИЗП в первом случае и ХГВ и ХГС - во втором, но не позволяют определять эти заболевания одновременно. Также, методы предназначены для работы только с пациентами с фиброзом начального уровня, но не тяжелым фиброзом или циррозом печени.

Задача настоящего изобретения заключается в разработке способа дифференциальной диагностики хронического гепатита В и аутоиммунных заболеваний печени, включающих аутоиммунный гепатит и первичный билиарный цирроз, у пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени (F3-4), благодаря определению в плазме крови трех цитокинов - ИЛ-2, ИЛ-8, ИЛ-18.

Изобретение позволит расширить арсенал средств, используемых для диагностики заболевании печени.

Сущность изобретения поясняется чертежом, где на Фигуре 1 приведен алгоритм обработки результатов. Пороговые значения получены авторами по результатам анализа образцов плазмы крови пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени и диагнозами ХГВ и АИЗП.

Решение поставленной задачи достигается тем, что производится взятие образца периферической крови пациента с тяжелым фиброзом или циррозом печени и диагнозом ХГВ или АИЗП, центрифугирование пробы с отделением плазмы с последующим диагностированием заболевания по содержанию белковых продуктов в плазме крови. Авторами предложено в качестве определяемых белковых продуктов использовать цитокины ИЛ-2, ИЛ-8, ИЛ-18. Их концентрацию определяют в плазме крови и по соответствию концентрации маркеров пороговым значениям предполагают в качестве диагноза хронический гепатит В или аутоиммунные заболевания печени.

Для оценки диагностической ценности анализируемых биомаркеров, для них был проведен анализ характеристических кривых (receiver operating characteristic curve - ROC) и определены значения площади под кривой - AUC (Area Under the Curve). Было установлено, что самостоятельно ни один из выделенных показателей не обладает максимальной чувствительностью и специфичностью, что исключает возможность их изолированного использования с диагностической целью. Далее был применен метод построения деревьев решений в программе STATISTICA 10, на основе полученных результатов которого было установлено, что совместное определение трех маркеров ИЛ-2, ИЛ-8, ИЛ-18 является достаточным для проведения дифференциальной диагностики ХГВ и АИЗП. Значения AUC для трех цитокинов были более 0,99, что говорит о хорошем качестве выбранной модели.

В результате анализа были получены следующие пороговые значения для проведения дифференциальной диагностики ХГВ и АИЗП: ИЛ-2 - 0,14 пг/мл, ИЛ-8 - 3,86 пг/мл и ИЛ-18 - 200,85 пг/мл. Использование данного диагностического алгоритма позволяет достигнуть чувствительности 100% при специфичности 88% - для ХГВ, чувствительности 88,0%, при специфичности 100% - для АИЗП.

Сущность изобретения поясняется чертежом, где на Фиг. 1 представлено дерево решений для дифференциальной диагностики хронического гепатита В и аутоиммунных заболеваний печени, у пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени.

Изобретение реализуется следующим способом.

Пример 1. Выбор порогового значения содержания цитокинов

Для расчетов пороговых значений использовали значения содержания цитокинов ИЛ-2, ИЛ-8, ИЛ-18 в группах больных с тяжелым фиброзом/циррозом печени. Образцы периферической крови забирали в вакуумную пробирку с антикоагулянтом K2 ЭДТА, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин для отделения плазмы, которую отбирали в пробирки типа «Эппендорф», замораживали и хранили при -80°С до проведения эксперимента. Для определения содержания цитокинов в плазме крови использовали технологию мультиплексного иммуноферментного анализа по стандартным методикам согласно инструкциям производителя (Millipore, США). Статистическую обработку проводили с применением программного пакета STATISTICA 10. Для оценки диагностической ценности анализируемых цитокинов был применен метод построения деревьев решений, на основе полученных результатов которого было установлено, что совместное определение трех маркеров ИЛ-2, ИЛ-8 и ИЛ-18 является максимально информативным для проведения дифференциальной диагностики ХГВ и АИЗП.

Оценку проводят по следующему алгоритму: на первой стадии оценивают концентрацию ИЛ-18, значение которого более или равно 200,85 пг/мл указывает на диагноз ХГВ, значения менее 200,85 пг/мл - требует проведения второй стадии, на которой оценивают концентрацию ИЛ-8, значение менее 3,86 пг/мл указывает на диагноз АИЗП, более или равно 3,86 пг/мл - требует проведения третьей стадии, на которой оценивают концентрацию ИЛ-2, значение менее 0,14 пг/мл указывает на диагноз ХГВ, более или равно 0,137 - на диагноз АИЗП.

Пример 2. Диагностика

Больная М, 57 лет.

Диагноз: первичный билиарный цирроз. Поступила 15 января 2014 года в отделение терапии Городской клинической больницы №31, СпБ, в состоянии средней тяжести. Эластометрия печени - цирроз печени. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации цитокинов в плазме крови: ИЛ-2 = 5,81 пг/мл, ИЛ-8 = 15,93 пг/мл, ИЛ-18 = 58,53 пг/мл. Таким образом, у больной значение ИЛ-18 < 200,85 пг/мл, ИЛ-8 ≥ 3,86 пг/мл, а ИЛ-2 ≥ 0,14 пг/мл, что соответствует предполагаемому диагнозу АИЗП и совпадает с фактическим диагнозом заболевания.

Больная Л., 35 лет.

Диагноз: первичный билиарный цирроз. Поступила 06 февраля 2015 года в отделение терапии Городской клинической больницы №31, СпБ, в состоянии средней тяжести. Эластометрия печени - фиброз F3-4 по шкале METAVIR. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации цитокинов в плазме крови: ИЛ-2 = 0,08 пг/мл, ИЛ-8 = 0,87 пг/мл, ИЛ-18 = 11,85 пг/мл. Таким образом, у больной значение ИЛ-18 < 200,85 пг/мл, а ИЛ-8 < 3,86 пг/мл, что соответствует предполагаемому диагнозу АИЗП и совпадает с фактическим диагнозом заболевания.

Больной П., 57 лет.

Диагноз: хронический вирусный гепатит В, цирротическая стадия. Поступил 2 декабря 2019 во 2-е инфекционное боксированное отделение КИБ им. С.П. Боткина, СпБ, в тяжелом состоянии. Эластометрия печени - цирроз печени. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации цитокинов в плазме крови: ИЛ-2 = 0,11 пг/мл, ИЛ-8 = 20,78 пг/мл, ИЛ-18 = 205,97 пг/мл. Таким образом, у больного значение ИЛ-18 ≥200,85 пг/мл, что соответствует предполагаемому диагнозу ХГВ и совпадает с фактическим диагнозом заболевания.

Таким образом, предложенный алгоритм может эффективно использоваться для дифференциальной диагностики хронического гепатита В и аутоиммунных заболеваний печени, включающих аутоиммунный гепатит и первичный билиарный цирроз, у пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени (F3-4).

Изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии, лабораторной диагностике, и может быть использовано для дифференциальной диагностики хронического гепатита В (ХГВ) и аутоиммунных заболеваний печени (АИЗП) у пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени. Проводят определение в плазме крови концентрации цитокинов ИЛ-2 в пг/мл, ИЛ-8 в пг/мл, ИЛ-18 в пг/мл. Диагноз у пациента с тяжелым фиброзом и циррозом печени устанавливают путем сопоставления полученных значений с пороговыми: на первой стадии оценивают концентрацию ИЛ-18, при значении которого более или равно 200,85 пг/мл диагностируют ХГВ, значение менее 200,85 пг/мл требует проведения второй стадии. На второй стадии оценивают концентрацию ИЛ-8, при значении менее 3,86 пг/мл диагностируют АИЗП, более или равно 3,86 пг/мл требует проведения третьей стадии. На третьей стадии оценивают концентрацию ИЛ-2, при значении менее 0,137 пг/мл диагностируют ХГВ, при значении более или равно 0,14 диагностируют АИЗП. Способ обеспечивает возможность дифференциальной диагностики хронического гепатита В и аутоиммунных заболеваний печени, включающих аутоиммунный гепатит и первичный билиарный цирроз, у пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени (F3-4) с высоким уровнем чувствительности и сохранением требуемой специфичности за счет определения в плазме крови трех цитокинов: ИЛ-2, ИЛ-8, ИЛ-18. 1 ил., 3 пр.

Способ дифференциальной диагностики хронического гепатита В (ХГВ) и аутоиммунных заболеваний печени (АИЗП) у пациентов с тяжелым фиброзом и циррозом печени, включающий определение в плазме крови концентрации цитокинов ИЛ-2 в пг/мл, ИЛ-8 в пг/мл, ИЛ-18 в пг/мл, характеризующийся тем, что диагноз у пациента с тяжелым фиброзом и циррозом печени устанавливают путем сопоставления полученных значений с пороговыми:

на первой стадии оценивают концентрацию ИЛ-18, при значении которого более или равно 200,85 пг/мл диагностируют ХГВ, значение менее 200,85 пг/мл требует проведения второй стадии, на которой оценивают концентрацию ИЛ-8, при значении менее 3,86 пг/мл диагностируют АИЗП, более или равно 3,86 пг/мл - требует проведения третьей стадии, на которой оценивают концентрацию ИЛ-2, при значении менее 0,137 пг/мл диагностируют ХГВ, при значении более или равно 0,14 диагностируют АИЗП.