СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МИКСОМЫ СЕРДЦА Российский патент 2005 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к новой главе современной хирургии - кардиоонкологии, в частности к способу диагностики миксом сердца, и может быть использовано в патологоанатомических отделениях лечебных и научных учреждений при проведении дифференциальной диагностики опухолей сердца неясного гистогенеза.

Первичные опухоли сердца - заболевание с чрезвычайно полиморфной клинической картиной и неблагоприятным прогнозом. Среди них миксомы сердца - доброкачественные опухоли, - составляют в клинической практике кардиохирургических центров 70-90%. Выявление опухолей сердца затруднено в связи с отсутствием патогномоничных признаков и возможностью бессимптомного течения болезни. Ведущую роль в выявлении опухолей сердца играет эхокардиография, которая позволяет определить размер, форму, локализацию новообразования и тактику хирургического лечения. Однако эхокардиография не позволяет идентифицировать вид новообразования. Идентификация опухоли требует гистологического анализа.

Гистологическая идентификация опухоли необходима для определения тактики лечения оперированных больных. Вместе с тем, дифференциальная диагностика миксомы сердца нередко вызывает определенные затруднения, так как до настоящего времени нет четких диагностических критериев, позволяющих отличить миксомы сердца от других образований аналогичной локализации, сходной структуры с миксоматозом стромы.

Способ распознавания вида опухоли с использованием транскрипционных маркеров был предложен для диагностики рака легких [Beer D.J., Kardia Sh., Giordano T.J., Taylor J., Hanash S.M., Huang Chiang-Ching, Misek D.E., Thomas D., Kuick R. Expression profile of lung cancer, US Patent # US 2004063120; 1 апреля 2004]. Этот способ не может быть использован для диагностики миксом сердца, так как описанный набор транскрипционных маркеров не является специфическим для миксом сердца.

Прототипом диагностики миксомы сердца по уровню экспрессии генов - транскрипционных маркеров является способ распознавания миксомы сердца с использованием моноклональных антител против клеток мезенхимы (антивиментин), эндотелиоцитов всех типов (антиCD 31 и антиCD34) и ангиотензин-конвертирующего фермента (антиCD143), который используют как дискриминатор сосудистого и эндокардиального эндотелия [Руденко Е.В., Захарова В.П., Витовский P.M., Кнышов Г.В. Способ распознавания миксомы сердца. Патент UA 46684 А, А 61 В 10/00, 2002].

Недостатки этого способа.

1. Предложенный набор антигенов не является специфическим для миксомы. Иммуноположительными по набору vim+CD31+CD34+CD143+ будут все опухоли, содержащие сосуды.

2. Требуется одновременное выявление четырех антигенов в одной и той же клетке опухоли, что технически очень сложно.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение точности диагностики миксом сердца.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в способе, включающем анализ опухоли, определяют уровень экспрессии набора генов - экспрессионных маркеров PLA2G2A, PLTP, MIA, SPP1, SOX9, TIMP1, затем отношение уровня экспрессии каждого гена к TIMP1 и при значениях отношений для PLA2G2A выше трех, для PLTP выше одного и для каждого из генов MIA, SPP1 и SOX9 выше одной десятой опухоль диагностируют как миксому сердца.

Предложенный способ и признаки, отличающие его от известных, в медицинской и патентной литературе не обнаружены. Это позволяет сделать вывод о соответствии его критерию "новизна".

Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что в исследуемой опухоли сердца определяют уровень экспрессии набора генов - экспрессионных маркеров PLA2G2A, PLTP, MIA, SPP1, SOX9, TIMP1, затем отношение уровня экспрессии каждого гена к TIMP1 и при значениях отношений для PLA2G2A выше трех, для PLTP выше одного и для каждого из генов MIA, SPP1 и SOX9 выше одной десятой опухоль диагностируют как миксому сердца.

Способ осуществляют следующим образом. Для анализа берут фрагмент опухоли, удаленной при операции. Анализируемый фрагмент замораживают в жидком азоте и хранят при температуре не выше -70°С до выделения РНК. Выделение РНК проводят по стандартной методике. Уровень экспрессии генов PLA2G2A, PLTP, MIA, SPP1, SOX9 и TIMP1 (определяемый как содержание мРНК этих генов) измеряют с использованием метода ОТ-ПЦР (обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция). Для определения проводят синтез кДНК из 1 микрограмма суммарной РНК опухоли, используя набор праймеров со случайной последовательностью (Advantage™ RT-for-PCR Kit, Cat # 639505, Clontech). Измерение уровня экспрессии генов-маркеров проводят в два этапа методом ОТ-ПЦР с использованием набора реактивов Advantage cDNA PCR Kit (Cat # K1905-1, Clontech). Условия проведения ПЦР: 95°С, 20 сек; 55°С, 30 сек; 72°С, 45 сек.

На первом этапе 2% кДНК используют для ПЦР-амплификации кДНК TIMP-1 (пара праймеров - GACCTCGTCATCAGGGCCAAGTTC, CTCCTCGCTGCGGTTGTGGGAC; размер амплифицируемого фрагмента - 201 пара оснований). Число циклов ПЦР: 22, 24, 26, 28, 30. Продукты реакций анализируют электрофорезом в агарозном геле и фиксируют число циклов (N), при котором отчетливо виден ампликон (амплифицируемый фрагмент кДНК гена) TIMP1. На втором этапе проводят измерение отношения уровеня экспрессии генов PLA2G2A, PLTP, MIA, SPP1, SOX9 к TIMP1. Для этого проводят раздельную амплификацию генов PLA2G2A (праймеры - TGCATTTGTCACCCAAGAACTCTTACC, CCCCGAGTTGCTAAACTTGTAGCTC; размер ампликона - 303 пары оснований), PLTP (TGGCACCACCATCTCTGTCACTGC, GCATGGTTCGTCACCACCTCATGC; размер ампликона - 339 пар оснований), MIA (CCCGGTCCCTGGTGTGCCTTG, CTGAGCTCACTGGCAGTAGAAATCC; размер ампликона - 397 пар оснований), SPP1 (TATGATGGCCGAGGTGATAGTGTGG, CGGCTGACTTTGGAAAGTTCCTGAC; 346), SOX9 (AAGACATTTAAGCTAAAGGCAACTCGTAC, TGATCACACGATTCTCCATCATCCTC; 197), и TIMP1, используя в качестве матрицы кДНК в количестве: PLA2G2A - 0,07%, PLTP - 0,2%, TIMP1 - 0,2%, MIA - 2%, SPP1 - 2%, SOX9 - 2%. Число циклов выбирают равным N+3. Продукты реакций анализируют электрофорезом в агарозном геле. Одновременное обнаружение всех ампликонов свидетельствует о том, что отношение уровня экспрессии каждого гена к TIMP1 имеет значение для PLA2G2A выше трех, для PLTP выше одного, для MIA выше одной десятой, для SPP1 выше одной десятой, для SOX9 выше одной десятой, и опухоль диагностируют как миксому сердца.

Способ поясняется фигурами 1-4.

Фиг.1. Определение числа циклов ПЦР (N), при котором отчетливо виден амплифицируемый фрагмент кДНК гена TIMP1 для примера 1. В первом треке показан маркер длин фрагментов ДНК. Отмечена полоса, отвечающая длине фрагмента 200 пар оснований. В остальные треки нанесены аликвоты продуктов амплификации кДНК гена TIMP1. Для синтеза кДНК использована РНК опухоли из примера 1. Число циклов ПЦР 22, 24, 26, 28, 30. Фиксировано чило циклов, равное N=24.

Фиг.2. Измерение отношения уровня экспрессии генов PLA2G2A, PLTP, MIA, SPP1, SOX9 к TIMP1 для примера 1. Число циклов ПЦР 27 (24+3). кДНК синтезирована с использованием РНК опухоли из примера 1. Одновременное обнаружение амплифицируемых фрагментов для всех генов-маркеров свидетельствует о том, что отношение уровня экспрессии каждого гена к TIMP1 имеет значение для PLA2G2A выше трех для PLTP выше одного, для MIA выше одной десятой, для SPP1 выше одной десятой, для SOX9 выше одной десятой, и опухоль диагностируют как миксому сердца.

Фиг.3. Определение числа циклов ПЦР (N), при котором отчетливо виден амплифицируемый фрагмент кДНК гена TIMP1 для примера 2. В первом треке показан маркер длин фрагментов ДНК. Отмечена полоса, отвечающая длине фрагмента 200 пар оснований. В остальные треки внесены аликвоты продуктов амплификации кДНК гена TIMP1. Для синтеза кДНК использована РНК опухоли из примера 1. Число циклов ПЦР 22, 24, 26, 28, 30. Фиксировано число циклов, равное N=28.

Фиг.4. Измерение отношения уровня экспрессии генов PLA2G2A, PLTP, MIA, SPP1, SOX9 к TIMP1 для примера 2.

Число циклов ПЦР 31 (28+3). кДНК синтезирована с использованием РНК опухоли из примера 2. Обнаружение амплифицируемых фрагментов для PLTP, MIA, SPP1, SOX9 свидетельствует о том, что отношение уровня экспрессии каждого гена к TIMP1 имеет значение для PLTP выше одного, для MIA, SPP1, SOX9 выше одной десятой для каждого. Отсутствие фрагмента для PLA2G2A свидетельствует о том, что отношение для PLA2G2A меньше трех, что позволило диагностировать опухоль как не миксому сердца.

Предлагаемый способ реализован в следующих клинических наблюдениях.

Пример 1. Больная М., 59 лет, история болезни №554030, биопсия №9197-12/03, поступила в отдел хирургии сердца РНЦХ РАМН 11.05.2003 с диагнозом миксома правого предсердия. 15.05.2003 успешно выполнено удаление выявленной опухоли. Опухоль представляла собой студенистое образование, с гладкой поверхностью в несколько утолщенной капсуле, на разрезе однородного вида желеобразной консистенции, желтоватого цвета. При микроскопическом исследовании установлено, что ткань опухоли представлена преимущественно рыхлым межклеточным веществом, в котором располагаются клетки округлой, вытянутой или отростчатой формы, нередко образующие тяжи, окруженные базофильным матриксом. Имеются участки кровоизлияний, скопления коллагеновых волокон, очаговая и диффузная лимфоидная и лейкоцитарная инфильтрация. В основании - крупные толстостенные сосуды, участки склероза.

Патологогистологический диагноз - миксома сердца.

В опухоли определен уровень экспрессии генов PLA2G2A, PLTP, MIA, SPP1, SOX9 и TIMP1, затем отношение уровня экспрессии каждого гена к TIMP1 (фиг.1 и 2). Значения отношений оказались для PLA2G2A выше трех, для PLTP выше одного, для MIA выше одной десятой, для SPP1 выше одной десятой, для SOX9 выше одной десятой, и опухоль диагностирована как миксома сердца.

Пример 2. Больной 3., 10 лет, история болезни №552666, биопсия №8231-37/03. Поступил в отдел хирургии сердца 16.04.03 с предположительным диагнозом миксома левого желудочка. 12.15.03 успешно выполнено удаление новообразования овальной формы, размером 6×4×3 см. Поверхность его местами гладкая, местами с обрывками спаек, на разрезе ткань неоднородная: плотные белесоватые участки чередуются с кремовыми, напоминающими жировую клетчатку, и желеобразными. При микроскопическом исследовании опухоль состоит из беспорядочно перемешанных жировой, фиброзной, рыхлой соединительной, сосудистой ткани, мелких островков кроветворения, недифференцированной ткани типа мезенхимы - аморфной миксоматозной субстанции с полиморфными клетками звездчатой, овальной, веретенообразной формы и небольшим количеством коллагеновых волокон, сосудов синусоидного типа. В липоматозном и фиброзном компоненте отмечается клеточный и ядерный полиморфизм.

Патологогистологический диагноз: мезенхимома.

В опухоли определен уровень экспрессии генов PLA2G2A, PLTP, MIA, SPP1, SOX9 и TIMP1, затем отношение уровня экспрессии каждого гена к TIMP1 (фиг.3 и 4). Значения отношений для PLTP выше одного, для MIA, SPP1, SOX9 выше одной десятой. Значение отношения для PLA2G2A меньше трех, что позволило диагностировать опухоль как не миксому сердца. Это заключение определяет повышенную угрозу возникновения рецидива в будущем. В данном случае рецидив опухоли зарегистрирован через 6 месяцев.

Использование предлагаемого способа позволяет повысить точность диагностики миксомы сердца. Способ апробирован в отделе хирургии сердца РНЦХ РАМН у 14 больных. Он дал положительные результаты и найдет широкое применение в медицинской практике.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано для проведения дифференциальной диагностики опухолей сердца неясного генеза. Сущность изобретения состоит в том, что в исследуемой опухоли сердца определяют уровень экспрессии набора генов - экспрессионных маркеров PLA2G2A, PLTP, MIA, SPP1, SOX9, TIMP1, затем отношение уровня экспрессии каждого гена к TIMP1 и при значениях отношений для PLA2G2A выше трех для PLTP выше одного и для каждого из генов MIA, SPP1 и SOX9 выше одной десятой опухоль диагностируют как миксому сердца. Техническим результатом является повышение точности диагностики миксом сердца. 4 ил.

Способ диагностики миксомы сердца, включающий анализ опухоли, отличающийся тем, что в исследуемой опухоли сердца определяют уровень экспрессии набора генов - экспрессионных маркеров PLA2G2A, PLTP, MIA, SPP1, SOX9, TIMP1, затем отношение уровня экспрессии каждого гена к TIMP1 и при значениях отношений для PLA2G2A выше трех, для PLTP выше одного и для каждого из генов MIA, SPP1 и SOX9 выше одной десятой опухоль диагностируют как миксому сердца.