СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/48 C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам диагностики онкологических заболеваний.

В настоящее время в мире растет число больных со злокачественными новообразованиями различных органов и тканей. Эту ситуацию связывают с рядом причин: повышением общего радиационного фона Земли, ухудшением экологической обстановки и эндоэкологической среды, а также многих других, вызывающих снижение иммунитета организма и повышение способности трансформированных клеток к прогрессирующему росту.

Успех лечения онкологических больных во многом зависит от стадии, на которой выявлено заболевание. Однако известно, что выявлять больных на ранних стадиях развития онкологического заболевания чрезвычайно трудно, т.к., как правило, обращение онкологических больных к врачу связано с наличием у них появившихся жалоб (боли, кровотечение, деформация ткани и др.), свидетельствующих о уже развернутой клинической картине болезни. В связи с этим одной из главных проблем клинической онкологии является диагностика злокачественных опухолей в начальной стадии их развития, когда существующие методы лечения бывают наиболее эффективными.

Современная онкологическая наука располагает рядом методов скрининговой диагностики злокачественных новообразований, позволяющих судить о наличии или отсутствии опухоли в момент обследования. В частности, широкое распространение получила профилактическая маммография, проводимая с целью ранней диагностики злокачественных новообразований молочной железы у женского населения (A.G.Holleb. Review of Breast Cancer Screening Guidelines. Cancer Supplement, 1992; 69, с.1911-1912). Известен также метод цитологического скрининга злокачественных опухолей шейки матки (Guzick DS. Efficacy of screening for cervical cancer. A review. Am. J. Public Heath, 1978; 68, с.125-134.) и способ диагностики рака легкого путем определения концентрации нонадекановой кислоты в продуктах выделения (RU 2088926, 1997).

Однако использование большинства методов скрининговой диагностики направлено на выявление конкретного вида опухоли конкретного органа и не могут быть использованы при общей диагностике онкологии.

Известен многопараметрический способ диагностики злокачественных новообразований (RU 98112260, 2000), включающий определение времени продольной ядерной магнитной резонансной релаксации в сыворотке крови, а также проведение количественной оценки нарушения гомеостаза по данным биофизических, гематологических и биохимических анализов, по результатам которой судят о наличии злокачественного новообразования.

Недостатком этого способа является его техническая сложность, длительность, невозможность использования в клинических лабораториях больниц, трудность выявления ранней стадии злокачественного роста.

Известен способ выявления структурных неоднородностей в биологических тканях с помощью жидких кристаллов (патент РФ №2166194, 2001), в котором предложено срез ткани обрабатывать раствором жидкого нематического кристалла и при обнаружении не декорированных им тканевых участков диагностировать наличие злокачественной опухоли.

Недостатком этого способа является его высокая инвазивность, возможность выявления заболевания только на клинической стадии развития.

В настоящее время предполагают, что наиболее перспективными для общей диагностики онкологических заболеваний являются методы, основанные на определении опухолевых маркеров в биологических жидкостях организма, в частности в крови. Так, известен способ диагностики злокачественных опухолей человека, основанный на выявлении в крови обследуемого белков, специфичных для злокачественного роста (Короткоручко В.П. Осадочная реакция на рак при диагностике опухолевой болезни. - Киев.: Наукова думка, 1967). Для этого сыворотку крови выдерживают в растворе соляной кислоты, после чего осаждают белок азотной кислотой и добавляют к нему дистиллированную воду. Образующийся осадок белков сыворотки крови онкологических больных в отличие от здоровых людей не растворяется. Результат реакции, получившей название осадочной реакции на рак (ОРР), фиксируют по визуальному показателю. Этот способ является достаточно универсальным, однако он не обладает достаточной специфичностью, т.к. ОРР часто бывает положительной при воспалительных и других неопухолевых заболеваниях.

В качестве опухолевых маркеров с целью диагностики рака использовали также рецептор ά-интерлейкина 2 (RU 2144675, 2000), полинуклеотиды (RU 2174409, 2001) и некоторые другие вещества. В частности, перспективными являются методы диагностики онкологических заболеваний по присутствию в биологических жидкостях организма внеклеточных нуклеиновых кислот, специфических для клеток злокачественных новообразований (Y.M.Dennis Lo and Rossa W.K. Chiu The biology and diagnostic application of plasma RNA // Ann. N.Y. Acad. ScL, 2004, 1022: 135-139), или базирующиеся на обнаружении раковых клеток, экспрессирующих специфический ген (A.M.Gilbey, D.Bumett, R.E.Coleman, I.Holen The detection of circulating breast cancer cells in blood // J. Clin. Pathol. 2004; 57: 903-911). В качестве одного из вариантов предлагается (RU 2251696, 2005) определять концентрацию нуклеиновых кислот (НК), связанных с клеточной поверхностью форменных элементов крови и на основе данного показателя диагностировать наличие или отсутствие онкологического заболевания.

Наиболее близким по технической сути к заявляемому способу является способ диагностики рака желудка (RU 2204835, 2005), заключающийся в исследовании образца ткани пациента, содержащего клетки проблемной зоны, с целью определения в образце мРНК циклооксигеназы-2 или белка ЦОКС-2. Для этого общую РНК выделяли с помощью реагента RNAzol I (Tel-Test). Образец РНК денатурировали и переносили на нейлоновые мембраны, которые затем облучали УФ. Фрагменты очищенной кДНК-циклооксигеназы-1 (ЦОКС-1), ЦОКС-2 и глицеральальдегид-3-фосфат дегидрогеназы (ГАФДГ) метили, после чего очищали на ник-колонках. Тотальную РНК превращали в кДНКс помощью обратной транскриптазы Superscript II и олиго-dT или гек-сонуклеотидных праймеров (Life Technology). кДНК амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) с использованием специфических праймеров Цокс-2 в присутствии ДНК-полимеразы. Амплифицированную к ДНК окрашивали бромидом этидия и количественно определяли по результатам электрофореза на 2% геле агарозы с помощью камеры CCD высокого разрешения. Полученные результаты сопоставляли с данными, полученными при аналогичном исследовании здоровых тканей и заведомо раковых клеток, и на базе такого сопоставления диагностировали наличие или отсутствие онкологического заболевания.

Недостатком данного способа является ограниченная область применения в связи с отсутствием достоверных данных о наличии ЦОКС в других тканях организма, а также длительность и сложность анализа.

Технической задачей, решаемой авторами являлось создание более универсального и быстрого метода диагностики онкологических заболеваний, пригодного для выявления рака различных органов организма человека.

Технический результат был достигнут в результате обнаружения авторами в ходе исследований в опухолевых тканях мРНК гена Т (Brachyury), тогда как в изученных нормальных тканях человека ген Т либо не экспрессировался, либо его экспрессия была крайне незначительна по сравнению с экспрессией при наличии опухоли (тонкий кишечник, селезенка, яичко). Это позволило создать способ диагностики онкологических заболеваний, сущность которого состоит в анализе тканей организма человека и диагностики заболеваний при обнаружении в тканях мРНК гена T. Последовательность гена T(Brachyury) приведена на фиг.1.

Обнаружение мРНК гена Т осуществляется с помощью традиционных методов анализа мРНК, таких как дот-гибридизация, методы обратно-транс-криптазной, полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) и т.д. Лучшие результаты достигались при проведении детекции методами ОТ-ПЦР. В рамках ее осуществления, полученную известными способами кДНК пациента амплифицировали в присутствии праймеров, специфических к фрагменту мРНК гена Т. При этом в качестве прямого праймера использовали олигонуклеотид с последовательностью: 5'-GGGTGGCTTCTTCCTGGAAC -3' а в качестве обратного - 5'-TTGGAGAATTGTTCCGATGAG -3'.

Диагностику проводили следующим образом. Выделение тотальной РНК из опухолевых тканей проводили по методу Чиргвина (Chirgwin JM, Przybyla АЕ, MacDonald RJ, Rutter WJ. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease // Biochemistry. 1979 Nov 27;18(24):5294-9.). Для этого 1 г замороженной в жидком азоте ткани растирали в керамической ступке с жидким азотом, к ней добавляли 10 мл раствора, содержащего 5,5 М GuSCN, 50 мМ ацетата натрия, 50 мМ этилендиаминотетраацетата (ЭДТА), 0,5% лаурил саркозилата, 0,1М бета-меркаптоэтанола (из расчета 10 мл на 1 г ткани). Смесь оставляли при комнатной температуре до полного размораживания, после чего переносили в 15 мл пластиковые пробирки и центрифугировали в центрифуге MLW K23 13 минут при скорости 12000 оборотов в минуту. Затем переносили супернатант в пробирки и смешивали с 2,6 мл раствора, содержавшего 5,7 М CsCl, 25 мМ ацетат натрия, 50 мМ ЭДТА.

Полученную смесь наслаивали на 4 мл этого же раствора в пробирке для ротора SW41 Ti, после чего центрифугировали 16 часов при температуре 20°С и 28000 оборотов в минуту. Надосадочную жидкость сливали, пробы промывали 70% этанолом и подсушивали их при -20°С, после чего осадок растворяли в воде, обработанной диметилпирокарбонатом (ДПК). Концентрацию и чистоту выделенной РНК определяли на спектрофотометре Ultrospeg® 3100 pro. Чистоту РНК считали пригодной для работы при соотношении А₂₆₀/А₂₈₀≥1,7 (водный раствор). Далее проводили анализ качества РНК гель-электрофорезом, по соотношению 28s и 18s pPHK в 1% агарозном геле. Перед проведением электрофореза, к препаратам РНК, содержащим 1-2 мкг тотальной РНК (в объеме 5-10 мкл), добавляли додецил-сульфат натрия (SDS) до концентрации 0,3%. После чего пробы РНК денатурировали при 65°С в течение 10 минут, быстро охлаждали на льду, добавляли 0,1 объема от объема пробы 10-кратного буферного раствора, содержащего 50%-ный глицерин и 0,4%-ный бромфеноловый синий, и наносили на гель.

Электрофорез проводили в горизонтальных аппаратах в буфере ТАЕ (40 мМ Трис-ацетат; 2 мМ ЭДТА, рН 8,0; 0,5 мкг/мл бромистого этидия) при напряжении 5-14 В/см длины геля. Результат разделения РНК регистрировали в проходящем ультрафиолетовом свете трансиллюминатора (Macrovue, LKB, Швеция).

Синтез кДНК проводили с помощью набора Revert Aid® First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas). Для этого на льду смешивали 5 мкг тотальной РНК, 0,2 мкг гексануклеотидных праймеров и доводили объем смеси до 12 мкл водой. Для денатурации РНК смесь инкубировали 5 минут при 70°С и переносили на лед. Затем добавляли 4 мкл 5-кратного буфера, 1 мкл (20 ед) ингибитора рибонуклеаз RiboLock, 2 мкл смеси 10 мМ dNTP. После этого смесь инкубировали при 25°С в течение 5 минут и добавляли 1 мкл(200 ед) Revert Aid® M-MuLV обратной транскриптазы. Объем полученной смеси составлял 20 мкл. Реакционную смесь инкубировали 10 минут при 25°С, а затем 60 минут при 42°С. Далее реакцию останавливали прогреванием до 70°С в течение 10 минут и ставили на лед. Полученную кДНК хранили при -20°С до использования.

Для выявления самостоятельных транскриптов гена T(Brachyury) в тканях человека была проведена серия ПЦР-экспериментов на панелях кДНК из различных нормальных и опухолевых тканей.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в растворе, содержащем 2,5 мкл кДНК, 1-кратный ПЦР-буфер, MgCl₂ (4 mM), dNTP (200 µМ каждого), 0,4 µM каждого праймера и 1 единицу Taq ДНК-полимеразы в общем объеме 25 мкл при следующих условиях: 1 мин при 95°С, 35 циклов, включавших 30 сек при 95°С, 30 сек при 58°С и 40 сек при 72°С. В конце проводили достройку фрагментов в течение 5 мин при 72°С. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2% агарозе и прокрашивали бромистым этидием. Присутствие искомой мРНК в образце определяли по наличию продукта амплификации с размером 172 п.н.

Для проверки качества панелей кДНК ставили ПЦР с использованием праймеров к гену G3PDH (Прямой 5'- TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT -3' обратный 5'- CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC -3' Tm 68°С, 30 циклов, размер амплифицируемого фрагмента 983 п.о.).

На фиг.1 приведена последовательность гена T(Brachyury).

На фиг.2 показаны результаты ПЦР с праймерами, специфическими к гену Т (Brachyury), на панели кДНК нормальных тканей (Human МТС Panel I, Clontech).

На фиг.3 показаны результаты ПНР с праймерами, специфическими к гену T(Brachyury), на панели кДНК нормальных тканей (Human МТС Panel II, Clontech).

На фиг.4 показаны результаты ПЦР с праймерами, специфическими к гену T(Brachyury), на панели кДНК эмбриональных тканей (Human Fetal МТС Panel, Clontech).

На фиг.5 показаны результаты ПЦР с праймерами, специфическими к гену T(Brachyury), на панели кДНК тканей иммунной системы (Human Immune System МТС Panel, Clontech).

На фиг.6 показаны результаты ПЦР с праймерами, специфическими к гену T(Brachyury), на панели кДНК опухолевых тканей (BioChain).

На фиг.7 показаны результаты ПЦР с праймерами, специфическими к гену T(Brachyury), на панели кДНК из клинических образцов опухолевых тканей (Биомедицинский центр).

Полученные результаты показали, что заявляемый способ обладает большей широтой применения, занимает меньше времени и позволяет получать достаточно надежные и селективные результаты, что иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Диагностику проводили по вышеописанной методике. При постановке ПЦР на наборе кДНК из нормальных тканей человека Human МТС Panel 1 специфический фрагмент гена Brachyury не образовывался ни в одном образце (фиг.2). Амплификация T(Brachyury)-специфического фрагмента либо не наблюдалась вообще - образцы из панели иммунной системы (фиг.5) и панели эмбриональных тканей (фиг.4), либо наблюдался слабый генспецифический сигнал - на наборе кДНК из нормальных тканей Human МТС Panel 2 в ткани тонкого кишечника, селезенки и яичка (фиг.3).

Вместе с тем, анализ образцов кДНК из опухолей показал наличие сильного генспецифического сигнала мРНК T(Brachyury) в образцах злокачественных опухолей самого различного происхождения. В частности, на панели кДНК опухолевых тканей производства фирмы Biochain (США) сигналы наблюдаются на дорожках, соответствующих опухолям пищеварительной системы, почки, мочевого пузыря, легкого, опухолям мужской и женской репродуктивной системы (фиг.6), в клинических образцах опухолей мозговых оболочек, легких, молочной железы, яичников, яичек и лимфомах различного генеза (фиг.7)

Пример 2 (аналог). Детекция мРНК гена T(Brachyury) методом дот-гибридизации. В качестве пробы использовали двуцепочечный фрагмент кДНК гена Т, полученный с помощью ОТ-ПЦР. Мечение зонда для гибридизации радиоактивным фосфором [α-³²P] проводили с помощью набора HexaLabel^TM DNA Labeling Kit (Fermentas, Литва) согласно протоколу производителя. Полученный зонд хранили при -70°С до использования, но не более 3 дней.

Выделение и оценку качества РНК проводили с использованием технологии, описанной в описании. Для переноса РНК на мембрану брали по 5 мкг каждого образца РНК, разведенного в 10 мкл воды, и смешивали с 30 мкл денатурирующего раствора (660 мкл формамида, 210 мкл формальдегида, 130 мкл 10-кратного электрофорезного буфера MOPS pH 7,0), затем смесь инкубировали при 65°С в течение 5 минут и охлаждали на льду. Далее к смеси добавляли равный объем 20-кратного раствора SSC (3М NaCl, 0,3M цитрат натрия) и осуществляли точечный перенос РНК на смоченную в 10-кратном растворе SSC нейлоновую мембрану с помощью устройства для вакуумного переноса. После этого дважды промывали все точки 10-кратным раствором SSC и фиксировали РНК на мембране, облучая ее УФ-лучами на трансиллюминаторе в течение 3х минут. Мембрану помещали на 2 часа в 15 мл прегибридизационного раствора (0,5 М фосфат натрия рН 7,2, 7% SDS, 1 мМ ЭДТА рН 7,0) при температуре 68°С. Непосредственно перед использованием денатурировали гибридизационный зонд кипячением в течение 10 минут и последующим быстрым охлаждением на льду. Денатурированный зонд добавляли в прегибридизационный раствор и инкубировали 14 часов при температуре 68°С. Затем проводили следующие отмывки: один раз в 150 мл первого отмывочного раствора (1-кратный SSC и 1% SDS) в течение 10 минут при комнатной температуре и 3 раза в 150 мл второго отмывочного раствора (0,5-кратный SSC, 0,1% SDS), в течение 10 минут при 68°С. Далее мембрану сушили и экспонировали с рентгеновской пленкой в течение 48 часов при -70°С, после чего пленку проявляли по стандартной процедуре. По результатам гибридизации визуально анализировали силу сигнала в точках, соответствующих здоровым тканям и в точках, соответствующих опухолевым тканям.

Для анализа были взяты клинические образцы опухолей, описанные в примере 1. При их изучении были обнаружены сигналы гибридизации в образцах 7Т (рак яичка), 14Т (рак легкого), 17Т (рак бронха), 2 IT, 246T, 250Т (рак молочной железы), 5Т, 6Т(рак яичника), 63Т, 93Т (опухоли головы/шеи), 30Т, 31Т, 82Т, 92Т, 113Т (лимфомы).

Сопоставление результатов детекции мРНК гена T(Brachyury) обоими методами показало их сходство, однако метод-аналог менее чувствителен и более длителен - требует несколько дней, в то время, как заявляемый метод позволяет получить результат через 8-10 часов.

Приведенные выше экспериментальные данные свидетельствуют о том, что заявляемый способ может быть с высокой степенью надежности использован для выявления онкологических заболеваний различных органов.

Изобретение относится к области медицины, в частности к способу диагностики онкологических заболеваний. Способ диагностики онкологических заболеваний, включающий в себя исследование образца, взятого у пациента, на выявление онкологического маркера, мРНК гена Т (Brachyury), онкологическое заболевание диагностируется при обнаружении сильного генспецифического сигнала мРНК гена Т (Brachyury). Вышеописанный способ с высокой степенью надежности выявляет онкологические заболевания различных органов и позволяет получить результат в короткие сроки. 2 з.п. ф-лы, 7 ил.

1. Способ диагностики онкологических заболеваний, включающий в себя исследование образца, взятого у пациента, на выявление онкологического маркера и диагностирование онкологического заболевания, отличающийся тем, что из исследуемой ткани выделяют общую РНК, определяют в ней наличие мРНК гена Т (Brachyury), последовательность которого приведена на рис.1, и при обнаружении сильного генспецифического сигнала мРНК гена Т (Brachyury) диагностируют онкологическое заболевание.

2. Способ диагностики онкологических заболеваний по п.1, отличающийся тем, что после выделения общей РНК дополнительно получают кДНК и амплификацируют ее с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами, специфическими к фрагменту нуклеотидной последовательности гена Т (Brachyury), последовательность которого приведена на рис.1, с последующим анализом амплифицированного продукта на наличие сильного генспецифического сигнала мРНК гена Т (Brachyury), при обнаружении которого диагностируют онкологическое заболевание.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что амплификацию проводят с использованием прямого праймера с последовательностью 5'-GGGTGGCTTCTTCCTGGAAC -3' и обратного праймера с последовательностью 5'-TTGGAGAATTGTTCCGATGAG -3'.