ЧЕЛОВЕЧЕСКОЕ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ AILIM, КОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ МОЛЕКУЛЫ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА, И ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2005 года по МПК C07K16/24 C07K14/00 C12P21/08 C12N15/13 C12N15/63 A61K39/395 A61P37/00 

Область техники

Настоящее изобретение связано с человеческими антителами, которые связываются с AILIM (активационно индуцибельной иммуномодуляторной молекулой лимфоцитов, также называемой ICOS (индуцибельным костимулятором); с человеческими моноклональными антителами, которые связываются с AILIM, или их частью; с ДНК, кодирующей указанное человеческое моноклональное антитело или его часть; с клетками (включая генетически рекомбинантные клетки), продуцирующими указанное человеческое моноклональное антитело или его часть; с человеческим моноклональным антителом или его частью, продуцируемым указанными генетически рекомбинантными клетками; с фармацевтической композицией, содержащей указанное человеческое моноклональное антитело или его часть; с фармацевтической композицией, содержащей антитело против AILIM, для лечения заболеваний, связанных с аллергией замедленного типа; со способом идентификации, количественного определения или анализа веществ, которые связываются с AILIM или лигандом AILIM, и с набором, используемым в указанном способе.

Предшествующий уровень техники

Живой организм млекопитающих обладает системой иммунных ответов, которые исключают патогенные микроорганизмы (вирусы, бактерии, паразиты и т.д.) или чужеродные тела (и те, и другие в дальнейшем будут называться «антигенами), которые инвазируют живой организм. Одна из них называется системой природного иммунного ответа, другая - системой приобретенного иммунного ответа. Первая представляет собой механизм исключения, включающий в себя фагоцитоз при участии фагоцитов (полиморфноядерных лейкоцитов, моноцитов, макрофагов и т.д.), атаку при участии естественных киллеров (NK-клетки) и неспецифическое узнавание, такое как опсонизация антигена комплементом. Вторая, система приобретенного иммунного ответа, представляет собой механизм исключения при участии лимфоцитов (главным образом Т-клеток и В-клеток), в котором специфичность к антигену приобретается (в частности, активированными лимфоцитами). В-клетки, которые приобретают специфичность к антигену, атакуют антиген, существующий вне клеток в процессе продуцирования антител, специфичных к указанному антигену. Т-клетки, которые приобретают специфичность к антигену (а именно, Т-клетки), разделяются на хелперные Т-клетки и цитотоксические Т-клетки (цитотоксические лимфоциты, CTL). Хелперные Т-клетки регулируют дифференцировку В-клеток и продукцию антител, и разрушают антиген, кооперированный с фагоцитами. Вторые же, цитотоксические лимфоциты, CTL, сами атакуют инфицированные вирусом клетки и т.д. (Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "Bio Science Term Library, Immunity", Yodosha, pp.14-17 (1995)).

Указанное приобретение Т-клетками антигеноспецифичности (то есть активация Т-клеток) инициируется посредством узнавания Т-клетками антигена, представленного антигенпредставляющими клетками (АРС), такими как макрофаги, В-клетки или дендритные клетки. Антигенпредставляющие клетки процессируют таким образом включенный антиген и представляют таким образом процессированные антигены - посредством их связывания - главному комплексу гистосовместимости (МРС). Т-клетки получают первичный сигнал активации клеток (или приобретения специфичности) путем узнавания процессированных антигенов, представленных на поверхности антигенпредставляющих клеток, посредством образования комплекса между Т-клеточным рецептором (TcR) и СD3-антигеном, существующим на поверхности клеточной мембраны (комплекс TcR/CD3).

Однако опосредованный комплексом TcR/CD3 первичный сигнал сам по себе не может достаточным образом активировать Т-клетки и приводит к ареактивности или клональной анергии, так что клетки не могут реагировать ни на какую стимуляцию, полученную после этого. Для того чтобы активировать Т-клетки, для их дифференцировки в антигенспецифические Т-клеточные клоны и для их пролиферации необходим аутокрин интерлейкина-2 (IL-2). То есть активация Т-клеток, сопровождаемая продукцией цитокинов, таких как IL-2, требует вторичного сигнала, следующего за первым сигналом, опосредованным комплексом TcR/CD3. Такой вторичный сигнал называется костимулирующим сигналом.

Т-клетки получают указанный вторичный сигнал и передают его клеткам путем взаимодействия (клеточная адгезия) с молекулами, отличными от МНС, на антигенпредставляющих клетках, через молекулы, отличные от комплекса TcR/CD3 на поверхности Т-клеток.

Хотя отчасти механизм передачи вторичного сигнала между антигенпредставляющими клетками и лимфоцитами, такими как Т-клетки, в деталях не выяснен, исследования, проведенные до сегодняшнего дня, выявили то обстоятельство, что важным фактором для передачи вторичного сигнала является взаимодействие CD28 (также называемого Тр44, Т44, или 9.3-антигеном), который представляет собой молекулу клеточной поверхности, экспрессируемую главным образом на Т-клетках и клетках тимуса, с CD80 (называемым также В7-1, В7, ВВ1, или В7/ВВ1), который представляет собой молекулу клеточной поверхности, экспрессируемую на антигенпредставляющих клетках (макрофагах, моноцитах, дендритных клетках и т.д.), и с CD86 (называемым также В7-2, или В70), который также представляет собой молекулу клеточной поверхности, экспрессируемую на антигенпредставляющих клетках (то есть клеточная адгезия в результате связывания этих молекул между собой). Более того, экспериментально было установлено, что взаимодействие антигена-4, ассоциированного с цитолитическими Т-лимфоцитами (CTLA-4), экспрессия которого, как полагают, усиливается, в зависимости от вторичного сигнала, под действием CD80 (В7-1) и CD86 (В7-2) (то есть клеточной адгезии в результате связывания между указанными молекулами), тоже играет важную роль в регуляции активации Т-клеток под действием вторичного сигнала. Иными словами, регуляция активации Т-клеток путем передачи вторичного сигнала включает в себя по меньшей мере взаимодействие между CD28 и CD80/CD86, усиление экспрессии CTLA-4, которая, как полагают, зависит от взаимодействия, и взаимодействие между CTLA-4 и CD80/CD86.

О CD28 известно, что он является молекулой-костимулятором, передающей вторичный сигнал (костимулирующий сигнал), необходимый для активации Т-клеток и для того, чтобы избежать анергии (реактивности). Вторичный сигнал, переданный путем связывания указанной молекулы с костимулирующими молекулами, CD80 (В7-1) и CD86 (В7-2), на антигенпредставляющих клетках (клеточная адгезия за счет связывания этих молекул друг с другом) стабилизирует мРНК цитокинов типа Th1 и, следовательно, стимулирует продукцию Т-клетками большого количества цитокинов типа Th1, таких как IL-2, IFNγ и TNFα. Экспрессия CTLA-4 вызвана первичным сигналом, переданным через TcR/CD3, и эта экспрессия также усилена вторичным сигналом, переданным путем связывания друг с другом CD28 и CD80. Обнаружено, что CTLA-4 получает указанные сигналы, чтобы действовать в качестве ингибитора Т-клеточной функции, что противоположно активации Т-клеток под действием вторичного сигнала, переданного посредством CD28.

У человека CD28 и CTLA-4 представляют собой гликопротеины, молекулярная масса которых соответствует 44 кДа и 41-43 кДа, соответственно. Оба этих гликопротеина имеют иммуноглобулиноподобный домен, принадлежат суперсемейству иммуноглобулинов и обладают обеими функциями, т.е. являются как молекулами клеточной адгезии, так и передающими сигнал молекулами.

Человеческий CD28 образует гомодимер с дисульфидной связью, в то время как CTLA-4 существует в виде мономера. Оба гена - ген CD28 и ген CTLA-4 - локализованы в области "2q33" на хромосоме человека и в локусе "1С" на хромосоме мыши и состоят из четырех (4) экзотов. CD28 и CTLA-4 человека состоят из 220 и 223 аминокислот, соответственно, включая лидерные последовательности, и аминокислотная гомология между ними составляет от 20 до 30%.

Лигандами для CD28 и CTLA-4 у человека и мыши являются CD80 (В7-1) и CD86 (В7-2). CTLA-4 обладает примерно в двадцать (20) раз большей аффинностью к обоим лигандам, чем CD28. Было выяснено, что структура аминокислотной последовательности "MYPPPY (Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr)", консервативная от вида к виду животных, играет важную роль в связывании CD28 и CTLA-4 с CD80 (В7-1). Сообщалось также, что при стимуляции CD28 киназа PI3 (фосфоинозитид-3-киназа, PI3K) ассоциируется с фосфорилированным тирозиновым остатком в частичной последовательности "YMNM (Tyr-Met-Asn-Met)" CD28 и что CD28 играет важную роль во внутриклеточной передаче сигнала через эту "YxxM"-структуру. Более того, сообщалось также, что CTLA-4 также имеет последовательность, представленную как "YxxM," то есть "YVKM (Tyr-Val-Lys-Met)", в своей цитоплазматической области и что после стимуляции CTLA-4 происходит ассоциация SYP с этой последовательностью.

CD28 экспрессируется, в частности, в тимоцитах и Т-лимфоцитах периферической крови, а CTLA-4 экспрессируется, в частности, в активированных Т-клетках (Cell Engineering: SUPPLEMENT, "Handbook of Adhesion Molecule", Shujunsha, pp.93-102 (1994); ibid. pp.120-136; Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "BIO SCIENCE Term Library, Immunity", Yodosha, pp.94-98 (1995); Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "BIO SCIENCE Term Library, Intracellular Signal Transduction", Yodosha, pp.58-59 (1997); Nihon Rinsho, Vol.55, No.6, pp.215-220 (1997)).

Таким образом, была выяснена важная роль взаимодействий между множеством молекул, таких как костимуляторные молекулы (CD28, CD80 (В7-1), CD86 (В7-2) и т.д.), и их кооперации с CTLA-4, в регуляции функции Т-клеток (активация и ингибирование функции Т-клеток), и это привлекло внимание к взаимосвязи между указанными молекулами и заболеваниями и к возможности лечения заболеваний путем регуляции функции этих молекул.

Как было сказано выше, хотя живой организм (сам) активирует свою систему приобретенного иммунитета в ответ на антигены, которые являются чужеродными организмами для данного организма, он обладает также и иммунологической толерантностью, с тем, чтобы не проявлять иммунной реакции против своего собственного компонента (аутоантиген). Если по какой-либо причине иммунологическая толерантность нарушается, возникает иммунный ответ на аутоантиген, аутогенреактивные Т-клетки активируются в результате того же самого механизма, который обсуждался выше, и возникает аномальное состояние иммунитета, в результате чего возникают различные аутоиммунные заболевания.

Иными словами, поскольку нестимулированные антигенпредставляющие клетки (АРС) в нормальных тканях не экспрессируют костимуляторные молекулы, когда иммунная система живого организма в норме, Т-клетки находятся в ареактивном состоянии для поддержания иммунологической толерантности даже в том случае, если существуют аутоантиген-реактивные Т-клетки. Было выдвинуто предположение, что в аномальном состоянии иммунитета в результате избыточной по сравнению с нормой и непрерывной экспрессии биостимуляторных молекул активируется большее количество аутоантиген-реактивных Т-клеток, что и является причиной аутоиммунных заболеваний.

С этой точки зрения, было предпринято множество попыток лечения различных аутоиммунных заболеваний путем модуляции передачи костимуляторных сигналов, например, передачи указанного выше сигнала между CD28/CTLA-4 и CD80/CD86.

В результате указанных попыток все еще не удалось выяснить в деталях механизм Т-клеточной активации путем взаимодействия между костимуляторными молекулами и связанными с ними молекулами. В указанном механизме могут участвовать и другие, неизвестные, молекулы.

В настоящее время идентифицирована новая костимуляторная молекула, сходная с описанными выше молекулами "CD28" и "CTLA-4", с которой связывают перенос вторичного сигнала (костимуляторного сигнала), необходимого для активации лимфоцитов, таких как Т-клетки, и функциональную регуляцию, сцепленную с указанным сигналом активированных лимфоцитов, таких как Т-клетки. Указанная молекула была обозначена как AILIM (активационно индуцибельная иммуномодуляторная молекула лимфоцитов) (у человека, мышей и крыс: Int. Immunol., Vol.12, No.1, р.51-55, 2000), называемая также ICOS (индуцибельным костимулятором); (у человека: Nature, Vol.397, No.6716, р.263-266, 1999)).

С другой стороны, новые молекулы, названные B7h, B7RP-1, GL50 или LICOS, которые являются лигандами (AILIM-лиганды), взаимодействующими с указанной костимуляторно передающей молекулой AILIM (ICOS), были идентифицированы совсем недавно (Nature, Vol.402, No.6763, pp.827-832, 1999; Nature Medicine, Vol.5, No.12, pp.1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol.164, pp.1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol.10, No.6, pp.333-336, 2000).

Идентификация новых молекул указанных двух типов, то есть AILIM (ICOS) и B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS), в качестве передающего сигнального пути для костимуляторного сигнала, необходимого для указанной выше активации лимфоцитов, таких как Т-клетки, и регуляции функции активированных Т-клеток, показала, что это новый, третий путь, (осуществляемый) через взаимодействие AILIM (ICOS) и B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS), помимо известных первого и второго сигнального путей, которые являются уже известными путями передачи между CD28 и CD80 (B7-1/CD86 (В7-2) и между CTLA4 и CD80 (B7-1/CD86 (В7-2).

Исследования биологических функций указанных новых молекул, функциональной регуляции лимфоцитов, таких как Т-клетки, через указанный третий (путь) передачи костимуляторного сигнала указанными молекулами и взаимосвязь между этим новым (путем) передачи сигнала и заболеваниями находится в стадии развития (J. Immunol., 166(1), pp.1, 2001; J. Immunol., 165(9), pp.5035, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun., 276 (1), pp.335, 2000; Immunity, 13 (1), pp.95, 2000; J. Exp. Med., 192 (1), pp.53, 2000; Eur. J. Immunol., 30(4), pp.1040, 2000; WO 01/15732).

Описание изобретения

Объектом настоящего изобретения является, в частности, выявление биологических функций новой молекулы AILIM, которая, наподобие "CD28" и "CTLA-4", считается молекулой, которая передает вторичный сигнал (костимуляторный сигнал), существенный для активации лимфоцитов, таких как Т-клетки, и которая осуществляет контроль функций активированных лимфоцитов, таких как активированные Т-клетки, через указанный сигнал; выявление взаимосвязи между экспрессией AILIM и заболеваниями, и обеспечение способа и фармацевтического средства, которое ингибирует развитие различных заболеваний, зависящих от характера экспрессии AILIM, или которое лечит заболевание путем контролирования биологических функций AILIM с помощью медицинских и фармацевтических методов (например, с использованием лекарственного средства, такого как антитело и низкомолекулярное соединение).

Для достижения описанной выше цели авторы настоящего изобретения активно проводили исследования с использованием антител человека (в частности, моноклональных антител человека) против молекул AILIM млекопитающих (в частности, AILIM человека), и в результате, путем иммунизации трансгенных мышей, полученных с помощью техники генетической рекомбинации, с тем, чтобы получить антитела человека (в комплексе) с AILIM (в частности, фракции клеточной мембраны клеток, экспрессирующих AILIM человека), впервые в мире достигли возможности получения различных моноклональных антител, которые связываются с AILIM человека, в частности, таких, которые связываются с AILIM человека, которые осуществляют передачу сигнала, опосредованного AILIM человека.

Поскольку антитела (в частности, моноклональные антитела) согласно изобретению получены у человека, они вообще не вызывают у хозяина какой-либо бурной реакции иммунного отторжения в силу иммуногенности против человека, НАМА (человеческая антимышиная антигенность), что представляет собой очень серьезную проблему (побочный эффект) в терапии, при которой в качестве фармацевтических средств используются антитела, включающие в себя антитела, полученные у млекопитающих, не являющихся человеком, таких как мыши, и, таким образом, драматически повышают значимость антитела в качестве лекарственного средства.

Следовательно, человеческие антитела (в частности, моноклональные антитела человека), которые связываются с молекулами AILIM млекопитающих (в частности, AILIM человека), согласно данному изобретению, и фармацевтические композиции, содержащие указанные человеческие антитела (в частности, моноклональные антитела человека), являются полезными в качестве лекарственных средств для регуляции - при этом не вызывающих иммунное отторжение у хозяина благодаря НАМА - различных физиологических реакций, связанных с передачей костимуляторного сигнала AILIM-экспрессирующим клеткам, опосредованного AILIM (например, пролиферация AILIM-экспрессирующих клеток, продукция цитокинов AILIM-экспрессирующими клетками, иммуноцитолиз или апоптоз AILIM-экспрессирующих клеток и активность, связанную с индукцией антитело-зависимой цитотоксичности AILIM-экспрессирующих клеток, и т.д.), и/или являются полезными также в качестве лекарственных средств для супрессии и предотвращения развития симптомов и/или прогрессирования различных заболеваний, связанных с передачей сигнала, опосредованного указанной молекулой AILIM, и в качестве лекарственных средств для лечения или профилактики указанного заболевания.

Фармацевтические композиции согласно изобретению, в частности, могут контролировать (тормозить или стимулировать) пролиферацию AILIM-экспрессирующих клеток или продукцию цитокина (например, интерферона γ или интерлейкина 4 и т.д.) AILIM-экспрессирующими клетками, создавая таким образом возможность для суперссии различных патологических состояний и лечения или предотвращения различных заболеваний, вызываемых различными физиологическими явлениями, связанными с передачей сигнала, опосредованной AILIM.

Применение фармацевтических композиций согласно изобретению дает возможность вызывать супрессию, предотвращение и/или лечение, например, различных заболеваний (например, ревматоидного артрита, множественного склероза, аутоиммунного тиреоидита, аллергических контактных дерматитов, хронических воспалительных дерматозов, таких как плоский лишай, системная эритематозная красная волчанка, инсулинозависимый сахарный диабет, псориаз и т.д.), классифицируемых как аутоиммунные или аллергические заболевания (в частности, аутоиммунное заболевание и аллергия замедленного типа, вызываемые клеточным иммунитетом); артропатия (например, ревматоидный артрит (RA) и остеоартрит (ОА)), воспаление (например, гепатит); реакция трансплантат против хозяина (РТПХ); заболевание трансплантат против хозяина (ЗТПХ); иммунное отторжение, сопровождающее трансплантацию (гомопластика или гетеропластика) ткани (таких тканей как кожа, роговица, кость и т.д.) или органа (печени, сердца, легкого, почки, поджелудочной железы и т.д.); иммунный ответ, запускаемый чужеродным антигеном или аутоантигеном (например, продукция антител против указанного антигена, клеточная пролиферация, продукция цитокинов), и заболевания, возможно, вызываемые в результате аномальной кишечной иммунности (в особенности воспалительными заболеваниями кишечника (в частности, клональное заболевание и язвенный колит) и алиментарная аллергия).

Кроме того, в области супрессии/лечения иммунного отторжения, сопровождающего трансплантацию указанных выше тканей и органов можно усилить супрессивный эффект на отторжение трансплантата известных иммунодепрессантов путем использования фармацевтической композиции согласно изобретению в сочетании с указанными лекарственными средствами, которые используются в лечении для супрессии иммунного отторжения такого рода трансплантатов.

Более того, фармацевтическая композиция согласно изобретению может применяться для лечения или предотвращения любых воспалительных заболеваний, в отношении которых показаны различные стероиды в качестве противовоспалительных агентов.

Фармацевтическая композиция согласно изобретению может применяться в случае воспалительного заболевания, например воспаления, сопровождающего различные артриты (например, ревматоидный артрит, остеоартрит), пневмонию, гепатиты (включая вирусный гепатит), воспаления, сопровождающего инфекционные заболевания, воспалительное заболевание кишечника, кишечный энтерит, нефрит (воспаление, сопровождающее гломерулонефрит, нефрофиброз), гастрит, ангиит, панкреатит, перитонит, бронхит, миокардит, церебрит, воспаления при повреждении от постишемической реперфузии (повреждение при миокардиальной ишемической репер фузии), присоединившегося к иммунному отторжению воспаления после трансплантации ткани и органа, ожога, различных кожных воспалений (псориаз, аллергический контактный дерматит, плоский лишай, который является хроническим воспалительным кожным заболеванием), воспаления при множественной недостаточности органов, воспаления после проведения РТСА или PTCR и воспаления, сопровождающего артериосклероз, и аутоиммунный тиреоидит.

Кроме того, используя способ идентификации веществ, которые связываются с AILIM или AILIM-лигандом, который является одним из методов согласно настоящему изобретению, можно обеспечить скрининг для отбора фармацевтических средств (химических синтетических соединений или антител), обладающих потенциальной активностью для лечения различных заболеваний путем связывания с AILIM или AILIM-лигандами с целью регуляции передачи сигнала, опосредованной их взаимодействием.

Настоящее изобретение в основном является изобретением, описываемым в последующих пунктах с (1) по (108).

(1) Человеческое антитело, которое связывается с AILIM.

(2) Человеческое антитело по пункту (1), где указанная AILIM получена у человека.

(3) Человеческое моноклональное антитело, которое связывается с AILIM, или его часть.

(4) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (3), где указанная AILIM получена у человека.

(5) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пунктам (3) или (4), где указанное человеческое моноклональное антитело обладает активностью по ингибированию передачи сигнала в клетку, опосредуемой AILIM.

(6) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (5), где указанная активность по ингибированию передачи сигнала соответствует либо (а), либо (b) из нижеследующих:

(a) активности по ингибированию пролиферации AILIM-экспрессирующих клеток или

(b) активности по ингибированию продукции цитокинов из AILIM-экспрессирующих клеток.

(7) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (6), где указанный цитокин является одним из цитокинов, продуцируемых Т-клетками типа Тh1 или Th2.

(8) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (7), где указанный цитокин является интерфероном γ или интерлейкином 4.

(9) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (5), где указанное моноклональное антитело обладает активностью по предотвращению смешанной реакции лимфоцитов.

(10) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (3) или (4), где указанное моноклональное антитело обладает активностью, связанной с индукцией передачи в клетку сигнала, опосредованного AILIM.

(11) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (10), где указанная активность, связанная с индукцией передачи сигнала, представляет собой (а) или (b) из нижеследующих:

(a) активность по индукции пролиферации AILIM-экспрессирующих клеток или

(b) активность по индуцированию продукции цитокинов из AILIM-экспрессирующих клеток.

(12) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (11), где указанный цитокин является одним из цитокинов, продуцируемых Т-клетками типа Th1 или Th2.

(13) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (12), где указанный цитокин является интерфероном γ или интерлейкином 4.

(14) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (3) или (4), где указанное моноклональное антитело обладает активностью, связанной с индукцией антителозависимой цитотоксичности в отношении AILIM-экспрессирующих клеток, и/или иммунного лизиса клеток или апоптоза AILIM-экспрессирующих клеток.

(15) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (3) или (4), где константа скорости связывания (ka) между указанным моноклональным антителом и AILIM составляет 1.0×10³ (1/М. сек) или более.

(16) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (15), где указанная константа скорости связывания (ka) составляет 1.0×10⁴ (1/М. сек) или более.

(17) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (16), где указанная константа скорости связывания (ka) составляет 1.0×10⁵ (1/М. сек) или более.

(18) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (3) или (4), где константа скорости диссоциации (kd) между указанным моноклональным антителом и AILIM составляет 1.0×10^-3 (1/сек) или менее.

(19) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (18), где указанная константа скорости диссоциации (kd) составляет 1.0×10^-4 (1/сек) или менее.

(20) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (19), где указанная константа скорости диссоциации (kd) составляет 1.0×10^-5 (1/сек) или менее.

(21) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (3) или (4), где константа диссоциации (Kd) между указанным моноклональным антителом и AILIM составляет 1.0×10^-6 (М) или менее.

(22) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (21), где указанная константа диссоциации (Kd) составляет 1.0×10^-7 (М) или менее.

(23) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (22), где указанная константа диссоциации (Kd) составляет 1.0×10^-8 (М) или менее.

(24) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (23), где указанная константа диссоциации (Kd) составляет 1.0×10^-9 (М) или менее.

(25) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (4), где V-область ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи указанного моноклонального антитела, получена либо из сегмента 1-02, либо из сегмента 3-13 V-гена тяжелой цепи иммуноглобулина человека.

(26) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (4), где V-область ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи указанного моноклонального антитела, получена либо из сегмента L5, либо из сегмента А27 V-гена легкой цепи иммуноглобулина человека.

(27) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (25) или (26), где V-область ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи указанного моноклонального антитела человека, получена либо из сегмента 1-02, либо из сегмента 3-13 V-гена тяжелой цепи иммуноглобулина человека, и где V-область ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи указанного моноклонального антитела человека, получена либо из сегмента L5, либо из сегмента А27 V-гена легкой цепи иммуноглобулина человека.

(28) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (27), где V-область ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи указанного моноклонального антитела человека, получена из сегмента 1-02 V-гена тяжелой цепи иммуноглобулина человека, а V-область ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи указанного моноклонального антитела человека, получена из сегмента L5 V-гена легкой цепи иммуноглобулина человека.

(29) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (27), где V-область ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи указанного моноклонального антитела человека, получена из сегмента 3-13 V-гена тяжелой цепи иммуноглобулина человека, а V-область ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи указанного моноклонального антитела человека, получена из сегмента А27 V-гена легкой цепи иммуноглобулина человека.

(30) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (4), где вариабельная область тяжелой цепи указанного моноклонального антитела человека имеет аминокислотную последовательность, определяемую в любом из следующих пунктов (a)-(f):

(a) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 20 до 117 последовательности SEQ ID NO: 28,

(b) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 20 до 117 последовательности SEQ ID NO: 28, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены,

(c) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 20 до 116 последовательности SEQ ID NO: 32,

(d) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 20 до 116 последовательности SEQ ID NO: 32, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены,

(e) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 20 до 116 последовательности SEQ ID NO: 36, или

(f) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 20 до 116 последовательности SEQ ID NO: 36, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены.

(31) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (4), где полипептид тяжелой цепи указанного моноклонального антитела человека имеет аминокислотную последовательность, определяемую в любом из следующих пунктов (a)-(f):

(a) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 20 до 470 последовательности SEQ ID NO: 28,

(b) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 20 до 470 последовательности SEQ ID NO: 28, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены.

(c) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 20 до 470 последовательности SEQ ID NO: 32,

(d) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 20 до 470 последовательности SEQ ID NO: 32, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены.

(e) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 20 до 470 последовательности SEQ ID NO: 36, или

(f) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 20 до 470 последовательности SEQ ID NO: 36, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены.

(32) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (4), где вариабельная область легкой цепи указанного моноклонального антитела человека имеет аминокислотную последовательность, определяемую в любом из следующих пунктов (a)-(f):

(a) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 23 до 116 последовательности SEQ ID NO: 30,

(b) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 23 до 116 последовательности SEQ ID NO: 30, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены,

(c) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 21 до 116 последовательности SEQ ID NO: 34,

(d) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 21 до 116 последовательности SEQ ID NO: 34, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены,

(e) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 21 до 116 последовательности SEQ ID NO: 38, или

(f) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 21 до 116 последовательности SEQ ID NO: 38, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены.

(33) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (4), где полипептид легкой цепи указанного моноклонального антитела человека имеет аминокислотную последовательность, определяемую в любом из следующих пунктов (a)-(f):

(a) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 23 до 236 последовательности SEQ ID NO: 30,

(b) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 23 до 236 последовательности SEQ ID NO: 30, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены,

(c) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 21 до 236 последовательности SEQ ID NO: 34,

(d) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 21 до 236 последовательности SEQ ID NO: 34, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены,

(e) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 21 до 236 последовательности SEQ ID NO: 38, или

(f) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислоты в положениях от 21 до 236 последовательности SEQ ID NO: 38, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены.

(34) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (4), где указанное человеческое моноклональное антитело имеет следующие характеристики (а) и (b):

(а) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, включающую в себя аминокислотную последовательность от аминокислоты 20 до 117 согласно последовательности SEQ ID NO: 28, и

(b) вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, включающую в себя аминокислотную последовательность от аминокислоты 23 до 116 согласно последовательности SEQ ID NO: 30.

(35) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (4), где указанное человеческое моноклональное антитело имеет следующие характеристики (а) и (b):

(a) полипептид тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность от аминокислоты 20 до 470 согласно последовательности SEQ ID NO: 28 и

(b) полипептид легкой цепи имеет аминокислотную последовательность от аминокислоты 23 до 236 согласно последовательности SEQ ID NO: 30.

(36) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (4), где указанное человеческое моноклональное антитело имеет следующие характеристики (а) и (b):

(a) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность от аминокислоты 20 до 116 согласно последовательности SEQ ID NO: 32, и

(b) вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность от аминокислоты 21 до 116 согласно последовательности SEQ ID NO: 34.

(37) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (4), где указанное человеческое моноклональное антитело имеет следующие характеристики (а) и (b):

(a) полипептид тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность от аминокислоты 20 до 470 согласно последовательности SEQ ID NO: 32, и

(b) полипептид легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность от аминокислоты 21 до 236 согласно последовательности SEQ ID NO: 34.

(38) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (4), где указанное человеческое моноклональное антитело имеет следующие характеристики (а) и (b):

(a) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность от аминокислоты 20 до 116 согласно последовательности SEQ ID NO: 36, и

(b) вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность от аминокислоты 21 до 116 согласно последовательности SEQ ID NO: 38.

(39) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (4), где указанное человеческое моноклональное антитело имеет следующие характеристики (а) и (b):

(а) полипептид тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность от аминокислоты 20 до 470 согласно последовательности SEQ ID NO: 36, и

(b) полипептид легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность от аминокислоты 21 до 236 согласно последовательности SEQ ID NO: 38.

(40) Человеческое моноклональное антитело или его часть по любому из пунктов (3)-(29), где указанное человеческое моноклональное антитело представляет собой моноклональное антитело, полученное из трансгенного млекопитающего, не являющегося человеком, способного продуцировать человеческие антитела.

(41) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (40), где указанное человеческое моноклональное антитело получено путем иммунизации трансгенного млекопитающего, не являющегося человеком, способного продуцировать человеческое антитело AILIM-экспрессирующими клетками, мембранные фракции, полученные из указанных клеток, цельные молекулы, составляющие AILIM или часть ее, или гены, кодирующие AILIM или часть ее.

(42) Человеческое моноклональное антитело или его часть по пункту (40) или (41), где указанное трансгенное млекопитающее является трансгенной мышью.

(43) ДНК или ее часть, кодирующая полипептид, выбранный из группы, состоящей из нижеследующих пунктов (а)-(f):

(а) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность от аминокислоты 20 до 117 согласно последовательности SEQ ID NO: 28,

(b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность от аминокислоты 23 до 116 согласно последовательности SEQ ID NO: 30,

(c) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность от аминокислоты 20 до 116 согласно последовательности SEQ ID NO: 32,

(d) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность от аминокислоты 21 до 116 согласно последовательности SEQ ID NO: 34,

(e) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность от аминокислоты 20 до 116 согласно последовательности SEQ ID NO: 36, и

(f) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность от аминокислоты 21 до 116 согласно последовательности SEQ ID NO: 38.

(44) ДНК или ее часть, кодирующая полипептид, выбранный из группы, состоящей из нижеследующих пунктов (а)-(f):

(a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность от аминокислоты 20 до 470 согласно последовательности SEQ ID NO: 28,

(b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность от аминокислоты 23 до 236 согласно последовательности SEQ ID NO: 30,

(c) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность от аминокислоты 20 до 470 согласно последовательности SEQ ID NO: 32,

(d) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность от аминокислоты 21 до 236 согласно последовательности SEQ ID NO: 34,

(e) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность от аминокислоты 20 до 470 согласно последовательности SEQ ID NO: 36, и

(f) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность от аминокислоты 21 до 236 согласно последовательности SEQ ID NO: 38.

(45) ДНК или ее часть, выбранная из группы, состоящей из нижеследующих пунктов (а)-(f):

(a) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 126-419 согласно последовательности SEQ ID NO: 27,

(b) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 105-386 согласно последовательности SEQ ID NO: 29,

(c) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 151-441 согласно последовательности SEQ ID NO: 31,

(d) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 88-375 согласно последовательности SEQ ID NO: 33,

(e) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 153-443 согласно последовательности SEQ ID NO: 35, и

(f) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 93-380 согласно последовательности SEQ ID NO: 37.

(46) ДНК или ее часть, выбранная из группы, состоящей из нижеследующих пунктов (а)-(f):

(a) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 69-1481 согласно последовательности SEQ ID NO: 27,

(b) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 39-749 согласно последовательности SEQ ID NO: 29,

(c) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 94-1506, определяемую в последовательности SEQ ID NO: 31,

(d) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 28-738 согласно последовательности SEQ ID NO: 33,

(e) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 96-1508 согласно последовательности SEQ ID NO: 35, и

(f) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 33-743 согласно последовательности SEQ ID NO: 37.

(47) Вектор, содержащий ДНК по любому из пунктов (43)-(46).

(48) Вектор по пункту (47), содержащий ДНК по любому из нижеследующих пунктов (а)-(с):

(a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 126-419 согласно последовательности SEQ ID NO: 27,

(b) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 151-441 согласно последовательности SEQ ID NO: 31, или

(c) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 153-443 согласно последовательности SEQ ID NO: 35.

(49) Вектор по пункту (47), содержащий ДНК по любому из нижеследующих пунктов (а)-(с):

(a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 69-1481 согласно последовательности SEQ ID NO: 27,

(b) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 94-1506 согласно последовательности SEQ ID NO: 31, или

(с) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 96-1508 согласно последовательности SEQ ID NO: 35.

(50) Вектор по пункту (47), содержащий ДНК по любому из нижеследующих пунктов (а)-(с):

(а) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 105-386 согласно последовательности SEQ ID NO: 29,

(b) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 88-375 согласно последовательности SEQ ID NO: 33, или

(с) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 93-380 согласно последовательности SEQ ID NO: 37.

(51) Вектор по пункту (47), содержащий ДНК по любому из нижеследующих пунктов (а)-(с):

(а) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 39-749 согласно последовательности SEQ ID NO: 29,

(b) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 28-738 согласно последовательности SEQ ID NO: 33, или

(c) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 33-743 согласно последовательности SEQ ID NO: 37.

(52) Вектор по пункту (47), содержащий ДНК по любому из нижеследующих пунктов (а) и (b):

(a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 126-419 согласно последовательности SEQ ID NO: 27, и

(b) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 105-386 согласно последовательности SEQ ID NO: 29.

(53) Вектор по пункту (47), содержащий ДНК по любому из нижеследующих пунктов (а) и (b):

(a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 69-1481 согласно последовательности SEQ ID NO: 27, и

(b) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 39-749 согласно последовательности SEQ ID NO: 29.

(54) Вектор по пункту (47), содержащий ДНК по любому из нижеследующих пунктов (а) и (b):

(a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 151-441 согласно последовательности SEQ ID NO: 31, и

(b) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 88-375 согласно последовательности SEQ ID NO: 33.

(55) Вектор по пункту (47), содержащий ДНК по любому из нижеследующих пунктов (а) и (b):

(a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 94-1506 согласно последовательности SEQ ID NO: 31, и

(b) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 28-738 согласно последовательности SEQ ID NO: 33.

(56) Вектор по пункту (47), содержащий ДНК по любому из нижеследующих пунктов (а) и (b):

(a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 153-443 согласно последовательности SEQ ID NO: 35, и

(b) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 93-380 согласно последовательности SEQ ID NO: 37.

(57) Вектор по пункту (47), содержащий ДНК по любому из нижеследующих пунктов (а) и (b):

(a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 96-1508 согласно последовательности SEQ ID NO: 35, и

(b) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 33-743 согласно последовательности SEQ ID NO: 37.

(58) Клетка, продуцирующая человеческое моноклональное антитело по любому из пунктов (3)-(42).

(59) Клетка по пункту (58), где указанная клетка является слитой клеткой, полученной в результате слияния В-клетки, полученной из млекопитающего, способного продуцировать указанное человеческое моноклональное антитело, и миеломной клетки, полученной из млекопитающего.

(60) Генетический рекомбинантный хозяин, трансформированный в результате переноса ДНК, описанной ниже в (а), или вектора, содержащего указанную ДНК, ДНК, описанной ниже в (b), или вектора, содержащего указанную ДНК, или обе их ДНК, описанных ниже в (а) и (b), или вектора, содержащего обе указанные ДНК:

(a) ДНК, кодирующей полипептид тяжелой цепи - или его часть - моноклонального антитела, которое связывается с человеческой AILIM, или

(b) ДНК, кодирующей полипептид легкой цепи - или его часть - моноклонального антитела, которое связывается с человеческой AILIM.

(61) Генетический рекомбинантный хозяин по пункту (60), где указанное моноклональное антитело является человеческим моноклональным антителом.

(62) Генетический рекомбинантный хозяин по пункту (60) или (61), где указанным хозяином является клетка млекопитающего.

(63) Генетический рекомбинантный хозяин по пункту (60) или (61), где указанным хозяином является оплодотворенное яйцо млекопитающего.

(64) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где указанный полипептид тяжелой цепи представляет собой один из полипептидов тяжелой цепи, выбранных из группы, состоящей из нижеследующих (а)-(с):

(а) полипептида тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислот 20-117 согласно последовательности SEQ ID NO: 28,

(b) полипептида тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислот 20-116 согласно последовательности SEQ ID NO: 32, и

(с) полипептида тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислот 20-116 согласно последовательности SEQ ID NO: 36.

(65) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где указанный полипептид тяжелой цепи представляет собой один из полипептидов тяжелой цепи, выбранных из группы, состоящей из нижеследующих (а)-(с):

(a) полипептида тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислот 20-470 согласно последовательности SEQ ID NO: 28,

(b) полипептида тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислот 20-470 согласно последовательности SEQ ID NO: 32, и

(c) полипептида тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислот 20-470 согласно последовательности SEQ ID NO: 36.

(66) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где указанный полипептид легкой цепи представляет собой один из полипептидов легкой цепи, выбранных из группы, состоящей из нижеследующих (а)-(с):

(a) полипептида тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислот 23-116 согласно последовательности SEQ ID NO: 30,

(b) полипептида тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислот 21-116 согласно последовательности SEQ ID NO: 34, и

(с) полипептида тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислот 21-116 согласно последовательности SEQ ID NO: 38.

(67) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где указанный полипептид легкой цепи представляет собой один из полипептидов легкой цепи, выбранных из группы, состоящей из нижеследующих (а)-(с):

(a) полипептида легкой цепи, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислот 23-236 согласно последовательности SEQ ID NO: 30,

(b) полипептида легкой цепи, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислот 21-236 согласно последовательности SEQ ID NO: 34, и

(c) полипептида легкой цепи, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислот 21-236 согласно последовательности SEQ ID NO: 38.

(68) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где указанные полипептиды тяжелой цепи и легкой цепи представляют собой полипептиды, определяемые ниже, соответственно, в (а) и (b):

(а) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность из аминокислот 20-117 согласно последовательности SEQ ID NO: 28, и

(b) полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность из аминокислот 23-116 согласно последовательности SEQ ID NO: 30.

(69) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где указанные полипептиды тяжелой цепи и легкой цепи представляют собой полипептиды, определяемые ниже, соответственно, в (а) и (b):

(a) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность из аминокислот 20-470 согласно последовательности SEQ ID NO: 28, и

(b) полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность из аминокислот 23-236 согласно последовательности SEQ ID NO: 30.

(70) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где указанные полипептиды тяжелой цепи и легкой цепи представляют собой полипептиды, определяемые ниже, соответственно, в (а) и (b):

(a) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность из аминокислот 20-116 согласно последовательности SEQ ID NO: 32, и

(b) полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность из аминокислот 21-116 согласно последовательности SEQ ID NO: 34.

(71) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где указанные полипептиды тяжелой цепи и легкой цепи представляют собой полипептиды, определяемые ниже, соответственно, в (а) и (b):

(а) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность из аминокислот 20-470 согласно последовательности SEQ ID NO: 32, и

(b) полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность из аминокислот 21-236 согласно последовательности SEQ ID NO: 34.

(72) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где указанные полипептиды тяжелой цепи и легкой цепи представляют собой полипептиды, определяемые ниже, соответственно, в (а) и (b):

(a) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность из аминокислот 20-116 согласно последовательности SEQ ID NO: 36, и

(b) полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность из аминокислот 21-116 согласно последовательности SEQ ID NO: 38.

(73) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где указанные полипептиды тяжелой цепи и легкой цепи представляют собой полипептиды, определяемые ниже, соответственно, в (а) и (b):

(a) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность из аминокислот 20-470 согласно последовательности SEQ ID NO: 36, и

(b) полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность из аминокислот 21-236 согласно последовательности SEQ ID NO: 38.

(74) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где ДНК, кодирующая указанный полипептид тяжелой цепи, представляет собой ДНК, определяемую в нижеследующих пунктах (а)-(с):

(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 126-419 согласно последовательности SEQ ID NO: 27,

(b) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 151-441 согласно последовательности SEQ ID NO: 31, и

(c) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 153-443 согласно последовательности SEQ ID NO: 35.

(75) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где ДНК, кодирующая указанный полипептид тяжелой цепи, представляет собой ДНК, определяемую в нижеследующих пунктах (а)-(с):

(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 69-1481 согласно последовательности SEQ ID NO: 27,

(b) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 94-1506 согласно последовательности SEQ ID NO: 31, и

(c) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 96-1508 согласно последовательности SEQ ID NO: 35.

(76) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где ДНК, кодирующая указанный полипептид легкой цепи, представляет собой ДНК, определяемую в нижеследующих пунктах (а)-(с):

(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 105-386 согласно последовательности SEQ ID NO: 29,

(b) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 88-375 согласно последовательности SEQ ID NO: 33, и

(c) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 93-380 согласно последовательности SEQ ID NO: 37.

(77) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где ДНК, кодирующая указанный полипептид легкой цепи, представляет собой ДНК, определяемую в нижеследующих пунктах (а)- (с):

(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 39-749 согласно последовательности SEQ ID NO: 29,

(b) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 28-738 согласно последовательности SEQ ID NO: 33, и

(c) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 33-743 согласно последовательности SEQ ID NO: 37.

(78) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где ДНК, кодирующая указанный полипептид тяжелой цепи, представляет собой ДНК, описанную ниже в пункте (а), а ДНК, кодирующая указанный полипептид легкой цепи, представляет собой ДНК, описанную ниже в пункте (b):

(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 126-419 согласно последовательности SEQ ID NO: 27, и

(b) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 105-386 согласно последовательности SEQ ID NO: 29.

(79) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где ДНК, кодирующая указанный полипептид тяжелой цепи, представляет собой ДНК, описанную ниже в пункте (а), а ДНК, кодирующая указанный полипептид легкой цепи, представляет собой ДНК, описанную ниже в пункте (b):

(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 69-1481 согласно последовательности SEQ ID NO: 27, и

(b) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 39-749 согласно последовательности SEQ ID NO: 29.

(80) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где ДНК, кодирующая указанный полипептид тяжелой цепи, представляет собой ДНК, описанную ниже в пункте (а), а ДНК, кодирующая указанный полипептид легкой цепи, представляет собой ДНК, описанную ниже в пункте (b):

(а) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 151-441 согласно последовательности SEQ ID NO: 31, и

(b) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 88-375 согласно последовательности SEQ ID NO: 33.

(81) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где ДНК, кодирующая указанный полипептид тяжелой цепи, представляет собой ДНК, описанную ниже в пункте (а), а ДНК, кодирующая указанный полипептид легкой цепи, представляет собой ДНК, описанную ниже в пункте (b):

(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 94-1506 согласно последовательности SEQ ID NO: 31, и

(b) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 28-738 согласно последовательности SEQ ID NO: 33.

(82) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где ДНК, кодирующая указанный полипептид тяжелой цепи, представляет собой ДНК, описанную ниже в пункте (а), а ДНК, кодирующая указанный полипептид легкой цепи, представляет собой ДНК, описанную ниже в пункте (b):

(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 153-443 согласно последовательности SEQ ID NO: 35, и

(b) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 93-380 согласно последовательности SEQ ID NO: 37.

(83) Генетический рекомбинантный хозяин по любому из пунктов (60)-(63), где ДНК, кодирующая указанный полипептид тяжелой цепи, представляет собой ДНК, описанную ниже в пункте (а), а ДНК, кодирующая указанный полипептид легкой цепи, представляет собой ДНК, описанную ниже в пункте (b):

(a) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 96-1508 согласно последовательности SEQ ID NO:35, и

(b) ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 33-743 согласно последовательности SEQ ID NO: 37.

(84) Человеческое моноклональное антитело или часть его, продуцируемое генетически рекомбинантным хозяином (при условии, исключающем случай, когда указанным хозяином является оплодотворенное яйцо) по любому из пунктов (60)-(62), или по любому из пунктов (64)-(83).

(85) Фармацевтическая композиция, включающая в себя человеческое антитело согласно (1) или (2) и фармацевтически приемлемый носитель.

(86) Фармацевтическая композиция, включающая в себя человеческое моноклональное антитело или часть его согласно любому из пунктов (3)-(42) и фармацевтически приемлемый носитель.

(87) Фармацевтическая композиция, включающая в себя человеческое моноклональное антитело или часть его согласно (84) и фармацевтически приемлемый носитель.

(88) Фармацевтическая композиция согласно любому из пунктов (85)-(87), где указанная фармацевтическая композиция используется для ингибирования опосредованной AILIM передачи сигнала в клетку.

(89) Фармацевтическая композиция согласно любому из пунктов (85)-(87), где указанная фармацевтическая композиция используется для предотвращения пролиферации AILIM-экспрессирующих клеток.

(90) Фармацевтическая композиция согласно любому из пунктов (85)-(87), где указанная фармацевтическая композиция используется для предотвращения продукции цитокина из AILIM-экспрессирующих клеток.

(91) Фармацевтическая композиция согласно любому из пунктов (85)-(87), где указанная фармацевтическая композиция используется для индукции опосредованной AILIM передачи сигнала в клетку.

(92) Фармацевтическая композиция согласно любому из пунктов (85)-(87), где указанная фармацевтическая композиция используется для индукции пролиферации AILIM-экспрессирующих клеток.

(93) Фармацевтическая композиция согласно любому из пунктов (85)-(87), где указанная фармацевтическая композиция используется для индукции продуцирования цитокина из AILIM-экспрессирующих клеток.

(94) Фармацевтическая композиция согласно любому из пунктов (85)-(87), где указанная фармацевтическая композиция используется для индукции антитело-зависимой цитотоксичности против AILIM-экспрессирующих клеток и/или иммунного цитолизиса или апоптоза AILIM-экспрессирующих клеток.

(95) Фармацевтическая композиция для предотвращения, лечения или профилактики аллергии замедленного типа, включающая в себя вещество, обладающее активностью, связанной с модуляцией передачи сигнала, опосредованного AILIM, и фармацевтически приемлемый носитель.

(96) Фармацевтическая композиция по пункту (95), в которой веществом является белковое вещество.

(97) Фармацевтическая композиция по пункту (96), в которой белковое вещество выбрано из группы, состоящей из

a) антитела, которое связывается с AILIM или его частью;

b) полипептида, содержащего полностью или частично внеклеточную область AILIM;

c) слитого полипептида, содержащего полностью или частично внеклеточную область AILIM и полностью или частично константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, и

d) полипептида, который связывается с AILIM.

(98) Фармацевтическая композиция по пункту (97), в которой указанным антителом, которое связывается с AILIM, является человеческое антитело согласно (1) или (2).

(99) Фармацевтическая композиция по пункту (97), в которой указанным антителом, которое связывается с AILIM, является человеческое моноклональное антитело согласно любому из пунктов (3)-(42).

(100) Фармацевтическая композиция по пункту (97), в которой указанным антителом против AILIM является человеческое моноклональное антитело согласно (84).

(101) Фармацевтическая композиция по пункту (95), в которой веществом является небелковое вещество.

(102) Фармацевтическая композиция по пункту (101), в которой небелковое вещество представляет собой ДНК, РНК или химически синтезированное соединение.

(103) Способ идентификации веществ, которые связываются с AILIM или с лигандом AILIM, включающий в себя следующие стадии:

(а) получение нерастворимого носителя, на котором иммобилизуют внеклеточную область AILIM, взятую целиком или частично;

(b) получение полипептида, включающего в себя внеклеточную область лиганда AILIM, взятую целиком или частично, меченного материалом, содержащим метку, которая испускает регистрируемый сигнал;

(c) введение в реакцию нерастворимого носителя, указанного в стадии (а), с полипептидом, указанным в стадии (b);

(d) введение в реакцию друг с другом в произвольном порядке нерастворимого носителя, указанного в стадии (а), полипептида, указанного в стадии (b), и указанного вещества;

(e) регистрирование сигнала, испускаемого из указанного меченого материала, содержащегося в комплексе, полученном на стадии (с), и сигнала, испускаемого из указанного меченого материала, содержащегося в комплексе, полученном на стадии (d), соответственно, и

(f) сравнение величин каждого из сигналов, регистрируемых на стадии (е).

(104) Способ идентификации веществ, которые связываются с AILIM или с лигандом AILIM, включающий в себя следующие этапы:

(a) получение нерастворимого носителя, на котором иммобилизуют внеклеточную область лиганда AILIM, взятую целиком или частично;

(b) получение полипептида, включающего в себя внеклеточную область AILIM, взятую целиком или частично, меченного материалом, содержащим метку, которая испускает регистрируемый сигнал;

(c) введение в реакцию нерастворимого носителя, указанного в стадии (а), с полипептидом, указанным в стадии (b);

(d) введение в реакцию друг с другом в произвольном порядке нерастворимого носителя, указанного в стадии (а), полипептида, указанного в стадии (b), и указанного вещества;

(e) регистрирование сигнала, испускаемого из указанного меченого материала, содержащегося в комплексе, полученном на стадии (с), и сигнала, испускаемого из указанного меченого материала, содержащегося в комплексе, полученном на стадии (d), соответственно, и

(f) сравнение величин каждого из сигналов, регистрируемых на стадии (е).

(105) Способ по пункту (103) или (104), где указанный полипептид, включающий в себя внеклеточную область AILIM, взятую целиком или частично, представляет собой слитый полипептид, содержащий внеклеточную область AILIM, взятую целиком или частично, и константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, взятую целиком или частично.

(106) Способ по пункту (103) или (104), где указанный полипептид, включающий в себя внеклеточную область лиганда AILIM, взятую целиком или частично, представляет собой слитый полипептид, содержащий полипептид, содержащий внеклеточную область AILIM, взятую целиком или частично, и константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, взятую целиком или частично.

(107) Способ по любому из пунктов (103)-(106), где указанный AILIM представляет собой AILIM человека.

(108) Способ по любому из пунктов (103)-(107), где указанный лиганд AILIM представляет собой лиганд AILIM человека.

Ниже авторами изобретения приведено детальное описание терминологии, используемой в данном изобретении.

Здесь под темином "млекопитающий" подразумевается человек, бык, коза, кролик, мышь, крыса, хомяк и морская свинка, предпочтительно - человек, кролик, крыса, хомяк или мышь и особенно предпочтительно - человек, крыса, хомяк или мышь.

Используемые здесь термины "млекопитающие, отличные от человека" и "млекопитающие не-человеческой природы" являются синонимами, означающими всех млекопитающих, определяемых выше, отличных от человека.

Используемый здесь термин "аминокислоты" означает каждую из аминокислот, существующих в природе, предпочтительно те из них, которые описываются в соответствии с трехбуквенной алфавитной системой или же однобуквенной системой, как показано ниже:

глицин (Gly/G), аланин (Ala/А), валин (Val/V), лейцин (Leu/L), изолейцин (Ile/I), серин (Ser/S), треонин (Thr/T), аспарагиновая кислота (Asp/D), глутаминовая кислота (Glu/E), аспарагин (Asn/N), глутамин (GIn/Q), лизин (Lys/K), аргинин (Arg/R), цистеин (Cys/С), метионин (Met/M), фенилаланин (Phe/F), тирозин (Tyr/Y), триптофан (Trp/W), гистидин (His/H), пролин (Pro/P).

Используемый здесь термин "AILIM" является аббревиатурой, означающей Активационно Индуцибельную Иммуномодуляторную Молекулу Лимфоцитов, под которой подразумевается молекула клеточной поверхности клеток млекопитающих, имеющая структуру и функцию, описанные выше, более предпочтительно AILIM, полученную у человека, в частности (например, International Immunology, Vol.12, No.1, р.51-55; GenBank-Регистрационный Номер: ВАА82129 (человек), ВАА82128 (крыса), ВАА82127 (крыса, вариант) и ВАА8212 (мышь)).

Альтернативно, указанную AILIM называют также ICOS [индуцибельным костимулятором] (не прошедшая экспертизу опубликованная патентная заявка Японии (JP-A) No. Hei 11-29599, Международная патентная заявка No. WO 98/38216), и обе эти аббревиатуры означают одну и ту же молекулу.

Используемый здесь термин "лиганд AILIM" означает молекулу клеточной поверхности, которая взаимодействует с указанной костимуляторной молекулой AILIM (ICOS), и обозначается как B7h, B7RP-1, GL50 или LICOS (Nature, Vol.402, No.6763, р.827-832, 1999; Nature Medicine, Vol.5, No.12, р.1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol.164, р.1653-1657, 2000; Curr. Biol. Vol.10, No.6, р.333-336, 2000).

Кроме того, используемый здесь термин "AILIM" включает в себя также полипептид, имеющий по существу ту же самую аминокислотную последовательность, что и AILIM каждого из млекопитающих, указанных выше, и - особенно предпочтительно - AILIM человека. Более того, различные AILIM человека, которые подобны варианту AILIM крысы, упоминаемому выше (GenBank-Регистрационный Номер: ВАА 82127), являются также включенными в "AILIM" данного изобретения.

Используемый здесь "лиганд AILIM" также определяется как имеющий значение, сходное с таковым, определяемым выше.

Термин "полипептид, имеющий по существу идентичную аминокислотную последовательность" означает различные полипептиды, как описано ниже.

Таким образом, поскольку указанные выше различные полипептиды имеют биологические свойства, по существу эквивалентные свойствам AILIM природного типа (особенно предпочтителен AILIM, полученный у человека), они являются полипептидами данного изобретения. Подобно тем, которые имеют аминокислотную последовательность AILIM природного типа, в которой несколько аминокислотных остатков, предпочтительно 1-10 аминокислотных остатков, более предпочтительно 1-5 аминокислотных остатков, делетировано и/или модифицировано, и к которой несколько аминокислотных остатков, предпочтительно 1-10 аминокислотных остатков, более предпочтительно 1-5 аминокислотных остатков, добавлено.

Более того, ими могут быть различные полипептиды, имеющие несколько замен, делеций, модификаций и добавок аминокислотных остатков в молекуле.

"Лиганд AILIM" согласно данному изобретению также определяется как имеющий значение, подобное описанному выше значению.

AILIM (в частности, AILIM человека) и лиганд AILIM (в частности, лиганд AILIM человека) согласно данному изобретению может быть получен, помимо методов генной рекомбинации, путем соответствующим образом используемых и хорошо известных в данной области методов, таких как метод химического синтеза, метод клеточного культивирования и т.д., или путем модификаций указанных методов.

Такие замены, делеции или вставки аминокислотных остатков могут быть получены с помощью обычно используемых методов (Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "Handbook of Genetic Engineering" (1992) и т.д.).

Примерами методов для получения указанных выше мутантных полипептидов являются сайт-направленный мутагенез синтетического олигонуклеотида (метод образования дуплексов), точковый мутагенез, в результате которого наугад вносятся точковые мутации в результате обработки нитритом или сульфитом, метод, дающий возможность получать делеционные мутанты с помощью фермента Ваl31 и ему подобных, кассетный мутагенез, метод линкерного сканирования, метод миссенс-мутаций, метод ошибочного спаривания, метод синтеза ДНК и т.д.

Сайт-направленный мутагенез синтетического олигонуклеотида (метод образования дуплексов) может быть предпринят, например, следующим образом. Область, которую желательно подвергнуть мутагенезу, клонируют в вектор фага М13, имеющий амбер-мутацию для получения однонитевой фаговой ДНК. После того как RF I DNA вектора М13 без амбер-мутации будет линеаризована в результате обработки рестрикционным ферментом, ДНК смешивают с однонитевой фаговой ДНК, упомянутой выше, денатурируют и подвергают отжигу, получая таким образом "дуплекс -ДНК с пробелами". Синтетический олигонуклеотид, в который внесены мутации, гибридизуют с дуплекс-ДНК с пробелами, и получают замкнутые кольцевые двунитевые ДНК в результате реакции с ДНК-полимеразой и ДНК-лигазой. Клетки Е. coli mutS, дефицитные в отношении репарационной активности ошибочного спаривания, трансфицируют указанной ДНК. Клетки Е. coli без супрессорной активности инфицируют растущими фагами, и только фаги, не имеющие амбер-мутации, подвергают скринингу.

В методе, в результате которого с помощью нитрита получают точковые мутации, используют, например, приведенный ниже принцип. При обработке ДНК нитритом основания подвергаются дезаминированию, с заменой аденина гипоксантином, цитозина урацилом и гуанина ксантином. При введении дезаминированной ДНК в клетку "А:Т" и "G:C" заменяются на "G:C" и "А:Т", соответственно, поскольку гипоксантин, урацил и ксантин при репликации ДНК образуют пары оснований, соответственно, с цитозином, аденином и тимином. Действительно, фрагменты однонитевой ДНК, обработанные нитритом, гибридизуются с "дуплекс-ДНК с пробелами", после этого мутантные штаммы отделяют с помощью тех же манипуляций, что и при сайт-направленном мутагенезе синтетического олигонуклеотида (метод образования дуплексов).

Кроме того, в данном описании "AILIM" включает в себя также и "часть" указанной AILIM. Здесь "часть" означает полипептид, содержащий любую частичную последовательность определяемой выше аминокислотной последовательности AILIM.

Предпочтительно, когда указанная часть относится к внеклеточной области определяемой выше AILIM (особенно предпочтительно, AILIM человека), или к любой ее области.

"Лиганд AILIM" в данном изобретении также определяется наподобие того, как указано выше.

"Часть" указанной AILIM (предпочтительно внеклеточной области AILIM или любой ее области) может быть получена согласно хорошо известным в данной области методам, как описано ниже, или в соответствии с модифицированными методами путем генетической рекомбинации или методом химического синтеза, или путем соответствующего расщепления AILIM (особенно предпочтительно AILIM человека), выделяемой из клеточных культур с помощью протеолитических ферментов, и т.д.

"Часть лиганда AILIM" может быть также получена сходными методами, описанными выше.

"Человеческое антитело" согласно изобретению представляет собой антитело человека, которое связывается с определяемой выше AILIM или ее частью (особенно предпочтительна AILIM, полученная у человека, или ее часть). В частности, это означает полученное у человека поликлональное антитело (поликлональное антитело человека, или антисыворотка человека) или полученное у человека моноклональное антитело (моноклональное антитело человека).

"Моноклональное антитело человека" согласно изобретению представляет собой моноклональное антитело человека, которое связывается с определяемой выше AILIM или ее частью (особенно предпочтительна AILIM, полученная у человека, или ее часть).

Более конкретно, все области, включающие в себя вариабельную и константную области тяжелой цепи (Н-цепь) и вариабельную и константную области легкой цепи (L-цепь), состоят из иммуноглобулина, полученного на основе гена, кодирующего указанный иммуноглобулин человека. L-цепь представлена κ-цепью человека или λ - цепью человека.

Человеческое моноклональное антитело, которое связывается с AILIM (особенно предпочтительна AILIM, полученная у человека, или ее часть) согласно изобретению, или его часть, представляет собой моноклональное антитело человека, имеющее свойства, определяемые в любом из указанных выше пунктов (5)-(42) или (84).

Более конкретно, это понятие включает в себя различные человеческие моноклональные антитела, имеющие различные характеристики и промышленную применимость, как показано в примерах и на чертежах, приведенных ниже.

Предпочтительным воплощением человеческого моноклонального антитела согласно изобретению является человеческое моноклональное антитело, которое связывается с AILIM или ее частью, как определено в любом из указанных выше пунктов (5)-(42) или (84).

Наиболее предпочтительным воплощением является человеческое моноклональное антитело, которое связывается с AILIM человека, как описано в (30) или (39).

"Человеческое моноклональное антитело" согласно изобретению может быть получено путем иммунизации следующих трансгенных млекопитающих, не являющихся человеком, продуцирующих антитело человека, любыми иммуногенами (антигенами), описываемыми ниже:

(a) природной клеткой или искусственно полученной линией клеток, экспрессирующей указанный выше AILIM (особенно предпочтительна AILIM, полученная у человека) на клеточной поверхности;

(b) генетической рекомбинантной клеткой, полученной с помощью техники генетической рекомбинации, с тем, чтобы она экспрессировала указанный выше AILIM (особенно предпочтительна AILIM, полученная у человека) на клеточной поверхности;

(c) клеточным лизатом, полученным путем солюбилизации клеток, упомянутых в (а) или (b), или полипептидным фрагментом AILIM (особенно предпочтительна AILIM, полученная у человека), очищенным из указанного лизата;

(d) генетической рекомбинантной клеткой, полученной с помощью техники генетической рекомбинации, с тем, чтобы она экспрессировала часть (особенно предпочтительна внеклеточная область или любой ее предпочтительный пептид) указанной выше AILIM (особенно предпочтительна AILIM, полученная у человека) в виде растворимого полипептида;

(e) культуральным супернатантом, полученным путем культивирования генетической рекомбинантной клетки, упомянутой в пункте (d), или полипептидом внеклеточной области (растворимая AILIM) указанной AILIM (особенно предпочтительна AILIM, полученная у человека), очищенным из указанного культурального супернатанта, или

(f) частью (особенно предпочтительна внеклеточная область или любой ее предпочтительный пептид) химическим путем синтезированной AILIM (особенно предпочтительна AILIM, полученная у человека).

Кроме того, моноклональное антитело согласно изобретению может быть получено также из культурального супернатанта путем культивирования "генетически рекомбинантного хозяина" [в данном контексте указанным хозяином является эукариотическая клетка, отличная от оплодотворенного яйца (предпочтительны клетки млекопитающих, такие клетки как СНО, лимфоциты и миеломные клетки)], который может быть получен путем трансформации хозяина с помощью кДНК (предпочтительно вектором, содержащим указанные кДНК), кодирующих каждую из тяжелой и легкой цепей такого человеческого моноклонального антитела согласно изобретению, с использованием техники генетической рекомбинации, и который продуцирует генетически рекомбинантное моноклональное антитело человека.

В частности, моноклональное антитело согласно изобретению может быть получено путем культивирования рекомбинантного хозяина, описанного в любом из вышеуказанных пунктов (60)-(62) или (64)-(80) данного изобретения (здесь указанный хозяин представляет собой эукариотическую клетку, отличную от оплодотворенного яйца (предпочтительно клетки млекопитающих, такие как СНО, лимфоциты и миеломные клетки)).

Кроме того, человеческое моноклональное антитело согласно изобретению может быть моноклональным антителом человека, имеющим любой изотип, принадлежащий IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4), IgH, IgA (IgAl и IgA2), IgD или IgE.

Предпочтительно указанное моноклональное антитело принадлежит IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4), более предпочтительно - IgG1, IgG2 или IgG4.

Человеческое моноклональное антитело согласно изобретению может быть получено путем иммунизации трансгенных млекопитающих, не являющихся человеком, продуцирующих антитело человека, таких как описанная ниже продуцирующая антитело человека трансгенная мышь, любыми иммуногенами (антигенами), описываемыми ниже в (а)-(f), согласно общеизвестному используемому способу производства.

Так, например, указанное трансгенное млекопитающее, не являющеея человеком, продуцирующее антитело человека, иммунизируют указанным антигеном, если необходимо, в комбинации с адъювантом Фрейнда. Поликлональное антитело может быть получено из сыворотки, собранной из указанного иммунизированного животного. Моноклональное антитело может быть получено путем получения слитых клеток (гибридом) из указанных антителопродуцирующих клеток, выделенных из указанного иммунизированного животного, и клеток миеломы, неспособных к продукции аутоантител, и клонирования указанных гибридом с целью селекционирования клона, продуцирующего моноклональное антитело со специфической аффинностью в отношении антигена, используемого для иммунизации животного.

Более конкретно, моноклональное антитело может быть получено, как описано ниже. Так, трансгенное млекопитающее, не являющееся человеком, продуцирующее указанное человеческое антитело (особенно предпочтительна "продуцирующая человеческое антитело трансгенная мышь"), иммунизируют путем инъецирования любым из иммуногенов, упомянутых выше в (а)-(с), внутрикожно, внутримышечно, внутривенно, в подушечку лапки или внутрибрюшинно, от одного до нескольких раз, или же трансплантируют указанный иммуноген в указанное млекопитающее. Обычно иммунизацию производят от одного до четырех раз каждые один-четырнадцать дней после первой иммунизации. Антителопродуцирующие клетки получают у иммунизированного указанным способом млекопитающего на первый - пятый день после последней иммунизации. Частота и интервал иммунизаций могут соответствующим образом варьировать, в зависимости, например, от свойств используемого иммуногена.

Гибридомы, которые секретируют человеческое моноклональное антитело, могут быть получены методом Köhler и Milstein (Nature, Vol.256, pp.495-497 (1975)), а также модифицированным методом указанных авторов. Конкретно, гибридомы получают путем слияния антителопродуцирующих клеток, содержащихся в селезенке, лимфатическом узле, костном мозге или миндалине, полученных у иммунизированных, как указано выше, млекопитающих, не являющихся человеком, продуцирующих человеческое антитело, предпочтительно в селезенке, с миеломами, не способными продуцировать аутоантитела, которые предпочтительно получены у млекопитающего, такого как мышь, крыса, морская свинка, хомяк, кролик или человек, или - более предпочтительно - мышь, крыса или человек.

Например, в качестве миеломы, применяемой для слияния клеток, могут быть использованы миелома, полученная у мыши, P3/X63-AG8.653 (АТСС No. CRL-1580), P3/NSI/1-Ag4-1 (NS-1), P3/X63-Ag8.U1 (P3U1), SP2/0-Ag14 (Sp2/0, Sp2), NSO, PAI, FO, или BW5147, миелома, полученная у крысы, 210RCY3-Ag.2.3., или миелома, полученная у человека, U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 или СЕМ-Т15.

Клетки, продуцирующие моноклональные антитела (например, гибридомы), могут быть подвержены скринингу путем культивирования клеток, например, в микротитрационных планшетах, и путем измерения реактивности культурального супернатанта в лунке, в которой наблюдается рост гибридомы, в отношении иммуногена, используемого для указанной выше иммунизации, например, с помощью иммуноферментного анализа, например, рентгеновского иммуноанализа (RIA) или твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Моноклональные антитела могут быть получены из гибридом путем культивирования гибридом in vitro или in vivo, например, в асцитной жидкости мыши, крысы, морской свинки, хомяка или кролика, предпочтительно мыши или крысы, и более предпочтительно - мыши, а затем выделения антител из супернатанта результирующей культуры или из асцитных жидкостей млекопитающих.

Моноклональные антитела согласно изобретению могут быть крупномасштабно получены на основе следующего метода:

(1) гены (кДНК и т.д.), кодирующие каждую из цепей - тяжелую и легкую - указанного моноклонального антитела, клонируют из указанных гибридом;

(2) клонированные гены, кодирующие каждую из цепей - тяжелую и легкую - вводят в различные векторы или в один и тот же вектор для получения экспрессирующего вектора;

(3) указанный экспрессирующий вектор переносят в оплодотворенное яйцо соответствующего млекопитающего, не являющегося человеком (такого как коза);

(4) указанное оплодотворенное яйцо, содержащее ген, переносят в матку приемной матери с целью получения химерного животного, не являющегося человеком;

(5) путем дальнейшего спаривания указанной химерной козы с другим млекопитающим, не являющимся человеком, получают трансгенное млекопитающее, не являющееся человеком (рогатый скот, коза, овца или свинья), с генами, кодирующими каждую из цепей, тяжелую и легкую, включенными эндогенно, и

(6) из молока указанного трансгенного млекопитающего, не являющегося человеком, крупномасштабно получают моноклональное антитело, полученное на основе гена, указанного человеческого моноклонального антитела (Nikkei Science, April, 1997, р.78-84).

Культивирование in vitro клеток, продуцирующих моноклональные антитела, может быть предпринято, в зависимости, например, от свойств культивируемых клеток, тестируемого объекта исследования и различных условий способа культивирования, с использованием известных питательных сред или же любых питательных сред, полученных на основе известных питательных сред для роста, поддержания и хранения гибридом, для продуцирования моноклональных антител в культуральных супернатантах.

Примерами основных используемых базальных питательных сред являются среды с низким содержанием кальция, такие как среда Ham'F12, среда MCDB153 или среда MEM с низким содержанием кальция, и среды с высоким содержанием кальция, такие как среда MCDB104, среда MEM, среда D-MEM, среда RPMI1640, среда ASF104 или среда RD. Базальная среда может содержать, например, сыворотку, гормоны, цитокины и/или различные неорганические или органические вещества, в зависимости от задачи.

Моноклональные антитела можно выделить и очистить из указанных выше культурального супернатанта или асцитных жидкостей путем осаждения насыщенным сульфатом аммония, методом эуглобулиновой преципитации, с использованием метода капроновой кислоты, методом, в котором используется каприловая кислота, с помощью ионообменной хроматографии (DEAE или DE52), методом аффинной хроматографии с использованием антииммуноглобулиновой колонки или колонки с протеином А.

Человеческое моноклональное антитело согласно изобретению включает в себя человеческое моноклональное антитело, состоящее из тяжелой цепи и/или легкой цепи, причем аминокислотная последовательность каждой из цепей содержит делецию, замену или добавку одного или более аминокислотных остатков.

В данном контексте выражение "более аминокислотных остатков" означает несколько аминокислот, в частности от 1 до 10 аминокислотных остатков, предпочтительно от 1 до 5 аминокислотных остатков.

Частичная модификация (делеция, замена, вставка или добавка), как было описано выше, может быть внесена в аминокислотную последовательность человеческого моноклонального антитела согласно изобретению путем частичного изменения базальной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность. Такое частичное изменение базальной последовательности может быть произведено с помощью стандартного метода с использованием известной технологии сайт-специфического (сайт-направленного) мутагенеза (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.81, р.5662-5666, 1984).

"Не являющееся человеком трансгенное млекопитающее, продуцирующее человеческие антитела", в частности трансгенная мышь, продуцирующая человеческие антитела, которая связана с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения, может быть получена в соответствии с имеющимися в литературе публикациями (Nature Genetics, Vol.1, р.13-21, 1994; Nature Genetics, Vol.15, р.146-156, 1997; опубликованный японский перевод международной публикации No. Hei 4-504365; опубликованный японский перевод международной публикации No. Hei 7-509137; Nikkei Science, June, p.40-50, 1995; международная патентная публикация No. WO 94/25585; Nature, Vol.368, р.856-859, 1994, и опубликованный японский перевод международной публикации No. Hei 6-500233 и т.д.)

В частности, указанные мыши, продуцирующие человеческие антитела, могут быть получены, например, с помощью метода, состоящего из следующих этапов:

(1) получение мышей "knockout", у которых эндогенный ген тяжелой цепи иммуноглобулина функционально инактивирован в результате замены по меньшей мере части генного локуса тяжелой цепи мышиного эндогенного иммуноглобулина в результате замены маркерным геном лекарственной толерантности (таким как ген толерантности к неомицину) путем гомологической рекомбинации;

(2) получение мышей "knockout", у которых эндогенный ген легкой цепи иммуноглобулина (в частности, ген κ-цепи) функционально инактивирован в результате замены по меньшей мере части генного локуса легкой цепи мышиного эндогенного иммуноглобулина в результате замены маркерным геном лекарственной толерантности (таким как ген толерантности к неомицину) путем гомологической рекомбинации;

(3) получение трансгенной мыши, у которой требуемая область генного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина человека включена в мышиную хромосому с помощью вектора, представленного искусственной хромосомой дрожжей (YAC), несущей гигантский ген;

(4) получение трансгенной мыши, у которой требуемая область генного локуса легкой цепи иммуноглобулина человека (в частности, гена κ-цепи), включена в мышиную хромосому с помощью вектора, представленного искусственной хромосомой дрожжей (YAC), несущей гигантский ген;

(5) получение трансгенной мыши, у которой генные локусы тяжелой и легкой цепей эндогенного иммуноглобулина являются - оба - функционально инактивированными и хромосома которой включает в себя требуемые области генных локусов как тяжелой, так и легкой цепи иммуноглобулина человека путем спаривания, как указано выше в пунктах (1)-(4), мышей "knockout" с трансгенными мышами в произвольном порядке.

Описанная выше мышь "knockout" может быть получена путем замены соответствующей области локуса гена эндогенного иммуноглобулина чужеродным маркерным геном (таким как ген толерантности к неомицину), на основе гомологической рекомбинации для инактивации указанного генного локуса таким образом, чтобы он не участвовал в реаранжировке. Для инактивации с помощью указанной гомологической рекомбинации может быть использован, например, так называемый метод положительного-отрицательного отбора (PNS) (Nikkei Science, May, p.52-62, 1994).

Функциональной инактивации локуса гена тяжелой цепи иммуноглобулина можно достичь, например, путем внесения повреждения в одну из частей J- или С-области (например, в Сμ-область). А функциональной инактивации локуса гена легкой цепи (например, κ-цепи) иммуноглобулина можно достичь, например, путем внесения повреждения в одну из частей J- или С-области или же в область, выходящую за пределы J- или С-областей.

Трансгенная мышь может быть получена в соответствии со способом, обычно используемым для получения трансгенных животных (см., например, "Newest Manual of Animal Cell Experiment", LIC press, Chapter 7, pp.361-408 (1990)). В частности, например, HPRT-негативную (дефицит гена гипоксантин-гуанидин фосфорибозилтрансферазы) ES-клетку (эмбриональная стволовая клетка), полученную из нормального бластоциста мыши, сливают с дрожжевой клеткой, содержащей YAC-вектор со вставленным в него геном, кодирующим указанный генный локус тяжелой цепи или генный локус легкой цепи, или же часть их, указанного человеческого иммуноглобулина, и геном HPRT, с использованием сферопластного метода слияния. ES-клетки, эндогенный мышиный ген которых интегрирован с указанным чужеродным геном, отбирают, используя метод НАТ-селекции. Затем полученные в результате скрининга ES-клетки микроинъецируют в оплодотворенное яйцо, полученное у другой нормальной мыши (бластоцист) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, No.12, pp.7380-7384 (1980); U.S. Pat. No.4873191). Полученный бластоцист трансплантируют в матку другой нормальной мыши-приемной матери. Затем у такой мыши-приемной матери рождается химерная трансгенная мышь. Путем скрещивания такой химерной трансгенной мыши с нормальной мышью получают гетерогенных трансгенных мышей. Путем скрещивания гетерогенных трансгенных мышей друг с другом получают, в соответствии с законами Менделя, гомоогенных трансгенных мышей.

Термин "часть моноклонального антитела", используемый в настоящем изобретении, означает частичную область указанного выше человеческого моноклонального антитела согласно изобретению, которая, в частности, включает в себя F(ab')₂, Fab', Fab, Fv (вариабельный фрагмент антитела), sFv, dsFv (стабилизированный дисульфидом Fv) или dAb (антитело с одиночным доменом) (Exp. Opin. Ther. Patents, Vol.6, No.5, pp.441-456 (1996)).

"F(ab')₂" и "Fab'" могут быть получены путем обработки иммуноглобулина (моноклонального антитела) протеиназой, такой как пепсин или папаин, и означают фрагмент антитела, полученный путем переваривания (расщепления) иммуноглобулина вблизи дисульфидных связей в шарнирных областях, существующих между каждой из Н-цепей. Например, папаин расщепляет IgG вверх по течению от дисульфидных связей в шарнирных областях, существующих между каждой из Н-цепей, для получения двух гомологичных фрагментов антитела, в которых L-цепь, состоящая из v_L (вариабельная область L-цепи) и C_L (константная область L-цепи), и фрагмент Н-цепи, состоящий из V_H (вариабельная область Н-цепи) и С_н (константная область Н-цепи), связаны по их С-концевым участкам посредством дисульфидной связи. Каждый из двух таких гомологичных фрагментов антитела называется Fab'. Пепсин расщепляет IgG также и вниз по течению от дисульфидных связей в шарнирных участках, существующих между каждой из двух Н-цепей для получения фрагмента антитела, слегка большего размера, нежели фрагмент, в котором два указанных выше связаны в шарнирной области. Такой фрагмент антитела называется F(ab')₂.

Термин "константа скорости связывания (ka)" означает здесь величину, указывающую на силу (степень) связывания указанного моноклонального антитела с антигеном-мишенью, вычисленную на основе кинетики реакции антиген-антитело. "Константа скорости диссоциации (kd)" означает величину, указывающую на силу (степень) диссоциации указанного моноклонального антитела от антигена-мишени. "Константа диссоциации (Kd)" является величиной, полученной путем деления указанной "константы скорости диссоциации (kd)" на величину указанной "константы скорости связывания (ka)". Эти константы используются для иллюстрации аффинности указанного моноклонального антитела к антигену и его активности по нейтрализации антигена.

Указанные константы могут быть изучены с помощью различных методов, и их можно с легкостью определять с помощью коммерческих аналитических наборов BiacoreX (Amersham Pharmacia) или подобного ему набора, в соответствии с прилагаемыми к указанному набору инструкциями. Значения ka, kd и Kd, получаемые с помощью указанных наборов, выражены в единицах 1/М.сек, 1/сек и М (моль) соответственно. Более высокие значения ka указывают на более высокую активность тестируемого моноклонального антитела в отношении связывания антигена, а более низкие значения Kd указывают на более высокую активность антитела в отношении нейтрализации антигена.

Человеческое моноклональное антитело согласно изобретению включает в себя таковые, имеющие значения ka, kd или Kd, показанные ниже в пунктах (1)-(3):

(1) человеческое моноклональное антитело, которое связывается с AILIM человека или частью AILIM с константой скорости связывания (ka) порядка 1.0×10⁴ (1/М.сек) или более, предпочтительно 1.0×10⁵ (1/М. сек) или более;

(2) человеческое моноклональное антитело, которое связывается с AILIM человека или частью AILIM с константой скорости диссоциации (kd) порядка 1.0×10^-4 (1/сек) или менее, предпочтительно 1.0×10^-5 (1/сек) или менее;

(3) человеческое моноклональное антитело, которое обладает реактивностью в отношении AILIM человека или части AILIM с константой диссоциации (Kd) порядка 1.0×10^-7 (М) или менее, предпочтительно 1.0×10^-8 (М) или менее и более предпочтительно 1.0×10^-9 (М) или менее.

В этом случае полагают, что каждая из величин ka, kd и Kd, описанных выше, может подвергаться слабым флуктуациям, в зависимости от различных условий в момент измерения, в пределах ошибки измерений, но, как правило, практически без флуктуации индексов.

"Клетка, продуцирующая моноклональные антитела", или "генетический рекомбинантный хозяин", продуцирующий генетически рекомбинантные человеческие моноклональные антитела согласно изобретению (в данном контексте указанным хозяином является клетка, за исключением оплодотворенного яйца), означает любую клетку, продуцирующую указанное выше человеческое моноклональное антитело согласно изобретению.

В частности, например, она включает в себя, не ограничиваясь ими, клетки, описанные в любом из следующих подпунктов (1)-(3):

(1) В-клетка, продуцирующая человеческое моноклональное антитело, полученная путем иммунизации указанного выше трансгенного млекопитающего, не являющегося человеком, продуцирующего человеческое моноклональное антитело, определяемым выше иммуногеном (антигеном), и коллекционированием клеток из указанного иммунизированного животного;

(2) указанная выше слитая клетка (гибридома), полученная путем слияния В-клетки, продуцирующей человеческое моноклональное антитело и полученной таким образом, с миеломной клеткой, полученной у млекопитающего;

(3) генетически рекомбинантная клетка, продуцирующая генетически рекомбинантное человеческое моноклональное антитело, полученная путем трансформации клетки, исключая указанную В-клетку и клетку гибридомы (например, клетки СНО (клетка яичника китайского хомячка), клетки ВНК (клетка почки новорожденного хомячка), лимфоцита, такого как клетка миеломы), геном, кодирующим указанное человеческое моноклональное антитело (ген, кодирующий тяжелую цепь, или ген, кодирующий легкую цепь, или же оба этих гена), выделенным из указанной В-клетки, продуцирующей указанное человеческое моноклональное антитело, или слитой клетки (гибридомы), продуцирующей указанное человеческое моноклональное антитело.

В данном контексте указанная в пункте (3) генетически рекомбинантная клетка, продуцирующая генетически рекомбинантное человеческое моноклональное антитело, конкретно означает генетически рекомбинантную клетку, продуцирующую генетический рекомбинант человеческого моноклонального антитела, продуцируемого В-клеткой, описанной выше в пункте (1), или гибридомой, описанной выше в пункте (2).

Наконец, термин "хозяин" в термине "генетически рекомбинантный хозяин" согласно изобретению включает в себя, вдобавок к различным клеткам млекопитающих, описанным выше, оплодотворенные яйца любого из млекопитающих, не являющихся человеком (козы, свиньи, овцы, рогатого скота и т.д.). Путем переноса гена (гена, кодирующего тяжелую цепь, или гена, кодирующего легкую цепь, или же обоих этих генов), кодирующего любое моноклональное антитело (предпочтительно человеческое моноклональное антитело), против AILIM человека согласно изобретению в указанное оплодотворенное яйцо можно получить генетически рекомбинантное оплодотворенное яйцо согласно изобретению. Это генетически рекомбинантное оплодотворенное яйцо используется для получения трансгенных животных, используемых в свою очередь для широкомасштабного производства указанного выше белка из молока (Nikkei Science, April, 1997, р.78-84).

"Вещество", составляющее данное изобретение, в частности, "вещество, обладающее активностью в модулировании передачи сигнала, опосредованного AILIM", и более конкретно, "вещество, обладающее активностью в ингибировании пролиферации AILIM-экспрессирующих клеток или в ингибировании продукции цитокина AILIM-экспрессирующими клетками", означает естественное вещество, существующее в природе, или искусственно полученное произвольное вещество.

"Вещество" в связи с "веществом, связывающимся с AILIM", и " веществом, связывающимся с лигандом AILIM", в данном контексте также означает любое естественное вещество, существующее в природе, или искусственно полученное произвольное вещество.

Здесь "передача сигнала, опосредованного AILIM, означает передачу сигнала через AILIM, приводящую к изменению произвольного фенотипа в AILIM-экспрессирующих клетках (пролиферации клеток, активации клеток, апоптозу и/или к изменению способности продуцировать произвольный цитокин AILIM-экспрессирующими клетками).

"Вещество" может быть в основном классифицировано как "белковое вещество" и "небелковое вещество".

Примерами "белкового вещества" может служить полипептид, антитело (поликлональное антитело, моноклональное антитело или же часть моноклонального антитела, особенно предпочтительно указанное выше человеческое антитело).

Когда вещество является антителом, вещество предпочтительно является моноклональным антителом. Когда вещество является моноклональным антителом, вещество включает в себя не только моноклональное антитело, полученное из млекопитающего, не являющегося человеком, но также и рекомбинантное химерное моноклональное антитело, рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело и человеческое моноклональное антитело.

Здесь "рекомбинантное химерное моноклональное антитело" представляет собой моноклональное антитело, полученное с помощью генетической инженерии, и, в частности, означает химерное антитело, такое как мышиное/человеческое химерное моноклональное антитело, вариабельные области которого получены из иммуноглобулина млекопитающего, не являющегося человеком (мышь, крыса, хомяк и т.д.), а константные области которого получены из иммуноглобулина человека.

"Гуманизированное моноклональное антитело (CDR-трансплантированное антитело)" согласно изобретению представляет собой моноклональное антитело, полученное с помощью генетической инженерии, и, в частности, означает гуманизированное моноклональное антитело, в котором участки гипервариабельной области, определяющие комплементарность, получены из определяющих комплементарность областей гипервариабельной области моноклонального антитела млекопитающего, не являющегося человеком (мышь, крыса, хомяк и т.д), области рамки считывания вариабельной области получены из областей рамки считывания вариабельной области иммуноглобулина человека, а константная область получена из константной области иммуноглобулина человека.

Определяющие комплементарность области гипервариабельной области находятся в гипервариабельной области вариабельной области антитела и означают три области, которые напрямую и комплементарно связываются с антигеном (определяющие комплементарность остатки, CDR1, CDR2 и CDR3). Области рамки считывания вариабельной области означают четыре сравнительно консервативные области, лежащие выше по течению, ниже по течению или же между тремя определяющими комплементарность областями (область рамки считывания FR1, FR2, FR3 и FR4).

Иными словами, гуманизированное моноклональное антитело означает такое, в котором все области, за исключением взятых частично или полностью областей, определяющих комплементарность гипервариабельной области моноклонального антитела, полученного у млекопитающего, не являющегося человеком, заменены соответствующими им областями, полученными из иммуноглобулина человека.

Константная область, полученная из иммуноглобулина человека, имеет аминокислотную последовательность, унаследованную у каждого изотипа, такого как IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD и IgE. Константная область гуманизированного моноклонального антитела в данном изобретении может быть таковой иммуноглобулина человека, принадлежащей любому изотипу. Предпочтительно она представляет собой константную область IgG человека. Области рамки считывания константной области, полученной из иммуноглобулина человека, не особо лимитированы.

Когда вещество согласно изобретению представляет собой полипептид, это вещество включает в себя следующее: полипептид, фрагмент полипептида (олигопептид), слитый полипептид, химически модифицированный полипептид. Примеры олигопептида представляют собой пептид, содержащий от 5 до 30 аминокислот, предпочтительно от 5 до 20 аминокислот. Конкретная химическая модификация может быть выбрана в зависимости от различных целей, например, для увеличения времени жизни в крови в случае введения in vivo или для повышения толерантности против деградации или повышенной абсорбции в желудочно-кишечном тракте при пероральном введении.

Примерами полипептидов являются следующие:

(1) полипептид, включающий в себя полностью или частично внеклеточную область AILIM;

(2) слитый полипептид, включающий в себя полностью или частично внеклеточную область AILIM и полностью или частично константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, или

(3) полипептид, который связывается с AILIM.

Примерами "не-белков" являются ДНК, РНК и химически синтезированное соединение.

Здесь "ДНК" означает "ДНК, содержащую частичную нуклеотидную последовательность ДНК или ее химически модифицированную ДНК", используемую в качестве антисмысловой ДНК, фармацевтически запрограммированной на основе нуклеотидной последовательности ДНК (включая кДНК и геномную ДНК), кодирующей указанный выше AILIM (предпочтительно AILIM человека). В частности, антисмысловая ДНК может ингибировать транскрипцию ДНК, кодирующей AILIM, в мРНК, или трансляцию мРНК в белок в результате гибридизации ДНК или РНК, кодирующей AILIM.

"Частичная нуклеотидная последовательность", упоминаемая в данном описании, указывает на частичную нуклеотидную последовательность, содержащую произвольное количество нуклеотидов в произвольно взятой области. Частичная нуклеотидная последовательность состоит из 5-100 последовательных нуклеотидов, предпочтительно из 5-70 последовательных нуклеотидов, более предпочтительно из 5-50 последовательных нуклеотидов и еще более предпочтительно из 5-30 последовательных нуклеотидов.

Когда ДНК используется в качестве антисмысловой фармацевтической ДНК, последовательность ДНК может быть модифицирована химически отчасти для увеличения времени полужизни (стабильности) назначаемой больным концентрации ДНК в крови, для увеличения внутрицитоплазматической-мембранной проницаемости ДНК или для увеличения резистентности к деградации или абсорбции перорально вводимой ДНК в органах переваривания. Химическая модификация включает в себя, например, модификацию фосфатных связей, рибоз, нуклеотидных оснований и сахарного фрагмента, 3'-конца и/или 5'-конца в структуре олигонуклеотидной ДНК.

Модификация фосфатных связей включает в себя, например, превращение одной или более связей в фосфодиэфирные связи (D-олиго), фосфоротиоатные связи (S-олиго), метилфосфонат (МР-олиго), фосфороамидатные связи, нефосфатные связи или метилфосфоронотиоатные связи, или их комбинацию. Модификация рибозы включает в себя, например, превращение в 2'-фторрибозу или 2'-О-метилрибозу. Модификация нуклеотидного основания включает в себя, например, превращение в 5-пропинилурацил или 2-аминоаденин.

Здесь "РНК" означает "РНК, содержащую частичную нуклеотидную последовательность РНК или ее химически модифицированную РНК", используемую в качестве антисмысловой РНК, фармацевтически запрограммированной на основе нуклеотидной последовательности РНК, кодирующей указанный выше AILIM (предпочтительно AILIM человека). Антисмысловая РНК может ингибировать транскрипцию ДНК, кодирующей AILIM, в мРНК или трансляцию мРНК в белок в результате гибридизации ДНК или РНК, кодирующей AILIM.

"Частичная нуклеотидная последовательность", упоминаемая в данном описании, указывает на частичную нуклеотидную последовательность, содержащую произвольное число нуклеотидов в произвольно взятой области. Частичная нуклеотидная последовательность состоит из 5-100 последовательных нуклеотидов, предпочтительно из 5-70 последовательных нуклеотидов, более предпочтительно из 5-50 последовательных нуклеотидов и еще более предпочтительно из 5-30 последовательных нуклеотидов.

Последовательность антисмысловой РНК может быть модифицирована химически отчасти для увеличения времени полужизни (стабильности) назначаемой больным концентрации РНК в крови, для увеличения внутрицитоплазматической-мембранной проницаемости РНК или для увеличения резистентности к деградации или абсорбции перорально вводимой РНК в органах переваривания. Примером химической модификации является химическая модификация, применяемая к антисмысловой ДНК, как описано выше.

Примерами "химически синтезированного соединения" являются произвольные соединения, за исключением указанных выше ДНК, РНК и белковых веществ, имеющие молекулярную массу порядка 100-1000, предпочтительно соединение, имеющее молекулярную массу приблизительно от 100 до 800, и более предпочтительно - соединение, имеющее молекулярную массу приблизительно от 100 до 600.

"Полипептид", входящий в приведенное выше определение "вещества", означает часть (фрагмент) полипептидной цепи, составляющей AILIM (предпочтительно AILIM человека), предпочтительно целиком или частично внеклеточную область полипептида, составляющего AILIM (от 1 до 5 аминокислот могут быть необязательно добавлены в N-концевую и/или С-концевую часть указанной области).

AILIM, включенная в данное изобретение, представляет собой трансмембранную молекулу, пронизывающую клеточную мембрану и содержащую 1 или 2 полипептидные цепи.

Здесь "трансмембранный белок" означает белок, который соединяется с мембраной через гидрофобную пептидную область, однократно или многократно пронизывающую липидный бислой мембраны, и структура которого как целого состоит главным образом из трех основных частей: внеклеточной области, трансмембранной области и цитоплазматической области, как это обычно наблюдается у многих рецепторов или молекул клеточной поверхности. Такой трансмембранный белок образует каждый рецептор или молекулу клеточной поверхности в виде мономера, гомодимера, гетеродимера или олигомера, где другая цепь(цепи) имеет такую же самую или отличную аминокислотную последовательность.

Здесь "внеклеточная область" означает целиком или частично фрагмент частичной структуры (частичная область) из полной структуры указанного выше трансмембранного белка, где частичная структура находится с наружной части мембраны. Иными словами, это означает целиком или частично область трансмембранного белка, за исключением области, включенной в мембрану (трансмембранная область), и области, находящейся в цитоплазме, которая следует за трансмембранной областью (цитоплазматическая область).

"Слитый полипептид", включенный в указанное выше "белковое вещество", означает слитый полипептид, содержащий целиком или частично внеклеточную область полипептида, составляющего AILIM (предпочтительно AILIM человека), и "целиком или частично константную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека (Ig, предпочтительно Ig человека)". Предпочтительно слитый полипептид представляет собой слитый полипептид с внеклеточной областью AILIM и частью константной области тяжелой цепи IgG человека, и особенно предпочтительно - слитый полипептид внеклеточной области AILIM и область (Fc) тяжелой цепи IgG человека, содержащей шарнирную область, СН2- домен и СН3-домен. Что касается IgG, предпочтительным является IgGI, a что касается AILIM, предпочтительными являются AILIM человека, мыши или крысы (предпочтительно человека).

"Целиком или частично константная область тяжелой цепи иммуноглобулина (Ig) человека" означает здесь, как описано выше, константную область Fc-области тяжелой (Н-цепь) цепи полученного у человека иммуноглобулина или часть ее. Иммуноглобулин может быть любым иммуноглобулином, принадлежащим любому классу и любому подклассу. В частности, примерами иммуноглобулинов являются IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4), IgM, IgA (IgA1 и IgA2), IgD и IgE. Предпочтительно иммуноглобулином является IgG (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4) или IgM. Примерами особо предпочтительного иммуноглобулина согласно данному изобретению являются иммуноглобулины, принадлежащие полученному у человека IgG (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4).

Иммуноглобулин имеет структурную единицу в форме Y, в которой четыре цепи, состоящие из двух гомологичных легких цепей (L-цепи) и двух гомологичных тяжелых цепей (Н-цепи), связаны дисульфидными мостиками (S-S-связи). Легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (V_L) и константной области легкой цепи (С_L). Тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (V_н) и константной области тяжелой цепи (С_н).

Константная область тяжелой цепи состоит из доменов, имеющих аминокислотную последовательность, наследуемую для каждого класса (IgG, IgM, IgA, IgD и IgE) и каждого подкласса (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgAl и IgA2).

Тяжелая цепь IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) состоит из V_H, CH1-домена, шарнирной области, СН2-домена и СН3-домена, в указанном порядке, считая от N-конца.

Сходным образом, тяжелая цепь IgG1 состоит из V_H, Cγ₁1-домена, шарнирной области, Сγ₁2-домена и Сγ₁3-домена, в указанном порядке считая от N-конца. Тяжелая цепь IgG3 состоит из V_H, Сγ₃1-домена, шарнирной области, Сγ₃2-домена и Сγ₃3-домена, в указанном порядке считая от N-конца. Тяжелая цепь IgG4 состоит из V_H, Сγ₄1-домена, шарнирной области, Сγ₄2-домена и Сγ₄3-домена, в указанном порядке считая от N-конца.

Тяжелая цепь IgA состоит из V_H, Cαl-домена, шарнирной области, Сα2-домена и Сα3-домена, в указанном порядке считая от N-конца.

Сходным образом, тяжелая цепь IgA1 состоит из V_H, Cα₁1-домена, шарнирной области, Сα₁2-домена и Cα₁3-домена, в указанном порядке считая от N-конца. Тяжелая цепь IgA2 состоит из V_H, Сα₂2-домена, шарнирной области, Сα₂2-домена и Сα₂3-домена, в указанном порядке считая от N-конца.

Тяжелая цепь IgD состоит из V_H, Сδ1-домена, шарнирной области, Сδ2-домена и Сδ3-домена, в указанном порядке считая от N-конца.

Тяжелая цепь IgM состоит из V_H, Сμ1-домена, Сμ2-домена, Сμ3-домена и Сμ4-домена, в указанном порядке считая от N-конца, и не имеет шарнирной области, наблюдаемой в IgG, IgA и IgD.

Тяжелая цепь IgE состоит из V_H, Cε1-домена, Сε2-домена, Сε3-домена и Сε4-домена, в указанном порядке считая от N-конца, и не имеет шарнирной области, наблюдаемой в IgG, IgA и IgD.

Если, например, IgG обработать папаином, он расщепится у слабой N-концевой части, за дисульфидными связями, находящимися в шарнирной области, где дисульфидные связи соединяют две тяжелые цепи, для получения двух гомологичных Fab, в которой фрагмент тяжелой цепи, состоящий из V_H и СН1, соединен с легкой цепью посредством дисульфидной связи, и один Fc, в котором два гомологичных фрагмента тяжелой цепи составляют шарнирный участок, СН2-домен и СН3-домен соединены с помощью ди-сульфидных связей (см. "Immunology Illustrated", original 2nd ed., Nankodo, pp.65-75 (1992) и "Focus of Newest Medical Science 'Recognition Mechanism of Immune System'", Nankodo, pp.4-7 (1991), и т.д.).

Конкретно, указанная выше "часть константной области тяжелой цепи иммуноглобулина" означает часть константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющей структурные характиристики, указанные выше, и предпочтительно является константной областью без C1-домена, или Fc-областью. В частности, примером таковой является область, составленная из шарнирного участка, С2-домена и С3-домена из каждого из IgG, IgA и IgD, и является область, составленная из С2-домена, С3-домена и С4-домена из каждого из IgM и IgE. Особо предпочтительным примером таковой является Fc-область полученного у человека IgGl.

Указанный выше слитый полипептид имеет то преимущество, что слитый полипептид может быть исключительно легко очищен с помощью аффинной колоночной хроматографии с использованием свойства белка А, который специфически связывается с иммуноглобулиновым фрагментом, поскольку слитый полипептид согласно изобретению имеет часть константной области (например, Fc) иммуноглобулина, такого как IgG, как указывалось выше, в качестве партнера слияния. Более того, поскольку различные антитела против Fc различных иммуноглобулинов доступны, можно легко произвести иммунный анализ слитых полипептидов с помощью антител против Fc.

"Полипептид, который связывается с AILIM", включен в термин "полипептид", который в свою очередь является включенным в приведенное выше определение "вещества".

Специфическими примерами "полипептида, который связывается с AILIM", являются полипептид - взятый целиком или частично -, составляющий известные B7h, B7RP-1, GL50 или молекулу, называемую LICOS, которые являются лигандами, взаимодействующими с AILIM (Nature, Vol.402, No.6763, pp.827-832, 1999; Nature Medicine, Vol.5, No.12, pp.1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol.164, pp.1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol.10, No 6, pp.333-336, 2000).

Предпочтительно полипептидом является полипептид, содержащий - целиком или частично - внеклеточную область указанных выше лигандов (B7h, B7RP-1, GL50, LICOS), или слитый полипептид, содержащий указанный полипептид и - целиком или частично - константную область тяжелой цепи иммуноглобулина (предпочтительно иммуноглобулина человека). В данном описании термины "внеклеточная область" и "константная область тяжелой цепи иммуноглобулина" имеют такое же значение, какое было приведено выше.

Полипептид, часть полипептида (фрагмент) и слитый полипептид, указанный выше, может быть получен не только с помощью технологии рекомбинантной ДНК, как указано ниже, но и с помощью метода, харошо известного в данной области, такого как метод химического синтеза и метод культуры клеток, или же с помощью указанных методов с соответствующими модификациями.

"Антитело" согласно настоящему изобретению может быть поликлональным антителом (антисыворотка) или моноклональным антителом против AILIM млекопитающих (предпочтительно, в частности, AILIM человека), определяемым выше, и предпочтительно - моноклональным антителом.

В частности, антитело представляет собой антитело, обладающее активностью в отношении ингибирования пролиферации AILIM-экспрессирующих клеток путем связывания с AILIM, или ингибирования продукции интерферона γ или интерлейкина 4 AILIM-экспрессирующими клетками путем связывания с AILIM.

"Аллергия замедленного типа" в данном контексте означает аллергию, опосредованную клеточным иммунитетом (в частности, опосредованную Т-клеткой Th1-типа), т.е. аллергия опосредована Т-клеткой, сенсибилизированной антигеном (антиген, стимулирующий Т-клетку памяти), и относится к любой аллергии, при которой требуется приблизительно от 24 до 48 часов для проявления аллергической реакции, сопровождаемой воспалительной реакцией, вызванной указанными Т-клетками памяти, когда живой организм, сенсибилизированный антигеном, вновь соприкасается с тем же самым антигеном.

Такая аллергия замедленного типа включает в себя аллергию на инфекционный патогенный антиген, такую как туберкулиновая аллергия, происходящая из Mycobacterium tuberculosis, транзитная аллергия замедленного типа Jones-Mote на "минутное" количество белка (minute quantity of protein), контактная аллергия на химические вещества, такие как пикрилхлорид или растительный токсин, такой как лак, или аллергия, связанная с отторжением трансплантата, наблюдаемая в ответ на аллотрансплантат.

"Фармацевтическая композиция" означает здесь композицию, используемую в качестве лекарственного средства, включающего в себя в качестве эффективных ингредиентов антитело (предпочтительно антитело человека), которое связывается с AILIM (предпочтительно AILIM человека) или его часть, или моноклональное антитело (предпочтительно моноклональное антитело человека) или его часть, и "фармацевтически приемлемый носитель".

Указанный " фармацевтически приемлемый носитель" включает в себя эксципиент, разбавитель, расширитель (вещество, добавляемое для увеличения объема), деструктирующий агент, стабилизатор, консервант, буфер, эмульгатор, ароматизатор, краситель, подсластитель, агент, повышающий вязкость, вкусовую добавку, агент, повышающий растворимость, или другие добавки.

С использованием одного или более таких носителей фармацевтическая композиция может быть составлена в виде таблеток, подушечек, порошков, гранул, препарата для инъекций, растворов, капсул, пастилок, эликсиров, суспензий, эмульсий или сиропов.

Фармацевтическая композиция может быть введена перорально или парентерально. Другие формы парентерального введения включают в себя раствор для внешней аппликации, суппозитории для ректального введения и пессарий, предписываемые обычными способами и включающие в себя один или более активных ингредиентов.

Дозировка может варьировать, в зависимости от возраста, пола, веса больного и симптомов, эффективности лечения, пути введения, периода лечения или вида применяемого активного ингредиента (указанные выше полипептид или антитело), содержащегося в фармацевтической композиции. Обычно фармацевтическая композиция может быть назначена взрослому в дозе от 10 мкг до 1000 мг (или от 10 мкг до 500 мг) на одно введение. В зависимости от различных условий, в некоторых случаях может оказаться достаточной дозировка меньше той, которая указана выше, а в ином случае может оказаться необходимым назначение дозировки, которая больше той, которая указана выше.

В частности, для инъекции может быть произведено растворение или суспендирование антитела в нетоксичном фармацевтически приемлемом носителе, таком как физиологический раствор или коммерчески доступная дистиллированная вода для инъекций, с доведением концентрации от 0,1 мкг антитела /мл носителя до 10 мг антитела /мл носителя.

Полученный таким образом препарат для инъекций может быть введен человеку в случае необходимости в дозе от 1 мкг/кг до 100 мг/кг веса тела, предпочтительно от 50 мкг/кг до 50 мг/кг веса тела единожды или несколько раз в день. Примерами путей введения являются приемлемые с точки зрения медицины пути введения, такие как внутривенная инъекция, подкожная инъекция, внутрикожная инъекция, внутримышечная инъекция или внутрибрюшинная инъекция, предпочтительно внутривенная инъекция.

Препарат для инъекции может быть приготовлен в не-водном растворителе (например, пропиленгликоле, полиэтиленгликоле, растительном масле, таком как оливковое масло, и спирте, таком как этанол), в виде суспензии или эмульсии.

Препарат для инъекции можно стерилизовать путем фильтрации через непроницаемый для бактерий фильтр, путем смешивания его с бактерицидным агентом или путем облучения. Препарат для инъекции может быть получен в виде препарата, готового к употреблению. То есть он может представлять собой лиофилизированную твердую стерильную композицию, и перед употреблением может быть растворен в стерильной воде для инъекций или другом растворителе.

Фармацевтические композиции, включающие в себя человеческие антитела согласно изобретению, применимы в качестве фармацевтических препаратов, не вызывающих отторжения у хозяина благодаря НАМА (человеческое антимышиное антитело), для контроля различных биологических реакций (например, пролиферации клеток, экспрессирующих AILIM, продукции цитокина клетками, экспрессирующими AILIM, иммунного цитолизиса или гибели (апоптоз) клеток, экспрессирующих AILIM, и других), которые ассоциированы с AILIM-опосредованной передачей костимуляторного сигнала (вторичный сигнал) на AILIM-экспрессирующие клетки, и/или в качестве фармацевтических препаратов для лечения или предотвращения различных заболеваний путем супрессии или ингибирования запуска и/или прогрессии заболевания, ассоциированного с AILIM-опосредованной передачей сигнала.

Термин "иммунный цитолиз" в данном контексте означает биологическое явление, поясняемое ниже.

Лизис клетки (цитолиз) может быть вызван антителом (в частности, лизирующим клетку антителом), также как и взаимодействием с клеткой-киллером. Лизирующее клетку антитело представляет собой цитотоксическое антитело, которое, в частности, обладает лизирующей активностью по отношению к клеткам, таким как иммунные клетки, клетки тканей или сперма. Когда антитело связывается с антигеном клеточной поверхности, оно оказывает цитотоксическое действие на клетку или индуцирует цитолиз в присутствии комплемента.

Такой иммунный цитолиз индуцируется в результате действия комплемента в сочетании со специфическим связыванием антитела с антигеном клеточной поверхности. Антитело, связанное с поверхностным антигеном, активирует комплемент C1 (C1). Затем, в результате запуска целой серии комплементфиксирующих реакций с участием комплемента С2-С9 (С2-С9), образуются сайты повреждения клеток, и затем содержимое клеток высвобождается из клеток, и таким образом осуществляется их лизис.

Термин "антитело-зависимая клеточная токсичность" означает здесь биологическое явление, которое обозначается также как "ADCC" и представляет собой цитотоксическое действие на клетки-мишени эффекторными клетками, такими как лимфоциты, макрофаги или полиморфноядерные лейкоциты, и которое для своей реализации требует не только наличия эффекторных клеток и клеток-мишеней, но также и участия антитела в индуцировании явления цитотоксичности.

Термин "смешанная реакция лимфоцитов" означает здесь биологический феномен, обозначаемый как "MLR". Такую реакцию называют также смешанной реакцией лимфоцитов.

Аллогенные лейкоциты или лимфоциты, полученные у различных индивидуумов, смешивают друг с другом и культивируют в течение нескольких дней, создавая таким образом возможность образования клеточных бластов и синтеза ДНК в клетках (например, клеточная пролиферация). Такую реакцию обозначают как MLR (аллогенная MLR).

Синтез ДНК (клеточная пролиферация) можно анализировать путем остановки пролиферации любого из лимфоцитов. Остановка может быть вызвана в результате действия излучения или митомицина. Анализ может быть выполнен путем измерения количества ДНК, синтезируемой другой клеткой.

Количество синтезируемой ДНК можно определить путем измерения количества включенного в клеточное ядро тимидина, меченного радиоизотопом, таким как тритий.

ДНК, кодирующая AILIM (особенно предпочтительно AILIM человека) согласно данному изобретению, может быть получена согласно общеупотребимому способу с использованием процессов клонирования кДНК из мРНК, кодирующей AILIM; способу выделения геномной ДНК и ее сплайсинга; способу получения ДНК методом PCR с использованием последовательности кДНК или последовательности мРНК в качестве матрицы или способу химического синтеза ДНК.

ДНК, кодирующая лиганд AILIM согласно изобретению, можно получить тем же способом, что и описанный выше.

ДНК, кодирующая AILIM (особенно предпочтительно AILIM человека) согласно данному изобретению, может быть получена путем переваривания ДНК, включающей в себя ДНК, кодирующую AILIM, полученную как таковую, с использованием соответствующих ферментов рестрикции, и, если необходимо, путем лигирования полученного фрагмента ДНК с линкерной ДНК или меткой с помощью соответствующей ДНК-полимеразы и т.п. ДНК, кодирующая лиганд AILIM, также может быть получена таким же способом.

В качестве примера этот метод будет продемонстрирован ниже для клонирования кДНК, кодирующей AILIM (особенно предпочтительно AILIM человека; здесь этот способ отнесен к белку, представляющему интерес) на основе мРНК.

ДНК, кодирующая лиганд AILIM, также может быть получена таким же способом.

Во-первых, матричную РНК, кодирующую искомый белок, получают из тканей или клеток, экспрессирующих и продуцирующих искомый белок. мРНК может быть получена путем выделения тотальной РНК известным способом, таким как гуанидин-тиоцианатный метод (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry, Vol.18, p.5294, 1979), горячий фенольный метод или метод AGPC, и подвергнута аффинной хроматографии с использованием олиго-dT-целлюлозы или поли-U-сефарозы.

Затем, используя мРНК в качестве матрицы, синтезируют кДНК, например, хорошо известным методом с использованием обратной транскриптазы, таким как метод Okayama et al. (Mol. Cell. Biol. Vol.2, р.161 (1982); ibid. Vol.3, p.280 (1983)) или метод Hoffman et al. (Gene Vol.25, p.263 (1983)), и конвертируют в двунитевую кДНК. Библиотеку кДНК получают путем трансформации Е.coli плазмидными векторами, фаговыми векторами или космидными векторами, содержащими эту кДНК, или путем трансфицирования Е. coli после упаковки in vitro.

Плазмидные векторы, используемые в настоящем изобретении, не являются лимитированными, поскольку они реплицированы и сохранены в хозяевах. Могут быть использованы также любые фаговые векторы, которые могут быть реплицированы в хозяевах. Примерами используемых обычно клонирующих векторов являются pUC19, λgt10, λgt11 и т.д. Когда вектор применяют в иммунологическом скрининге, как указано ниже, предпочтительно используют вектор, имеющий промотор, который может экспрессировать в хозяине ген, кодирующий полипептид соглано изобретению.

кДНК может быть вставлена в плазмиду, например, методом Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, p.1.53, 1989). кДНК может быть вставлена в фаговый вектор, например, методом Hyunh et al. (DNA cloning, a practical approach, Vol.1, p.49 (1985)). Указанные методы могут быть с легкостью воплощены с использованием коммерчески доступного клонирующего набора (например, производства Takara Shuzo). Рекомбинантная плазмида или фаговый вектор, полученные таким образом, вводятся в соответствующие хозяйские клетки, такие как прокариоты (например, Е. coli: XLlBlue MRF', DH5α, HB101, МС1061/Р3 и т.д.).

Примерами способа введения плазмиды в хозяйскую клетку являются метод хлорида кальция, метод хлорида кальция/хлорида рубидия, описанный в публикации Molecular Cloning, A Laboratory Manual (second edition. Cold Spring Harbor Laboratory, p.1.74 (1989)), и метод электропорации. Фаговые векторы могут быть введены в хозяйские клетки, например, с помощью метода, в котором фаговые ДНК вводятся в растущих хозяев после упаковки in vitro. Упаковку in vitro можно с легкостью реализовать с использованием коммерчески доступного набора для упаковки in vitro (например, производства Stratagene или Amersham).

кДНК, кодирующая полипептид соглано изобретению, может быть выделена из библиотеки кДНК, полученной в соответствии со способом, указанным выше, путем комбинирования общих методов скрининга кДНК.

Например, клон, содержащий кДНК, может быть подвергнут скринингу с помощью известного метода гибридизации колоний (Crunstein et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.72, p.3961 (1975)) или метода гибридизации в бляшках (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory, p.2.108 (1989)), используя ³²Р-меченные химически синтезированные олигонуклеотиды в качестве проб, которые соответствуют аминокислотной последовательности полипептида согласно изобретению. Альтернативно, клон, содержащий фрагмент ДНК, кодирующий специфическую область внутри полипептида согласно изобретению, может быть подвергнут скринингу путем амплификации указанной области методом PCR с использованием синтетических PCR-праймеров.

При использовании библиотеки кДНК, полученной с помощью кДНК экспрессирующего вектора (например, фагового вектора λZAPII), можно, используя антитело против полипептида согласно изобретению, подвергнуть скринингу требуемый клон с помощью реакции антиген-антитело. Метод скрининга с использованием метода PCR предпочтительно использовать в тех случаях, когда скринингу должны быть подвергнуты многочисленные клоны.

Последовательность нуклеотидов полученной таким образом ДНК может быть определена методом Maxam-Gilbert (Maxam et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.74, p.560 (1977)) или же методом терминации синтеза цепи дидезоксинуклеотидами с помощью фага М13 (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.74, pp.5463-5467 (1977)). Ген, кодирующий полипептид согласно изобретению, целиком или частично может быть получен путем вырезания клона, полученного, как указано выше, с помощью ферментов рестрикции, и т.д.

ДНК, кодирующая полипептид согласно изобретению, может быть выделена из геномной ДНК, полученной из клеток, экспрессирующих полипептид согласно изобретению, как указано выше, с использованием следующих методов.

Такие клетки предпочтительно солюбилизируют под действием SDS или протеиназы К, и ДНК депротеинизируют путем повторной фенольной экстракции. РНК предпочтительно подвергают перевариванию рибонуклеазой. Полученные ДНК частично переваривают с помощью соответствующих рестрикционных ферментов и полученные фрагменты ДНК амплифицируют, используя соответствующий фаг или космид, с получением библиотеки. Затем определяют клоны, имеющие искомую последовательность, например, с помощью радиоактивно меченных ДНК-проб и из этих клонов путем вырезания соответствующими рестрикционными ферментами и т.д. получают - целиком или частично - ген, кодирующий полипептид согласно изобретению.

Получение ДНК, кодирующей искомый белок, с помощью PCR может быть выполнено с использованием известных мРНК или кДНК, кодирующих искомый белок, в качестве матрицы, в соответствии с традиционным методом ("PCR techniques for gene amplification - fundamental and new technologies" KYORITSU SHUPPAN, 1992, etc.).

ДНК, кодирующая искомый белок, может быть также синтезирована химически с помощью обычно используемого способа, основанного на нуклеотидной последовательности, кодирующей искомый белок.

AILIM согласно изобретению (особенно предпочтительно AILIM человека) или часть ее (предпочтительно внеклеточная область) может быть получена в виде рекомбинантного белка, согласно традиционному способу с применением общеизвестной рекомбинантной технологии, с помощью ДНК, полученной путем вырезания ДНК, кодирующей AILIM (кДНК или содержащей интрон геномной ДНК), соответствующими ферментами рестрикции, на основе метода, проиллюстрированного выше, с получением фрагмента ДНК, кодирующего AILIM, а затем, в случае необходимости, лигирования полученного фрагмента ДНК с линкерной ДНК или меткой, используя соответствующую ДНК-полимеразу или тому подобное.

Лиганд AILIM (особенно предпочтителен лиганд AILIM человека) или ее части (предпочтительно внеклеточная область) может быть получен таким же способом.

Ниже проиллюстрированы специфические примеры. В частности, чтобы получить экспрессирующий вектор, ДНК, полученную, как описано выше, вставляют в вектор, который будет подробно описан ниже. Затем экспрессирующий вектор используют для трансформации клетки-хозяина, как описано ниже, для получения трансформанта. Трансформант культивируют, давая ему возможность продуцировать искомый белок в культуральный супернатант. Из культурального супернатанта искомый белок может быть легко очищен с использованием колоночной хроматографии и прочего.

Для продукции рекомбинантной AILIM (или ее внеклеточной области) не существует особых ограничений в отношении типа экспрессирующего вектора, поскольку вектор реплицирован и сохранен или же автономно продуцируется в любом из различных хозяев, таких как прокариотические и/или эукариотические клетки. Такие экспрессирующие векторы включают в себя плазмидные векторы и фаговые векторы (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985).

Экспрессирующий вектор легко можно получить обычным способом путем лигирования ДНК, кодирующей AILIM (или ее внеклеточную область), с рекомбинантным вектором, доступным в данной области (плазмидная ДНК и ДНК бактериофага). Специфическими примерами используемых рекомбинантных векторов являются полученные из Е.coli плазмиды, такие как pBR322, pBR325, pUC12, pUC13 и pUC19, плазмиды, полученные из дрожжей, такие как рSН19 и pSH15, и плазмиды, полученные из Bacillus subtilis, такие как pUBHO, pTP5 и рС194. Примерами фагов являются бактериофаг, такой как фаг λ, и вирус животных или насекомых (pVL1393, Invitrogen), такой как ретровирус, вирус коровьей оспы и вирус ядерного полиэдроза.

Плазмидные векторы используются, когда ДНК, кодирующая AILIM согласно изобретению (особенно предпочтительно AILIM человека) или ее растворимую внеклеточную область, предназначена для экспрессии в клетке-хозяине, таким образом экспрессируя AILIM на поверхности клетки-хозяина, или - альтернативно - предназначена для продукции растворимой внеклеточной области AILIM (особенно предпочтительно AILIM человека). Нет особых ограничений в отношении таких плазмидных векторов, поскольку эти векторы могут экспрессировать ген, кодирующий AILIM (особенно предпочтительно AILIM человека) или ее растворимую внеклеточную область, и продуцировать кодируемый белок в различных клетках-хозяевах, таких как прокариотические клетки и/или эукариотические клетки. Например, такие плазмиды включают в себя pMAL C2, pcDNA3.1 (-), pEF-BOS (Nucleic Acid Research, Vol.18, p.5322, 1990; etc.), pME18S ("Handbook for genetic engineering, "Experimental Medicine, supplement, 1992; и т.д.) и т.д.

Когда бактерии, в частности Е.Coli, используются в качестве клетки-хозяина, экспрессирующий вектор обычно состоит по меньшей мере из района оператора-промотора, инициирующего кодона, ДНК, кодирующей белок соглано изобретению, терминирующего кодона, области терминации и репликона.

Когда в качестве клетки-хозяина используются дрожжи, клетки животных или клетки насекомых, экспрессирующий вектор предпочтительно состоит по меньшей мере из промотора, инициирующего кодона, ДНК, кодирующей AILIM (особенно предпочтительно AILIM человека) согласно изобретению или ее внеклеточную область, и терминирующего кодона. Он может содержать также ДНК, кодирующую сигнальный пептид, энхансерную последовательность, 5'- и 3'-нетранслируемую область гена, кодирующего AILIM согласно изобретению, границы сплайсинга, сайты полиаденилирования, область селектируемого маркера и репликон. Экспрессирующий вектор может содержать также, в случае необходимости, обычно используемый ген амплификации генов (маркер).

Область оператора-промотора для экспрессии AILIM (особенно предпочтительно AILIM человека) согласно изобретению или ее внеклеточной области в бактерии включает в себя промотор, оператор и последовательность Shine-Dalgarno (SD) (например, AAGG). Например, когда хозяином является Escherlchia, он предпочтительно включает в себя промотор Тгр, промотор lac, промотор гесА, промотор λPL, промотор lpp, промотор tac и им подобные.

Примерами промоторов для экспрессии AILIM (особенно предпочтительно AILIM человека) согласно изобретению или ее внеклеточной области в дрожжах являются промотор РН05, промотор PGK, промотор GAP, промотор ADH и т.д. Когда хозяином выступает Bacillus, примерами промоторов могут быть промотор SL01, промотор SP02, промотор penP и т.д.

Когда в качестве хозяина выступает эукариотическая клетка, такая как клетка млекопитающих, примерами промоторов являются промотор, полученный из SV40, ретровирусный промотор, промотор теплового шока и т.д. Следует отметить, что промоторы не ограничиваются приведенными выше примерами. Кроме того, для экспрессии эффективно применение энхансера.

Предпочтительным инициирующим кодоном является, например, метиониновый кодон (ATG).

В качестве терминирующего кодона показан обычно используемый терминирующий кодон (например, TAG, TGA, ТАА и т.д.).

В качестве терминирующей области используются применяемые обычно природные или синтетические терминаторы.

Репликон означает ДНК, способную к репликации полной последовательности ДНК в клетке-хозяине, и включает в себя природную плазмиду, искусственно модифицированную плазмиду (фрагмент ДНК, полученный из природной плазмиды), искусственную плазмиду и т.д. Примерами предпочтительных плазмид являются pBR322 или их искусственные производные (фрагмент ДНК, полученный путем обработки pBR322 соответствующими рестрикционными ферментами) для Е.coil, дрожжевая плазмида 2 μ или хромосомная дрожжевая ДНК для дрожжей, и pRSVneo ATCC 37198, pSV2dhfr ATCC 37145, pdBPV-MMTneo ATCC 37224, pSV2neo ATCC 37149, pSV2bsr и т.д. для клеток млекопитающих.

Обычно в данной области используются энхансерная последовательность, сайт полиаденирования и место сплайсинга, в частности могут быть использованы энхансерная последовательность, сайт полиаденирования и место сплайсинга, полученные из SV40.

Обычно используемый селективный маркер может быть использован в соответствии с применяемым методом. Примерами такового могут являться резистентные к антибиотикам гены, такие как тетрациклиновый ген и ген тимидинкиназы.

Примерами генов для генной амплификации являются ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), ген тимидинкиназы, ген резистентности к неомицину, ген глутаматсинтазы, ген аденозиндезаминазы, ген орнитиндекарбоксилазы, ген гигромицин-В-фосфотрансферазы, ген аспартаттранскарбамилазы и т.д.

Экспрессирующий вектор согласно изобретению может быть получен в результате непрерывного и кругового сшивания по меньшей мере указанного выше промотора, инициирующего кодона, ДНК, кодирующей белок согласно изобретению, терминирующего кодона и области терминации с соответствующим репликоном. Если нужно, соответствующие фрагменты ДНК (например, линкеры, рестрикционные сайты, вырабатываемые другими рестрикционными ферментами) могут быть использованы обычным способом, таким как переваривание рестрикционными ферментами или лигирование с помощью ДНК-лигазы Т4.

Трансформанты согласно изобретению могут быть получены путем введения экспрессирующего вектора, указанного выше, в клетки-хозяева.

Хозяйские клетки, используемые в настоящем изобретении, не лимитированы, поскольку они совместимы с экспрессирующим вектором, указанным выше, и могут быть трансформированы. Примерами таковых могут являться различные клетки, такие как природные клетки или полученные искусственным путем рекомбинантные клетки, обычно используемые в технологии данного изобретения (например, бактерии (Escherichia и Bacillus), дрожжи (Saccharomyces, Pichia и т.д.), клетки животных или клетки насекомых.

Предпочтительно используются Е.coli или животные клетки. Специфическими примерами являются Е.coli (DH5α, DH10B, ТВ1, НВ101, XL-2Blue и т.д.), клетки, полученные у мышей (СОР, L, C127, Sp2/0, NS-1, NIH 3Т3 и т.д.), клетки, полученные у крыс, клетки, полученные у хомяка (ВНК, СНО и т.д.), клетки, полученные у обезьян (COS1, COS3, COS7, CV1, Velo и т.д.), и клетки, полученные у человека (Hela, клетки, полученные из диплоидных фибробластов, клетки миеломы, клетки Namalwa и т.д.).

Экспрессирующий вектор может быть введен (трансформирован (трансдуцирован)) в клетки-хозяева известными способами.

Трансформация может быть предпринята, например, в соответствии с методом Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.69, p.2110 (1972)), методом протопластов (Mol. Gen. Genet., Vol.168, p.111 (1979)) или методом компетентности (J. Mol. Biol., Vol.56, p.209 (1971)), когда клетками-хозяевами являются бактерии (Е. coil, Bacillus subtilis и т.д.), методом Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.75, р.1927 (1978)) или литиевым методом (J. Bacteriol., Vol.153, p.163 (1983)), когда клетками-хозяевами являются Saccharomyces cerevisiae, методом Graham (Virology, Vol.52, p.456 (1973)), когда клетками-хозяевами являются животные клетки, и методом Summers et al. (Mol. Cell. Biol., Vol.3, pp.2156-2165 (1983)), когда клетками-хозяевами являются клетки насекомых.

Внеклеточная область AILIM (особенно предпочтительно AILIM человека) согласно изобретению (растворимая AILIM) может быть получена путем культивирования трансформантов (в дальнейшем этот термин будет включать в себя трансдуктанты), содержащих экспрессирующий вектор, полученный, как было описано выше, в питательной среде. Лиганд AILIM может быть получен таким же способом.

Питательная среда предпочтительно включает в себя источник углерода, источник неорганического азота или источник органического азота, необходимые для роста клеток-хозяев (трансформантов). Примерами источника углерода являются глюкоза, декстран, растворимый крахмал и сахароза, а примерами источника неорганического или органического азота являются соли аммония, нитраты, аминокислоты, экстракт замоченной кукурузы, пептон, казеин, мясной экстракт, крошка соевых бобов и экстракт картофеля. В случае необходимости они могут включать в себя и другие питательные вещества (например, неорганическую соль, например хлорид кальция, дигидрофосфат натрия и хлорид магния), витамины, антибиотики (например, тетрациклин, неомицин, ампициллин, канамицин и т.д.).

Культивирование предпринимают способом, известным в данной области. Условия культивирования, такие как температура, рН среды и время культивирования, выбирают, соответственно, таким образом, чтобы получить повышенный уровень продукции белка согласно изобретению.

Специфическая среда и условия культивирования, используемые в зависимости от используемых клеток-хозяев, проиллюстрированы ниже примерами, но ими не ограничиваются.

Когда хозяевами являются бактерии, актиномицеты, дрожжи, нитевидные грибы, приемлемой является жидкая среда, включающая в себя источники питания, указанные выше. Предпочтительно используются среды, имеющие рН от 5 до 8.

Когда хозяином является Е.coli, примерами предпочтительных сред являются среда LB, среда М9 (Miller et al. Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, p.431 (1972)), среда YT и т.д. Используя эти среды, обычно культивирование проводят при 14-43°С примерно в течение 3-24 часов в условиях аэрации и перемешивания, если это является необходимым.

Когда хозяином является Bacillus, обычно культивирование проводят при 30-40°С примерно в течение 16-96 часов в условиях аэрации и перемешивания, если это является необходимым.

Когда в качестве хозяина выступают дрожжи, примером среды может служить минимальная среда Burkholder (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, p.4505 (1980)). рН предпочтительно соответствует 5-8. Обычно культивирование может быть предпринято примерно при 20-35°С приблизительно в течение 14-144 часов в условиях аэрации и перемешивания, если это является необходимым.

Когда в качестве хозяина выступают животные клетки, примерами среды являются среда MEM, содержащая примерно от 5 до 20% эмбриональной бычьей сыворотки (Science, Vol.122, p.501 (1952)), среда DMEM (Virology, Vol.8, p.396 (1959)), среда RPMI1640 (J. Am. Med. Assoc., Vol.199, p.519 (1967)), среда 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.73, p.1 (1950)), среда HamF12 и т.д. рН среды предпочтительно составляет от 6 до 8. Обычно культивирование может быть предпринято примерно при 30-40°С приблизительно в течение 15-72 часов в условиях аэрации и перемешивания, если это является необходимым.

Когда в качестве хозяина выступают клетки насекомых, примером среды является среда Grace, содержащая эмбриональную бычью сыворотку (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.82, p.8404 (1985)). рН этой среды предпочтительно составляет от 5 до 8. Обычно культивирование может быть предпринято примерно при 20-40°С приблизительно в течение 15-100 часов в условиях аэрации и перемешивания, если это является необходимым.

Внеклеточная область AILIM (растворимая AILIM) согласно изобретению (особенно предпочтительна AILIM человека) может быть получена путем культивирования указанных выше трансформированных клеток (в частности, животных клеток или Е.coli), при котором происходит секреция белка в культуральный супернатант. Именно культуральный фильтрат (супернатант) получают таким методом как фильтрация или центрифугирование полученной культуры, и из культурального фильтрата обычно используемым традиционным способом выделяют и очищают полипептид или полипептидный фрагмент согласно изобретению в соответствии с обычно используемыми традиционными способами очистки и выделения природных или синтетических белков.

Примерами способов выделения и очистки является метод, в котором используется специфическая аффинность, такой как аффинная хроматография, метод, в котором используется растворимость, такой как высаливание, и метод осаждения из раствора, метод, в котором используется различие в молекулярной массе, такой как диализ, ультрафильтрация, гель-фильтрация и электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, метод с использованием зарядов, такой как ионообменная хроматография и хроматография на гидроксиапатите, метод, в котором используется различие в гидрофобности, такой как высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой, и метод, в котором используется различие в изоэлектрических точках, такой как изоэлектрофокусирование.

Когда белок согласно изобретению находится в периплазме или цитоплазме культивируемых тарнсформантов, прежде всего грибковые тела или клетки собирают обычным способом, таким как фильтрация или центрифугирование, и суспендируют в подходящем буфере. Затем клеточную стенку и/или клеточную мембрану и пр. разрушают таким способом как лизис с помощью ультразвука, лизоцима и способом замораживания-оттаивания, мембранную фракцию, содержащую полипептид согласно изобретению, получают таким методом как центрифугирование или фильтрация. Мембранную фракцию солюбилизируют с помощью детергента, такого как Triton-X100, для получения грубого экстракта. Наконец, полипептид или полипептидный фрагмент выделяют из грубого экстракта и очищают известными методами, как показано выше.

В настоящем изобретении термин "нерастворимый носитель" означает носитель, который используется для иммобилизации на нем полипептида в результате физической адсорбции или химического связывания. Носитель может быть, например, (1) планшетом, пробиркой, трубкой или им подобным, имеющим внутреннюю поверхность, бусинкой, шариком, фильтром, мембраной или им подобным, сделанным из водонерастворимых материалов, включая пластик, такой как полистирольная смола, поликарбонатная смола, силиконовая смола или нейлоновая смола, или стекло, и (2) нерастворимым носителем, используемым при аффинной хроматографии, таким как целлюлозный носитель, агарозный носитель, полиакриламидный носитель, декстрановый носитель, полистирольный носитель, поливинилспиртовой носитель, полиаминокислотный носитель, пористый кремнеземный носитель и т.д.

"Меченое вещество, способное производить регистрируемый сигнал", согласно изобретению включает в себя, например, фермент, флуоресцентный материал, люминесцентный материал, биотин, авидин или радиоизотоп, более конкретно ферменты, такие как пероксидаза (например, пероксидаза хрена), щелочная фосфатаза, β-D-галактозидаза, глюкозоксидаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, алкогольдегидрогеназа, малатдегидрогеназа, пенициллиназа, каталаза, аро-глюкозоксидаза, уреаза, люцифераза, ацетилхолинэстераза и т.д.; флуоресцентные материалы, такие как флуоресцеинизотиоцианат, белок фикобилин, агенты, хелатирующие редкоземельные металлы, дансилхлорид, тетраметил-родамин-изотиоцианат и т.д.; радиоизотопы, такие как ³H, ¹⁴С, ¹²⁵I, ¹³¹I и т.д.; биотин, авидин и люминесцентный материал.

Среди прочих, радиоизотопный или флуоресцентный материал может обеспечивать регистрируемый сигнал, даже когда используется индивидуально. С другой стороны, фермент, люминесцентный материал, биотин или авидин при их индивидуальном использовании не обеспечивают регистрируемого сигнала, но при их реагировании с одним или более веществами они могут производить регистрируемый сигнал. Например, когда меткой является фермент, для его регистрации необходим по меньшей мере субстрат. Могут быть использованы различные виды субстратов, в зависимости от разновидности способа измерения ферментативной активности (колориметрия, флуороскопия, метод с использованием биолюминесценции или химической люминесценции и т.д.). Например, когда меткой является пероксидаза, в качестве субстрата можно использовать перекись водорода. Альтернативно, когда меткой является биотин, обычно используются, не ограничиваясь этим, авидин или ферментативно модифицированный авидин. В случае необходимости могут быть использованы различные люминесцентные вещества, в зависимости от типа используемого субстрата.

Любая из указанных выше меток может быть использована в настоящем изобретении. Однако предпочтительной меткой является фермент, такой как пероксидаза или биотин, с учетом чувствительности метода регистрации или анализа, а также удобства манипуляции.

"Способ идентификации вещества, способного связываться с AILIM или лигандом AILIM", согласно изобретению построен на принципе иммунного анализа.

В частности, могут быть применены принципы различных способов, как описано в публикации "Immunoassay (3^rd Edition., eds., Eiji Ishikawa et al, Igakushoin, 1987)".

Примеры предпочтительно используемых принципов включают в себя твердофазный метод одного антитела, жидкофазный метод двойных антител, твердофазный метод двойных антител, сэндвич-метод и one-pot-метод, как описано в опубликованной, прошедшей экспертизу патентной заявке Японии (JP-B) No. Hei 2-39747. Кроме того, в качестве примера можно привести способ анализа с использованием реакции антиген-антитело методом EMIT (иммуноанализ с ферментативным усилением), иммуноферментный анализ с образованием "метаболических каналов", иммуноанализ с энзимомодуляцией (EMMIA), иммуноанализ с ингибитором фермента, иммуноэнзимометрический анализ, иммуноанализ с ферментативным усилением и иммуноанализ проксимального связывания.

В настоящем изобретении, в зависимости от конкретной цели, может быть выбран любой из таких принципов иммуноанализа. Однако с учетом удобства производимых процедур и/или экономического преимущества, и в частности клинической многосторонности, преимущественно используются принцип сэндвич-метода, one-pot-метода или твердофазного метода одного антитела, более предпочтительно сэндвич-метода или one-pot-метода. Особенно предпочтительным является сэндвич-метод с использованием многолуночного микропланшета со множеством лунок, например, такого как 96-луночный микропланшет, или one-pot-метод с использованием бусинок, на которых иммобилизуется полипептид, а также с использованием дополнительного мечения ферментом, таким как пероксидаза, или биотином.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показаны соответствующие реактивности антитела против IgG человека, антитела против Ig человека и антитела против IgFc в отношении человеческого моноклонального антитела против AILIM человека, анализируемые методом клеточного ELISA с использованием проточного цитометра.

На панелях (а)-(l) продемонстрированы соответствующие результаты анализа, указанного ниже.

Панель (а): результат анализа, в котором меченное биотином антитело против человеческого IgG было добавлено в качестве вторичного антитела в отсутствие первичного антитела в микропланшет, где были нанесены клетки HPB-ALL дикого типа.

Панель (b): результат анализа, в котором меченное биотином антитело против человеческого Ig было добавлено в качестве вторичного антитела в отсутствие первичного антитела в микропланшет, где были нанесены клетки HPB-ALL дикого типа.

Панель (с): результат анализа, в котором меченное биотином антитело против человеческого IgFc было добавлено в качестве вторичного антитела в отсутствие первичного антитела в микропланшет, где были нанесены клетки HPB-ALL дикого типа.

Панель (d): результат анализа, в котором человеческое моноклональное антитело против AILIM человека, JMab-136, было использовано в качестве первичного антитела, а меченное биотином антитело против IgG человека было использовано в качестве вторичного антитела.

Панель (е): результат анализа, в котором человеческое моноклональное антитело против AILIM человека, JMab-136, было использовано в качестве первичного антитела, а меченное биотином антитело против IgK человека было использовано в качестве вторичного антитела.

Панель (f): результат анализа, в котором человеческое моноклональное антитело против AILIM человека, JMab-136, было использовано в качестве первичного антитела, а меченное биотином антитело против IgFc человека было использовано в качестве вторичного антитела.

Панель (g): результат анализа, в котором человеческое моноклональное антитело против AILIM человека, JMab-138, было использовано в качестве первичного антитела, а меченное биотином антитело против IgG человека было использовано в качестве вторичного антитела.

Панель (h): результат анализа, в котором человеческое моноклональное антитело против AILIM человека, JMab-138, было использовано в качестве первичного антитела, а меченное биотином антитело против IgK человека было использовано в качестве вторичного антитела.

Панель (i): результат анализа, в котором человеческое моноклональное антитело против AILIM человека, JMab-138, было использовано в качестве первичного антитела, а меченное биотином антитело против IgFc человека было использовано в качестве вторичного антитела.

Панель (j): результат анализа, в котором человеческое моноклональное антитело против AILIM человека, JMab-139, было использовано в качестве первичного антитела, а меченное биотином антитело против IgG человека было использовано в качестве вторичного антитела.

Панель (k): результат анализа, в котором человеческое моноклональное антитело против AILIM человека, JMab-139, было использовано в качестве первичного антитела, а меченное биотином антитело против IgK человека было использовано в качестве вторичного антитела.

Панель (l): результат анализа, в котором человеческое моноклональное антитело против AILIM человека, JMab-139, было использовано в качестве первичного антитела, а меченное биотином антитело против IgFc человека было использовано в качестве вторичного антитела.

Кривая с полыми символами в каждой панели соответствует результату анализа, в котором моноклональное антитело человека против KLH было использовано в качестве контрольного антитела.

На фиг.2 показана калибровочная кривая, соответствующая моноклональному антителу IgG человека (стандартный материал), анализируемая сэндвич-методом ELISA с помощью антитела против IgG человека.

На вертикальной оси отложена интенсивность флуоресценции, а на горизонтальной оси показана концентрация стандартного материала.

На фиг.3 показаны активности связывания различных мышиных моноклональных антител против AILIM человека с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM человека, или с клетками СНО дикого типа.

На вертикальной оси отложена интенсивность флуоресценции как показатель активности связывания с рекомбинантными клетками, а на горизонтальной оси показана концентрация добавленного антитела.

Термин "СНО" на фигуре означает результат анализа связывания с клетками СНО дикого типа, а "человек" означает результат анализа связывания с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM человека.

На фиг.4 показаны активности связывания различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека или человеческих моноклональных антител против KLH человека в качестве отрицательного контроля с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM человека, или с клетками СНО дикого типа.

На вертикальной оси отложена интенсивность флуоресценции как показатель активности связывания с рекомбинантными клетками, а на горизонтальной оси показана концентрация добавленного антитела.

Термин "СНО" на фигуре означает результат анализа связывания с клетками СНО дикого типа, а "человек" означает результат анализа связывания с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM человека.

На фиг.5 показаны активности связывания различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM человека, или с клетками СНО дикого типа.

На вертикальной оси отложена интенсивность флуоресценции как показатель активности связывания с рекомбинантными клетками, а на горизонтальной оси показана концентрация добавленного антитела.

Термин "СНО" на фигуре означает результат анализа связывания с клетками СНО дикого типа, а "человек" означает результат анализа связывания с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM человека.

На фиг. 6 показаны активности связывания различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM человека, или с клетками СНО дикого типа.

На вертикальной оси отложена интенсивность флуоресценции как показатель активности связывания с рекомбинантными клетками, а на горизонтальной оси показана концентрация добавленного антитела.

Термин "СНО" на фигуре означает результат анализа связывания с клетками СНО дикого типа, а "человек" означает результат анализа связывания с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM человека.

На фиг.7 показаны активности связывания крысиных моноклональных антител против AILIM человека с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM мыши, или с клетками СНО дикого типа.

На вертикальной оси отложена интенсивность флуоресценции как показатель активности связывания с рекомбинантными клетками, а на горизонтальной оси показана концентрация добавленного антитела.

Термин "СНО" на фигуре означает результат анализа связывания с клетками СНО дикого типа, а "мышь" означает результат анализа связывания с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM мыши.

На фиг.8 показаны активности связывания различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека или человеческих моноклональных антител против KLH человека в качестве отрицательного контроля с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM мыши, или с клетками СНО дикого типа.

На вертикальной оси отложена интенсивность флуоресценции как показатель активности связывания с рекомбинантными клетками, а на горизонтальной оси показана концентрация добавленного антитела.

Термин "СНО" на фигуре означает результат анализа связывания с клетками СНО дикого типа, а "мышь" означает результат анализа связывания с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM мыши.

На фиг.9 показаны активности связывания различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM мыши, или с клетками СНО дикого типа.

На вертикальной оси отложена интенсивность флуоресценции как показатель активности связывания с рекомбинантными клетками, а на горизонтальной оси показана концентрация добавленного антитела.

Термин "СНО" на фигуре означает результат анализа связывания с клетками СНО дикого типа, а "мышь" означает результат анализа связывания с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM мыши.

На фиг.10 показаны активности связывания различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM мыши, или с клетками СНО дикого типа.

На вертикальной оси отложена интенсивность флуоресценции как показатель активности связывания с рекомбинантными клетками, а на горизонтальной оси показана концентрация добавленного антитела.

Термин "СНО" на фигуре означает результат анализа связывания с клетками СНО дикого типа, а "мышь" означает результат анализа связывания с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM мыши.

На фиг.11 показаны активности связывания различных мышиных моноклональных антител против AILIM крысы с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM крысы, или с клетками СНО дикого типа.

На вертикальной оси отложена интенсивность флуоресценции как показатель активности связывания с рекомбинантными клетками, а на горизонтальной оси показана концентрация добавленного антитела.

Термин "СНО" на фигуре означает результат анализа связывания с клетками СНО дикого типа, а "крыса" означает результат анализа связывания с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM крысы.

На фиг.12 показаны активности связывания различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека или человеческих моноклональных антител против KLH человека в качестве отрицательного контроля с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM крысы, или с клетками СНО дикого типа.

На вертикальной оси отложена интенсивность флуоресценции как показатель активности связывания с рекомбинантными клетками, а на горизонтальной оси показана концентрация добавленного антитела.

Термин "СНО" на фигуре означает результат анализа связывания с клетками СНО дикого типа, а "крыса" означает результат анализа связывания с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM крысы.

На фиг.13 показаны активности связывания различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM крысы, или с клетками СНО дикого типа.

На вертикальной оси отложена интенсивность флуоресценции как показатель активности связывания с рекомбинантными клетками, а на горизонтальной оси показана концентрация добавленного антитела.

Термин "СНО" на фигуре означает результат анализа связывания с клетками СНО дикого типа, а "крыса" означает результат анализа связывания с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM крысы.

На фиг.14 показаны активности связывания различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM крысы, или с клетками СНО дикого типа.

На вертикальной оси отложена интенсивность флуоресценции как показатель активности связывания с рекомбинантными клетками, а на горизонтальной оси показана концентрация добавленного антитела.

Термин "СНО" на фигуре означает результат анализа связывания с клетками СНО дикого типа, а "крыса" означает результат анализа связывания с рекомбинантными клетками СНО, демонстрирующими повышенную экспрессию AILIM крысы.

На фиг.15 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор А" в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными мышиными моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с мышиным моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На фиг.16 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор А", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с человеческим моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На фиг.17 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор В", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными мышиными моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с мышиным моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³H]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "JHC1" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против СЕТР человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На фиг.18 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор В", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с человеческим моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На фиг.19 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор В", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с человеческим моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На фиг.20 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор С", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными мышиными моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с мышиным моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "JHC1" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против СЕТР человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На фиг.21 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор С", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с человеческим моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"124": человеческое моноклональное антитело JMab124 против AILIM человека,

"126": человеческое моноклональное антитело JMab126 против AILIM человека,

"127": человеческое моноклональное антитело JMab127 против AILIM человека.

На фиг.22 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор С", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с человеческим моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"128": человеческое моноклональное антитело JMab128 против AILIM человека,

"135": человеческое моноклональное антитело JMab135 против AILIM человека,

"136": человеческое моноклональное антитело JMab136 против AILIM человека.

На фиг.23 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор С", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с человеческим моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"137": человеческое моноклональное антитело JMab137 против AILIM человека,

"138": человеческое моноклональное антитело JMab138 против AILIM человека,

"139": человеческое моноклональное антитело JMab139 против AILIM человека.

На фиг.24 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор С", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с человеческим моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"140": человеческое моноклональное антитело JMab140 против AILIM человека,

"141": человеческое моноклональное антитело JMab141 против AILIM человека.

На фиг.25 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор D", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными мышиными моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с мышиным моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "JHC1" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против СЕТР человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На фиг.26 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор D", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с человеческим моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"124": человеческое моноклональное антитело JMab124 против AILIM человека,

"126": человеческое моноклональное антитело JMab126 против AILIM человека,

"127": человеческое моноклональное антитело JMab127 против AILIM человека.

На фиг.27 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор D", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с человеческим моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"128": человеческое моноклональное антитело JMab128 против AILIM человека,

"135": человеческое моноклональное антитело JMab135 против AILIM человека,

"136": человеческое моноклональное антитело JMab136 против AILIM человека.

На фиг.28 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор D", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с человеческим моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"137": человеческое моноклональное антитело JMab137 против AILIM человека,

"138": человеческое моноклональное антитело JMab138 против AILIM человека,

"139": человеческое моноклональное антитело JMab139 против AILIM человека.

На фиг.29 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор D", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с человеческим моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"140": человеческое моноклональное антитело JMab140 против AILIM человека,

"141": человеческое моноклональное антитело JMab141 против AILIM человека.

На фиг.30 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор Е", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными мышиными моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с мышиным моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "JHC1" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против СЕТР человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На фиг.31 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор Е", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с человеческим моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"124": человеческое моноклональное антитело JMab124 против AILIM человека,

"126": человеческое моноклональное антитело JMab126 против AILIM человека,

"127": человеческое моноклональное антитело JMab127 против AILIM человека.

На фиг.32 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор Е", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с человеческим моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"128": человеческое моноклональное антитело JMab128 против AILIM человека,

"135": человеческое моноклональное антитело JMab135 против AILIM человека,

"136": человеческое моноклональное антитело JMab136 против AILIM человека.

На фиг.33 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор Е", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с человеческим моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"137": человеческое моноклональное антитело JMab137 против AILIM человека,

"138": человеческое моноклональное антитело JMab138 против AILIM человека,

"139": человеческое моноклональное антитело JMab139 против AILIM человека.

На фиг.34 показана пролиферативная активность T-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор Е", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека с помощью микропланшета, покрытого моноклональным антителом против CD3 человека вместе с человеческим моноклональным антителом против AILIM человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"140": человеческое моноклональное антитело Jmab140 против AILIM человека,

"141": человеческое моноклональное антитело Jmab141 против AILIM человека.

На фиг.35 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор D", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными мышиными моноклональными антителами против AILIM человека, когда в микропланшет, покрытый моноклональным антителом против CD3 человека, добавляли только раствор мышиного моноклонального антитела против AILIM человека (в жидкой фазе).

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "JHC1" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против СЕТР человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На фиг.36 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор D", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека, когда в микропланшет, покрытый моноклональным антителом против CD3 человека, добавляли только раствор человеческого моноклонального антитела против AILIM человека (в жидкой фазе).

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"124": человеческое моноклональное антитело JMab124 против AILIM человека,

"125": человеческое моноклональное антитело JMab125 против AILIM человека,

"126": человеческое моноклональное антитело JMab126 против AILIM человека.

На фиг.37 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор D", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека, когда в микропланшет, покрытый моноклональным антителом против CD3 человека, добавляли только раствор человеческого моноклонального антитела против AILIM человека (в жидкой фазе).

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"128": человеческое моноклональное антитело JMab128 против AILIM человека,

"135": человеческое моноклональное антитело JMab135 против AILIM человека,

"136": человеческое моноклональное антитело JМmab136 против AILIM человека.

На фиг.38 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор D", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека, когда в микропланшет, покрытый моноклональным антителом против CD3 человека, добавляли только раствор человеческого моноклонального антитела против AILIM человека (в жидкой фазе).

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"137": человеческое моноклональное антитело JMab137 против AILIM человека,

"138": человеческое моноклональное антитело JMab138 против AILIM человека,

"139": человеческое моноклональное антитело JMab139 против AILIM человека.

На фиг.39 показана пролиферативная активность Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор D", в анализе по определению активности в передаче костимуляторного сигнала различными человеческими моноклональными антителами против AILIM человека, когда в микропланшет, покрытый моноклональным антителом против CD3 человека, добавляли только раствор человеческого моноклонального антитела против AILIM человека (в жидкой фазе).

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"140": человеческое моноклональное антитело JMab140 против AILIM человека,

"141": человеческое моноклональное антитело JMab141 против AILIM человека.

На фиг.40 показано количество IFN-γ, продуцируемого в культуральном супернатанте Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор В", которые были культивированы в микропланшете, покрытом мышиным моноклональным антителом против AILIM человека вместе с моноклональным антителом против CD3 человека.

На вертикальной оси указана концентрация IFN-γ, а на горизонтальной оси показана концентрация мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "JHC1" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против СЕТР человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На фиг.41 показано количество IFN-γ, продуцируемого в культуральном супернатанте Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор В", которые были культивированы в микропланшете, покрытом человеческим моноклональным антителом против AILIM человека вместе с моноклональным антителом против CD3 человека.

На вертикальной оси указана концентрация IFN-γ, а на горизонтальной оси показана концентрация мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На фиг.42 показано количество IFN-γ, продуцируемого в культуральном супернатанте Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор В", которые были культивированы в микропланшете, покрытом человеческим моноклональным антителом против AILIM человека вместе с моноклональным антителом против CD3 человека.

На вертикальной оси указана концентрация IFN-γ, а на горизонтальной оси показана концентрация мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На фиг. 43 показано количество IFN-γ, продуцируемого в культуральном супернатанте Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор С", которые были культивированы в микропланшете, покрытом мышиным моноклональным антителом против AILIM человека вместе с моноклональным антителом против CD3 человека.

На вертикальной оси указана концентрация IFN-γ, а на горизонтальной оси показана концентрация мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "JHC1" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против СЕТР человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На фиг.44 показано количество IFN-γ, продуцируемого в культуральном супернатанте Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор С", которые были культивированы в микропланшете, покрытом человеческим моноклональным антителом против AILIM человека вместе с моноклональным антителом против CD3 человека.

На вертикальной оси указана концентрация IFN-γ, а на горизонтальной оси показана концентрация мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"124": человеческое моноклональное антитело JMab124 против AILIM человека,

"125": человеческое моноклональное антитело JMab125 против AILIM человека,

"126": человеческое моноклональное антитело JMab126 против AILIM человека.

На фиг.45 показано количество IFN-γ, продуцируемого в культуральном супернатанте Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор С", которые были культивированы в микропланшете, покрытом человеческим моноклональным антителом против AILIM человека вместе с моноклональным антителом против CD3 человека.

На вертикальной оси указана концентрация IFN-γ, а на горизонтальной оси показана концентрация мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"128": человеческое моноклональное антитело JMab128 против AILIM человека,

"135": человеческое моноклональное антитело JMab135 против AILIM человека,

"136": человеческое моноклональное антитело Jmab136 против AILIM человека.

На фиг.46 показано количество IFN-γ, продуцируемого в культуральном супернатанте Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор С", которые были культивированы в микропланшете, покрытом человеческим моноклональным антителом против AILIM человека вместе с моноклональным антителом против CD3 человека.

На вертикальной оси указана концентрация IFN-γ, а на горизонтальной оси показана концентрация мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"137": человеческое моноклональное антитело JMab137 против AILIM человека,

"138": человеческое моноклональное антитело JMab138 против AILIM человека,

"139": человеческое моноклональное антитело JMab139 против AILIM человека.

На фиг.47 показано количество IFN-γ, продуцируемого в культуральном супернатанте Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор С", которые были культивированы в микропланшете, покрытом человеческим моноклональным антителом против AILIM человека вместе с моноклональным антителом против CD3 человека.

На вертикальной оси указана концентрация IFN-γ, а на горизонтальной оси показана концентрация мышиного моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"140": человеческое моноклональное антитело JMab140 против AILIM человека,

"141": человеческое моноклональное антитело JMab141 против AILIM человека.

На фиг.48 показан ингибирующий эффект на пролиферацию Т-клеток в случае культивирования Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор А", с РВМС нормального здорового человека "донор D", с помощью различных пробных образцов в тесте на пролиферацию Т-клеток в ходе реакций смешанных лимфоцитов (MLR).

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³H]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых образцов.

Каждое из обозначений на фигурах означает следующее:

"CD80 + 86": смесь анти-СD80-антитела и анти-СD86-антитела;

"mIgG1": мышиное моноклональное антитело против CD34/IgG1 человека;

"CTLA4-Ig": человеческая химерная молекула CTLA4-IgFc;

"SA12": мышиное моноклональное антитело против AILIM человека.

На фиг.49 показан ингибирующий эффект на пролиферацию Т-клеток в случае культивирования Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор А", с РВМС нормального здорового человека "донор D", с помощью различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека в тесте на пролиферацию Т-клеток в ходе реакций смешанных лимфоцитов (MLR).

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых образцов.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"анти-KLH": человеческое моноклональное антитело против KLH человека в качестве отрицательного контроля,

"JMab124": человеческое моноклональное антитело JMab124 против AILIM человека,

"126": человеческое моноклональное антитело JMab126 против AILIM человека,

"127": человеческое моноклональное антитело JMab127 против AILIM человека,

"128": человеческое моноклональное антитело JMab128 против AILIM человека,

"135": человеческое моноклональное антитело Jmab135 против AILIM человека,

"136": человеческое моноклональное антитело Jmab136 против AILIM человека,

"137": человеческое моноклональное антитело Jmab137 против AILIM человека.

На фиг.50 показан ингибирующий эффект на пролиферацию Т-клеток в случае культивирования Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор D", с РВМС нормального здорового человека "донор В", с помощью различных пробных образцов в тесте на пролиферацию Т-клеток в ходе реакций смешанных лимфоцитов (MLR).

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых образцов.

Каждое из обозначений на фигурах означает следующее: "CD80+86":

смесь анти-СD80-антитела и анти-СD86-антитела;

"mIgG1": мышиное моноклональное антитело против CD34/IgG1 человека;

"CTLA4-Ig": человеческая химерная молекула CTLA4-IgFc;

"SA12": мышиное моноклональное антитело против AILIM человека.

На фиг.51 показан ингибирующий эффект на пролиферацию Т-клеток в случае культивирования Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор D", с РВМС нормального здорового человека "донор В", с помощью различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека в тесте на пролиферацию Т-клеток в ходе реакций смешанных лимфоцитов (MLR).

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых образцов.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"anti-KLH": человеческое моноклональное антитело против KLH человека в качестве отрицательного контроля,

"JMab124": человеческое моноклональное антитело JMab124 против AILIM человека,

"126": человеческое моноклональное антитело JMab126 против AILIM человека,

"127": человеческое моноклональное антитело JMab127 против AILIM человека,

"128": человеческое моноклональное антитело JMab128 против AILIM человека,

"135": человеческое моноклональное антитело JMab135 против AILIM человека,

"136": человеческое моноклональное антитело JMab136 против AILIM человека,

"137": человеческое моноклональное антитело JMab137 против AILIM человека.

На фиг.52 показан ингибирующий эффект на пролиферацию Т-клеток в случае культивирования Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор С", с РВМС нормального здорового человека "донор А", с помощью различных пробных образцов в тесте на пролиферацию Т-клеток в ходе реакций смешанных лимфоцитов (MLR).

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых образцов.

Каждое из обозначений на фигурах означает следующее:

"CD80+86": смесь анти-СD80-антитела и анти-СD86-антитела;

"mIgG1": мышиное моноклональное антитело против CD34/IgG1 человека;

"CTLA4-Ig": человеческая химерная молекула CTLA4-IgFc;

"SA12": мышиное моноклональное антитело против AILIM человека.

На фиг.53 показан ингибирующий эффект на пролиферацию Т-клеток в случае культивирования Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор С", с РВМС нормального здорового человека "донор А", с помощью различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека в тесте на пролиферацию Т-клеток в ходе реакций смешанных лимфоцитов (MLR).

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых образцов.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"anti-KLH": человеческое моноклональное антитело против KLH человека,

"JMab124": человеческое моноклональное антитело JMab124 против AILIM человека,

"126": человеческое моноклональное антитело JMab126 против AILIM человека,

"127": человеческое моноклональное антитело JMab127 против AILIM человека,

"128": человеческое моноклональное антитело JMab128 против AILIM человека,

"135": человеческое моноклональное антитело JMab135 против AILIM человека,

"136": человеческое моноклональное антитело JMab136 против AILIM человека,

"137": человеческое моноклональное антитело JMab137 против AILIM человека.

На фиг.54 показан ингибирующий эффект на пролиферацию Т-клеток в случае культивирования Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор Е", с РВМС нормального здорового человека "донор G", с помощью различных пробных образцов в тесте на пролиферацию Т-клеток в ходе реакций смешанных лимфоцитов (MLR).

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых образцов.

Каждое из обозначений на фигурах означает следующее:

"контрольное mIgG": мышиное моноклональное антитело против CD34/IgG1 человека;

"CD80 + 86Аb ": смесь анти-СD80-антитела и анти-СD86-антитела;

"SA12": мышиное моноклональное антитело против AILIM человека;

"CTLA4-Ig": человеческая химерная молекула CTLA4-IgFc.

На фиг.55 показан ингибирующий эффект на пролиферацию Т-клеток в случае культивирования Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор Е", с РВМС нормального здорового человека "донор G", с помощью различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека в тесте на пролиферацию Т-клеток в ходе реакций смешанных лимфоцитов (MLR).

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых образцов.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"anti-KLH": человеческое моноклональное антитело против KLH человека в качестве отрицательного контроля,

"JMab136": человеческое моноклональное антитело JMab136 против AILIM человека,

"138": человеческое моноклональное антитело JMab138 против AILIM человека,

"139": человеческое моноклональное антитело JMab139 против AILIM человека,

"140": человеческое моноклональное антитело JMab140 против AILIM человека,

"141": человеческое моноклональное антитело JMab141 против AILIM человека.

На фиг.56 показан ингибирующий эффект на пролиферацию Т-клеток в случае культивирования Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор F", с РВМС нормального здорового человека "донор Е", с помощью различных пробных образцов в тесте на пролиферацию Т-клеток в ходе реакций смешанных лимфоцитов (MLR).

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых образцов.

Каждое из обозначений на фигурах означает следующее:

"контрольное mIgG": мышиное моноклональное антитело против CD34/IgG1 человека;

"CD80 + 86Аb": смесь анти-СD80-антитела и анти-СD86-антитела;

"SA12": мышиное моноклональное антитело против AILIM человека;

"CTLA4-Ig": человеческая химерная молекула CTLA4-IgFc.

На фиг.57 показан ингибирующий эффект на пролиферацию Т-клеток в случае культивирования Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор F", с РВМС нормального здорового человека "донор Е", с помощью различных пробных образцов в тесте на пролиферацию Т-клеток в ходе реакций смешанных лимфоцитов (MLR).

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых образцов.

Каждое из обозначений на фигурах означает следующее:

"anti-KLH": человеческое моноклональное антитело против KLH человека,

"JMab136": человеческое моноклональное антитело JMab136 против AILIM человека,

"138": человеческое моноклональное антитело JMab138 против AILIM человека,

"139": человеческое моноклональное антитело JMab139 против AILIM человека,

"140": человеческое моноклональное антитело JMab140 против AILIM человека,

"141": человеческое моноклональное антитело JMab141 против AILIM человека.

На фиг.58 показан ингибирующий эффект на пролиферацию Т-клеток в случае культивирования Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор G", с РВМС нормального здорового человека "донор F", с помощью различных пробных образцов в тесте на пролиферацию Т-клеток в ходе реакций смешанных лимфоцитов (MLR).

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых образцов.

Каждое из обозначений на фигурах означает следующее:

"контрольное mIgG": мышиное моноклональное антитело против CD34/IgG1 человека;

"CD80 + 86Аb ": смесь анти-СD80-антитела и анти-СD86-антитела;

"SA12": мышиное моноклональное антитело против AILIM человека;

"CTLA4-Ig": человеческая химерная молекула CTLA4-IgFc.

На фиг.59 показан ингибирующий эффект на пролиферацию Т-клеток в случае культивирования Т-клеток, полученных у нормального здорового человека "донор G", с РВМС нормального здорового человека "донор F", с помощью различных пробных образцов в тесте на пролиферацию Т-клеток в ходе реакций смешанных лимфоцитов (MLR).

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых образцов.

Каждое из обозначений на фигурах означает следующее:

"анти-KLH": человеческое моноклональное антитело против KLH человека в качестве отрицательного контроля,

"JMab136": человеческое моноклональное антитело JMab136 против AILIM человека,

"138": человеческое моноклональное антитело JMab138 против AILIM человека,

"139": человеческое моноклональное антитело JMab139 против AILIM человека,

"140": человеческое моноклональное антитело JMab140 против AILIM человека,

"141": человеческое моноклональное антитело JMab141 против AILIM человека.

На фиг.60 показан ингибиторный эффект различных контрольных тестируемых веществ на пролиферацию Т-клеток с использованием анализа реакций смешанных лимфоцитов (MLR). Т-клетки, полученные у нормального здорового человека "донор А", совместно культивировали с клетками РВМС, полученными у нормального здорового человека "донор D", которые предварительно культивировались в присутствии человеческой химерной молекулы CTLA4-Ig.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых веществ.

Каждое из обозначений на фигурах означает следующее:

"CD80+86": смесь анти-СD80-антитела и анти-СD86-антитела;

"mIgG1": мышиное моноклональное антитело против CD34/IgG1 человека;

"SA12": мышиное моноклональное антитело против AILIM человека.

На фиг.61 показан ингибиторный эффект различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека на пролиферацию Т-клеток с использованием анализа реакций смешанных лимфоцитов (MLR). Т-клетки, полученные у нормального здорового человека "донор А", совместно культивировали с клетками РВМС, полученными у нормального здорового человека "донор D", которые предварительно культивировались в присутствии человеческой химерной молекулы CTLA4-Ig.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых веществ.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"анти-KLH": человеческое моноклональное антитело против KLH человека в качестве отрицательного контроля,

"JMab124": человеческое моноклональное антитело JMab124 против AILIM человека,

"126": человеческое моноклональное антитело JMab126 против AILIM человека,

"127": человеческое моноклональное антитело JMab127 против AILIM человека,

"128": человеческое моноклональное антитело JMab128 против AILIM человека,

"135": человеческое моноклональное антитело JMab135 против AILIM человека,

"136": человеческое моноклональное антитело JMab136 против AILIM человека,

"137": человеческое моноклональное антитело JMab137 против AILIM человека.

На фиг.62 показан ингибиторный эффект различных контрольных тестируемых веществ на пролиферацию Т-клеток с использованием анализа реакций смешанных лимфоцитов (MLR). Т-клетки, полученные у нормального здорового человека "донор D", совместно культивировали с клетками РВМС, полученными у нормального здорового человека "донор В", которые предварительно культивировали в присутствии человеческой химерной молекулы CTLA4-Ig.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых веществ.

Каждое из обозначений на фигурах означает следующее:

"CD80 + 86": смесь анти-СD80-антитела и анти-СD86-антитела;

"mIgG1": мышиное моноклональное антитело против CD34/IgG1 человека;

"SA12": мышиное моноклональное антитело против AILIM человека.

На фиг.63 показан ингибиторный эффект различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека на пролиферацию Т-клеток с использованием анализа реакций смешанных лимфоцитов (MLR). Т-клетки, полученные у нормального здорового человека "донор D", совместно культивировали с клетками РВМС, полученными у нормального здорового человека "донор В", которые предварительно культивировали в присутствии человеческой химерной молекулы CTLA4-Ig.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых веществ.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"анти-KLH": человеческое моноклональное антитело против KLH человека в качестве отрицательного контроля,

"JMab124": человеческое моноклональное антитело JMab124 против AILIM человека,

"126": человеческое моноклональное антитело JMab126 против AILIM человека,

"127": человеческое моноклональное антитело JMab127 против AILIM человека,

"128": человеческое моноклональное антитело JMab128 против AILIM человека,

"135": человеческое моноклональное антитело JMab135 против AILIM человека,

"136": человеческое моноклональное антитело JMab136 против AILIM человека,

"137": человеческое моноклональное антитело JMab137 против AILIM человека.

На фиг.64 показан ингибиторный эффект различных контрольных тестируемых веществ на пролиферацию Т-клеток с использованием анализа реакций смешанных лимфоцитов (MLR). T-клетки, полученные у нормального здорового человека "донор С", совместно культивировали с клетками РВМС, полученными у нормального здорового человека "донор А", которые предварительно культивировали в присутствии человеческой химерной молекулы CTLA4-Ig.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых веществ.

Каждое из обозначений на фигурах означает следующее:

"CD80+86": смесь анти-СD80-антитела и анти-СD86-антитела;

"mIgG1": мышиное моноклональное антитело против CD34/IgG1 человека;

"SA12": мышиное моноклональное антитело против AILIM человека.

На фиг.65 показан ингибиторный эффект различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека на пролиферацию Т-клеток с использованием анализа реакций смешанных лимфоцитов (MLR). Т-клетки, полученные у нормального здорового человека "донор С", совместно культивировали с клетками РВМС, полученными у нормального здорового человека "донор А", которые предварительно культивировали в присутствии человеческой химерной молекулы CTLA4-Ig.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых веществ.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"анти-KLH": человеческое моноклональное антитело против KLH человека в качестве отрицательного контроля,

"JMab124": человеческое моноклональное антитело JMab124 против AILIM человека,

"126": человеческое моноклональное антитело JMab126 против AILIM человека,

"127": человеческое моноклональное антитело JMab127 против AILIM человека,

"128": человеческое моноклональное антитело JMab128 против AILIM человека,

"135": человеческое моноклональное антитело JMab135 против AILIM человека,

"136": человеческое моноклональное антитело JMab136 против AILIM человека,

"137": человеческое моноклональное антитело JMab137 против AILIM человека.

На фиг.66 показан ингибиторный эффект различных контрольных тестируемых веществ на пролиферацию Т-клеток с использованием анализа реакций смешанных лимфоцитов (MLR). Т-клетки, полученные у нормального здорового человека "донор Е", совместно культивировали с клетками РВМС, полученными у нормального здорового человека "донор G", которые предварительно культивировали в присутствии человеческой химерной молекулы CTLA4-Ig.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых веществ.

Каждое из обозначений на фигурах означает следующее:

"контрольное mIgG": мышиное моноклональное антитело против CD34/IgG1 человека;

"CD80 + 86Аb": смесь анти-CD80-антитела и анти-СD86-антитела;

"SA12": мышиное моноклональное антитело против AILIM человека.

На фиг.67 показан ингибиторный эффект различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека на пролиферацию Т-клеток с использованием анализа реакций смешанных лимфоцитов (MLR). Т-клетки, полученные у нормального здорового человека "донор Е", совместно культивировали с клетками РВМС, полученными у нормального здорового человека "донор G", которые предварительно культивировали в присутствии человеческой химерной молекулы CTLA4-Ig.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых веществ.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"анти-KLH": человеческое моноклональное антитело против KLH человека в качестве отрицательного контроля,

"JMab136": человеческое моноклональное антитело JMab136 против AILIM человека,

"138": человеческое моноклональное антитело JMab138 против AILIM человека,

"139": человеческое моноклональное антитело JMab139 против AILIM человека,

"140": человеческое моноклональное антитело JMab140 против AILIM человека,

"141": человеческое моноклональное антитело JMab141 против AILIM человека.

На фиг.68 показан ингибиторный эффект различных контрольных тестируемых веществ на пролиферацию Т-клеток с использованием анализа реакций смешанных лимфоцитов (MLR). Т-клетки, полученные у нормального здорового человека "донор G", совместно культивировали с клетками РВМС, полученными у нормального здорового человека "донор F", которые предварительно культивировали в присутствии человеческой химерной молекулы CTLA4-Ig.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых веществ.

Каждое из обозначений на фигурах означает следующее:

"контрольное mIgG": мышиное моноклональное антитело против CD34/IgG1 человека;

"CD80 + 86Аb ": смесь анти-СD80-антитела и анти-СD86-антитела;

"SA12": мышиное моноклональное антитело против AILIM человека.

На фиг.69 показан ингибиторный эффект различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека на пролиферацию Т-клеток с использованием анализа реакций смешанных лимфоцитов (MLR). Т-клетки, полученные у нормального здорового человека "донор G", совместно культивировали с клетками РВМС, полученными у нормального здорового человека "донор F", которые предварительно культивировали в присутствии человеческой химерной молекулы CTLA4-Ig.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация тестируемых веществ.

Остальные обозначения имеют следующий смысл:

"анти-KLH": человеческое моноклональное антитело против KLH человека в качестве отрицательного контроля,

"JMab136": человеческое моноклональное антитело JMab136 против AILIM человека,

"138": человеческое моноклональное антитело JMab138 против AILIM человека,

"139": человеческое моноклональное антитело JMab139 против AILIM человека,

"140": человеческое моноклональное антитело JMab140 против AILIM человека,

"141": человеческое моноклональное антитело JMab141 против AILIM человека.

На фиг.70 показана ADCC-индуцирующая активность различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека и контрольных антител при использовании в качестве клеток-мишеней клеток СНО дикого типа.

На вертикальной оси указана степень цитотоксичности, вызванной ADCC-индуцируемой активностью антитела, а на горизонтальной оси показана концентрация антитела.

На фиг.71 показана ADCC-индуцирующая активность различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека и контрольных антител при использовании в качестве клеток-мишеней рекомбинантных клеток СНО, демонстрирующих повышенную экспрессию AILIM человека.

На вертикальной оси показана частота повреждения клеток в результате ADCC-индуцируемой активности антитела, а на горизонтальной оси показана концентрация антитела.

На фиг.72 показано ингибиторное действие анти-AILIM-антитела на аллергию замедленного типа.

На вертикальной оси указан размер покраснения, измеряемый в качестве показателя запуска аллергии замедленного типа, а на горизонтальной оси показан тип тестируемого образца, вводимого животному.

На фиг.73 показана пролиферативная активность Т-клеток обезьяны в анализе на определение активности различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека в отношении передачи костимуляторного сигнала, с использованием микропланшета, покрытого человеческим моноклональным антителом против AILIM человека вместе с моноклональным антителом против CD3 человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На этой фигуре "анти-KLH" означает результат анализа, в котором моноклональное антитело против KLH человека было использовано в качестве отрицательного контроля, вместо человеческого моноклонального антитела против AILIM человека.

На фиг.74 показана ингибиторная активность антитела, используемого в качестве отрицательного контроля, в отношении связывания растворимых лигандов AILIM (hB7h-IgFc) с различными концентрациями растворимой AILIM (AILIM-IgFc).

На вертикальной оси указано поглощение в качестве показателя ингибиторной активности, а на горизонтальной оси показана концентрация растворимой AILIM.

На фиг.75 показана ингибиторная активность анти-AILIM-антитела в отношении связывания растворимых лигандов AILIM (hB7h-IgFc) с различными концентрациями растворимой AILIM (AILIM-IgFc).

На вертикальной оси указано поглощение в качестве показателя ингибиторной активности, а на горизонтальной оси показана концентрация растворимой AILIM.

На фиг.76 показана ингибиторная активность анти-AILIM-антитела в различных концентрациях в отношении связывания растворимых лигандов AILIM (hB7h-IgFc) с растворимой AILIM (AILIM-IgFc).

На вертикальной оси указано поглощение в качестве показателя ингибиторной активности, а на горизонтальной оси показана концентрация растворимой AILIM.

На фиг.77 показана ингибиторная активность различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека в отношении пролиферации Т-клеток человека в анализе по определению активности передачи костимуляторного сигнала с использованием микропланшета, покрытого растворимым лигандом AILIM человека (hB7h-IgFc) вместе с моноклональным антителом против CD3 человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация антитела.

На фиг.78 показана ингибиторная активность различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека в отношении пролиферации Т-клеток обезьяны в анализе по определению активности передачи костимуляторного сигнала с использованием микропланшета, покрытого растворимым лигандом AILIM человека (hB7h-IgFc) вместе с моноклональным антителом против CD3 человека.

На вертикальной оси отложено количество включенного в клетки [³Н]-тимидина в качестве показателя степени клеточной пролиферации, а на горизонтальной оси показана концентрация антитела.

Лучший способ реализации изобретения

Ниже приведена более подробная иллюстрация настоящего изобретения с помощью примеров, которые не следует рассматривать как ограничивающие объем защиты данного изобретения.

Пример 1. Получение иммуногена

<1-1> Получение рекомбинантной клетки, экспрессирующей AILIM человека

Согласно методу, описанному в более ранних заявках (JP-A No. Hei 11-29599 and WO 98/38216), а также в опубликованной ранее статье Tezuka, одного из авторов настоящей заявки (Int. Immunology, Vol.12, No.1, р.51-55, 2000), было получено два типа рекомбинантных клеток (клетка СНО и клетка HPB-ALL), отличающихся повышенной экспрессией AILIM человека. Конкретно, метод заключается в следующем.

кДНК (регистрационный номер в банке генов: АВ023135 (кДНК); ВАА82129 (аминокислоты)), содержащую полноразмерную ORF [скрытую рамку считывания], кодирующую AILIM человека, вставляли в вектор pEF-neo. Затем полученный в результате рекомбинантный экспрессирующий вектор вводили в клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО) и линию клеток тимомы человека, HPB-ALL, в соответствии с общепринятым методом электропорации (960 мкF, 320 V) с использованием устройства Gene Pulser (BioRad). Соответствующие клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей гентамицин (0.8 мг/мл; Gibco BRL) и 10% ЭБС (эмбриональная бычья сыворотка) для отбора трансформированных клеток с резистентностью к действию лекарств.

<1-2> Отбор рекомбинантных клеток HPB-ALL, отличающихся повышенной экспрессией AILIM человека

Культуру отобранных, как описано выше в разделе <1-1>, клеток HPB-ALL с резистентностью к действию лекарств центрифугировали для получения клеточных осадков. Мышиное моноклональное антитело против AILIM человека, называемое "SA12" (мышиное моноклональное антитело против антигена JTT-1), которое было получено и описано прежде (JP-A 11-29599 (Пример 12) и WO 98/38216 (Пример 12)) авторами настоящего изобретения, добавляли к клеточному осадку (концентрация: раствор антитела (10 мкг/мл), разбавленный EDTA-BSA/PBS, добавляли в соотношении 100 мкл/10⁵ клеток). Полученные в результате смеси инкубировали при 4°С в течение 30 минут. Клетки дважды отмывали указанным выше EDTA-BSA/PBS (200 мкл), а затем к ним добавляли стрептавидин, меченный фикоэритрином (SA-PE; 100 мкл 500-кратно разбавленного раствора). Полученные в результате смеси инкубировали при 4°С в течение 30 минут. После инкубации клетки трижды промывали раствором EDTA-BSA/PBS, получая в результате клеточные суспензии.

Уровни экспрессии AILIM человека соответствующими клетками в клеточных суспензиях определяли с помощью проточного цитометра FACSort (Beckton-Dichinson), с тем чтобы отобрать рекомбинантные клетки HPB-ALL, отличающиеся повышенной экспрессией AILIM человека. Отобранные клетки культивировали до образования конфлуэнта в среде RPMI 1640, содержащей 10% ЭБС и G418 (1 мг/мл).

<1-3> Отбор рекомбинантных клеток СНО, отличающихся повышенной экспрессией AILIM человека

Культуру отобранных, как описано выше в разделе <1-1>, клеток СНО, резистентных к действию лекарств, центрифугировали для получения клеточных осадков. Указанное выше мышиное моноклональное антитело SA12 против AILIM человека, которое метили FITC, добавляли к каждому клеточному осадку (раствор антитела (100 мкг/мл), разбавленному раствором EDTA-BSA/PBS). Полученные в результате смеси инкубировали при 4°С в течение 30 минут. Затем клетки промывали указанным выше раствором EDTA-BSA/PBS, после чего получали клеточные суспензии путем добавления к клеточным осадкам EDTA-BSA/PBS (500 мкл).

Уровни экспрессии AILIM человека соответствующими клетками в клеточных суспензиях определяли с помощью проточного цитометра FACSort (Beckton-Dichinson), с тем чтобы отобрать рекомбинантные клетки HPB-ALL, отличающиеся повышенной экспрессией AILIM человека. Отобранные клетки культивировали до образования конфлуэнта в среде RPMI 1640, содержащей 10% ЭБС и G418 (1 мг/мл).

<1-4> Получение иммуногена из клеток HPB-ALL, отличающихся повышенной экспрессией AILIM человека

Клетки HPB-ALL, экспрессирующие повышенное количество AILIM человека, которые были получены, как описано выше в разделе <1-2>, подвергали центрифугированию. Полученные клеточные осадки четырежды промывали фосфатным буфером (PBS; Nikken Seibutsu), а затем ресуспендировали в буфере, содержащем протеиназный ингибитор (содержащем 25 мМ HEPES (рН 7.4), 10 мМ MgCl₂, 0.25 М сахарозы, и протеиназный ингибитор (10 ед/мл апротинина, 2 мкг/мл пепстатина, 50 мкг/мл лейпептина и 0.35 мг/мл PMSF)). Клеточную суспензию гомогенизировали в гомогенизаторе типа гомогенизатора Поттера, и центрифугировали на малой скорости (при 1500 об/мин при 4°С в течение 10 минут). Затем полученный в результате супернатант подвергали ультрацентрифугированию (при 100000 g и при 4°С в течение 1 часа). Получали осажденную мембранную фракцию, которую затем суспендировали в фосфатном буфере (концентрацию мембранной фракции рассчитывали таким образом, чтобы в 1 мл PBS содержалась мембранная фракция, полученная из 1×10⁷ клеток). Суспензию хранили при температуре -80°С. Суспензию, содержащую фракцию клеточных мембран, использовали в качестве антигена (иммуногена) для получения человеческого антитела согласно изобретению, которое будет описано позже.

<1-5> Получение иммуногена из клеток СНО, отличающихся повышенной экспрессией AILIM человека

Клетки СНО, экспрессирующие повышенное количество AILIM человека, которые были получены, как описано выше в разделе <1-3>, диспергировали путем механического соскабливания и подвергали центрифугированию. Полученный клеточный осадок четырежды промывали фосфатным буфером (PBS; Nikken Seibutsu), a затем ресуспендировали в буфере, содержащем протеиназный ингибитор (содержащем 25 мМ HEPES (рН 7.4), 10 мМ MgCl₂, 0.25 М сахарозы, и протеиназный ингибитор (10 ед/мл апротинина, 2 мкг/мл пепстатина, 50 мкг/мл лейпептина и 0.35 мг/мл PMSF)). Клеточную суспензию гомогенизировали в гомогенизаторе типа гомогенизатора Поттера и центрифугировали на малой скорости (при 1500 об/мин при 4°С в течение 10 минут). Затем полученный в результате супернатант подвергали ультрацентрифугированию (при 100000 g и при 4°С в течение 1 часа). Получали осажденную мембранную фракцию, которую затем суспендировали в фосфатном буфере (концентрацию мембранной фракции рассчитывали таким образом, чтобы в 1 мл PBS содержалась мембранная фракция, полученная из 1×10⁷ клеток). Суспензию хранили при температуре -80°С. Суспензию, содержащую фракцию клеточных мембран, использовали в качестве антигена (иммуногена) для получения человеческого антитела согласно изобретению, которое будет описано позже.

Пример 2. Получение гибридомы, продуцирующей человеческое моноклональное антитело против AILIM человека

В данном примере получение моноклонального антитела производили в соответствии с традиционно используемым методом, описанным в публикации "Experimental Medicine (supplement), Handbook for Cell Technology" (eds., T.Kuroki et al., Yodosha, pp.66-74, 1992) и "Experimental Manual for Monoclonal Antibody" (T. Ando et al., Kodansha, 1991).

Фракция клеточных мембран, полученная, как описано в примере 1, из рекомбинантных клеток, экспрессирующих в повышенных количествах AILIM человека, была использована в качестве иммуногена AILIM человека.

Животные, подвергнутые иммунизации, представляли собой полученных описанным выше способом трансгенных мышей, продуцирующих человеческое антитело (Nature Genetics, Vol.7, р.13-21, 1994; Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997; Published Japanese Translation of International Application No. Hei 4-504365; опубликованная в переводе на японский язык международная заявка No. Hei 7-509137; Nikkei Science, June, pp.40-50, 1995, и т.д.).

Для культивирования клеток использовали многолуночные микропланшеты.

<2-1> Иммунизация и получение гибридомы

Каждый из иммуногенов (100 мкл/мышь/введение), полученный, как описано выше в разделе <1-4> (полученный из HPB-ALL) и в разделе <1-5> (полученный из СНО), был введен в указанную выше трансгенную мышь, продуцирующую человеческое антитело. Иммуноген инъецировали в подушечку задней лапки мыши вместе с полным адъювантом Фрейнда (ICN/CAPPEL) в качестве первичной иммунизации (день 0).

После первичной иммунизации какой-нибудь из этих двух иммуногенов дополнительно инъецировали в подушечку задней лапки мыши с 1-недельным интервалом в качестве вторичной и/или третичной иммунизации. Точно так же производили дальнейшую инъекцию при последней иммунизации за два дня до получения лимфоцитов, описанного ниже.

Через два дня после последней иммунизации из лимфатических узлов (подпаховых и подколенных) и селезенок соответствующих трансгенных мышей, подвергнутых иммунизации, получали лимфоциты. Лимфоциты и клетки миеломы мыши P3/X63-AG8.653 (АТСС No. CRL-1580) смешивали в отношении 5:1 и в качестве агента слияния добавляли к ним полиэтиленгликоль 1500 (Boehringer Mannheim). Затем смесь разбавляли 10 объемами бессывороточной основной среды EX-CELL301 (JRH Bioscience). После этого смесь клеток промывали основной средой, после чего суспендировали в среде HAT (1 л основной среды, содержащей 13,61 мг гипоксантина, 176 мкг аминоптерина и 3,88 мг тимидина). Клетки наносили в лунки 96-луночного микропланшета и культивировали в течение 10-14 дней до полного слияния клеток. В результате клеточного слияния образовывалось множество гибридом.

<2-2> Скрининг гибридомы, продуцирующей человеческое моноклональное антитело

Ряд гибридом, полученных, как описано выше в разделе <2-1>, подвергали скринингу с использованием метода клеточного ELISA, как описано ниже, для отбора гибридом, продуцирующих человеческое моноклональное антитело против AILIM человека.

Соответствующие рекомбинантные клетки HPB-ALL и рекомбинантные клетки СНО, экспрессирующие в избыточных количествах AILIM человека, которые были описаны выше, вносили в каждую лунку 96-луночного микропланшета ELISA (1×10⁵ клеток/лунку). Инкубацию проводили при 37°С в течение 2 дней.

Затем супернатант, отобранный из каждой лунки, отбрасывали, добавляли образцы супернатанта каждой из гибридомных культур (50 мкл/лунку) и смесь инкубировали в течение 1 часа. После завершения реакции раствор смешанной пробы отбрасывали и каждую лунку трижды промывали PBS, содержащим 1% BSA (Sigma).

Затем, с целью обнаружения в гибридомном супернатанте тяжелой цепи иммуноглобулина человека (человеческого моноклонального антитела), в каждую лунку добавляли конъюгированное с пероксидазой козье антитело против иммуноглобулина человека (Fc) (50 мкл 2000-кратно разведенного антитела на лунку; American Corex; 1% BSA/PBS). Смесь инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.

С другой стороны, с целью обнаружения в гибридомном супернатанте легкой κ-цепи иммуноглобулина человека (человеческого моноклонального антитела), в каждую лунку добавляли конъюгированное с пероксидазой козье антитело против κ-цепи иммуноглобулина человека (50 мкл 2000-кратно разведенного антитела на лунку). Смесь инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре.

Антитело против IgFc человека или антитело против Igκ человека удаляли из каждой лунки микропланшета, после чего планшеты трижды промывали раствором PBS, содержащим 1% BSA. К каждой лунке добавляли тетраметилбензидин (3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ), 100 мкл/лунку, BIO-RAD) и полученную в результате смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут.

Затем в каждую лунку добавляли 1 N H₂SO₄ (50 мкл/лунку), чтобы остановить реакцию. Реакцию контролировали по поглощению при длине волны 450 нм с помощью устройства для считывания микропланшета (Model 3550 Microplate Reader, BIO-RAD).

Контрольный эксперимент ELISA был предпринят таким же образом, как описано выше, но с использованием нижеследующего:

(1) клеток HPB-ALL дикого типа вместо рекомбинантных клеток HPB-ALL, экспрессирующих AILIM человека;

(2) клеток СНО дикого типа вместо рекомбинантных клеток СНО, экспрессирующих AILIM человека;

(3) мышиных моноклональных антител против AILIM человека (SA12 или SG430; JP-A11-29599 (пример 12) и WO 98/38216 (пример 12)) вместо гибридомного супернатанта;

(4) человеческого моноклонального антитела против KLH (гемоцианин моллюска морское блюдечко, PIERCE) вместо гибридомного супернатанта.

Человеческое моноклональное антитело против KLH было получено таким же способом, что и описанный выше в разделе <2-1>, путем иммунизации указанных выше трансгенных мышей, продуцирующих человеческое антитело, с помощью KLH (гемоцианин моллюска морское блюдечко, PIERCE).

Многие гибридомы, продуцирующие человеческое моноклональное антитело, способное связываться с AILIM человека, были отобраны путем указанного скрининга.

<2-3> Первичное клонирование гибридомы

Многие типы гибридомных моноклонов были получены из различных типов гибридом (родительские линии клеток), которые были отобраны, как было описано в представленном выше разделе <2-2>, продуцирующих человеческое моноклональное антитело против AILIM человека, с использованием следующих методов анализа.

Соответствующие гибридомы, отобранные в описанном выше разделе <2-2>, были нанесены в 24-луночные микропланшеты. Счет клеток гибридомы в каждой лунке определяли путем пипетирования. Затем к среде EX-CELL301 (JRH Bioscience), содержащей 4.0 мМ L-глутамина и липида, добавляли 10% эмбриональную бычью сыворотку (ЭБС; Trace Bioscience PTY), 1% пенициллин/стрептомицин (Sigma), 1% НТ-конглютинин (Gibco BRL) и 2.5% культуральный конглютинин T-STIM (Collaborative Biomedical Products). Полученную в результате модифицированную среду использовали для разбавления гибридом до концентрации 1×10⁴ клеток/мл и клетки суспендировали в каждой лунке.

Клеточную суспензию (300 мкл или 600 мкл) каждой лунки объединяли и как следует смешивали с модифицированной средой (150 мл или 300 мл), а затем аликвоту в 200 мкл клеточной суспензии добавляли к каждой лунке множества 96-луночных микропланшетов так, чтобы каждая лунка содержала 4 гибридомные клетки. Указанную выше модифицированную среду (50 мл или 100 мл) заново добавляли к оставшейся клеточной суспензии, которая была хорошо размешана, и затем полученную клеточную суспензию добавляли к каждой лунке другого свежезаправленного множества 96-луночных микропланшетов так, чтобы каждая лунка содержала 2 гибридомные клетки.

Культивирование продолжалось от 1 до 2 недель. После культивирования во многих лунках обнаруживались одиночные колонии, полученные из одной гибридомной клетки.

С помощью метода клеточного ELISA, как указано выше в разделе <2-2>, было выявлено, что человеческое моноклональное антитело против AILIM человека было получено в культуральном супернатанте каждой лунки, содержащей колонию.

<2-4> Вторичное клонирование гибридомы

Субклонирование (вторичное клонирование) каждого клона из различных гибридомных клонов, полученных, как описано выше в разделе <2-3>, было предпринято согласно тому же методу, который описан выше в разделе <2-3>.

В данном эксперименте плотность клеток в каждой лунке 96-луночного микропланшета доводили до 1 клетки/лунку.

В результате скрининга было получено много гибридомных моноклонов, продуцирующих человеческое моноклональное антитело против AILIM человека. Часть этих клонов составляли следующие (название клона):

AIF34 (JMab-124), AIF182 (JMab-126), AIF348 (JMab-127), AIF620 (JMab-128), AIF1052 (JMab-135), AIH5D3,(JMab-136), AIH386 (JMab-137), AII289 (JMab-138), AII394 (JMab-139), AII488 (JMab-140), AIJ40 (JMab-141)

Названия, указанные выше, используются в описании данного изобретения, в частности во всех примерах, описанных ниже, включая настоящий пример, и на чертежах и в таблице, содержащих результаты анализа, полученного в данном примере.

Пример 3. Анализ свойств моноклонального антитела

<3-1> Анализы тяжелой цепи и легкой цепи

С использованием методов ELISA и проточной цитометрии, описываемных ниже, было показано, что моноклональное антитело против AILIM человека, продуцируемое каждым гибридомным клоном, который был клонирован, как указано выше в разделе <2-4>, действительно являлось человеческим моноклональным антителом.

Рекомбинантные клетки HPB-ALL, отличающиеся повышенной экспрессией AILIM человека, которые были получены в примере 1, были внесены в каждую из v-образных лунок микропланшета (3×10⁴ клеток/лунку). Клетки культивировали при 37°С в среде RPMI 1640, содержащей 10% ЭБС.

После завершения культивирования планшеты центрифугировали (при 1800 об/мин в течение 2 минут) с целью осаждения клеток, и затем образовавшийся супернатант отбрасывали. После этого в каждую лунку добавляли аликвоту (50 мкл/лунку) супернатанта, полученного при культивировании каждой из гибридом, клонированных, как описано выше в разделе <2-4>, либо мышиное моноклональное антитело против AILIM человека, SA12 (2 мкг/50 мкл), либо - альтернативно - человеческое моноклональное антитело против KLH (50 мкл/лунку) в качестве контрольного антитела. Реакционную смесь выдерживали в течение 30 минут в холодильнике. После проведения реакции из каждой лунки отбирали раствор и отбрасывали его, а каждую лунку промывали фосфатным буфером (0.5% BSA-PBS, содержащим 5 мМ EDTA).

Затем к каждой лунке добавляли любое из вторичных антител, приведенных ниже (разведенных 1000-кратно указанным выше фосфатным буфером и добавленных в количестве 50 мкл/лунку), с образованием суспензий клеток. Полученную реакционную суспензию выдерживали в холодильнике в течение 30 минут.

Вторичное антитело:

меченное биотином антитело против IgG человека (Zymed);

меченное биотином антитело против IgG человека (Protos);

меченное биотином антитело против IgFc человека (EY Laboratories) или

меченное биотином антитело против IgK человека (Vector).

После проведения реакции вторичное антитело удаляли и каждую лунку планшета промывали указанным выше фосфатным буфером. Затем меченный фикоэритрином стрептавидин (Streptavidin-PE; Pharmingen; 500-кратно разводили указанным выше фосфатным буфером и добавляли в количестве 50 мкл/лунку) добавляли в каждую лунку. Реакционную смесь выдерживали в холодильнике в течение 30 минут. После проведения реакции каждую лунку планшета промывали указанным выше фосфатным буфером. Затем указанный выше фосфатный буфер добавляли к каждой лунке планшета (200 мкл/лунку) с получением клеточной суспензии.

Культуральный супернатант каждого из гибридомных клонов анализировали с целью определения реактивности моноклонального антитела против AILIM человека в отношении клеток HPB-ALL, отличающихся повышенной экспрессией AILIM человека.

Контрольный анализ был предпринят таким же образом, как описано выше, но с использованием нижеследующего:

(1) клеток HPB-ALL дикого типа вместо рекомбинантных клеток HPB-ALL, экспрессирующих AILIM человека;

(2) человеческого моноклонального антитела против KLH (гемоцианин моллюска морское блюдечко, PIERCE) вместо гибридомного супернатанта.

Человеческое моноклональное антитело против KLH было получено таким же способом, что и описанный выше в разделе <2-1>, путем иммунизации указанных выше трансгенных мышей, продуцирующих человеческое антитело, с помощью KLH (гемоцианин моллюска морское блюдечко, PIERCE).

На основании полученного результата, все гибридомные клоны, описанные выше в разделе <2-4>, проверялись на наличие человеческих моноклональных антител, состоящих из полученной у человека тяжелой цепи и полученной у человека легкой κ-цепи.

Один из примеров указанного результата проиллюстрирован на фиг.1, включающей в себя результат анализа гибридомных клонов AIH5D3 (JMab-136), AII289 (JMab-138) и AII394 (JMab-139).

<3-2> Изотипирование человеческого моноклонального антитела

Определяли изотип каждого из человеческих моноклональных антител против AILIM человека, продуцируемых гибридомами, которые были клонированы, как описано выше в разделе <2-4>, и были подвержены анализу, как описано выше в разделе <3-1>. Определение производили с помощью Набора для изотипирования человеческого моноклонального антитела (American Qualex) в соответствии с инструкцией по проведению анализа, приложенной к указанному набору.

Как было показано, все человеческие моноклональные антитела против AILIM человека относились к разряду IgG2/κ.

Пример 4. Широкомасштабное получение человеческого моноклонального антитела против AILIM человека (моноклональное антитело человека против AILIM человека) и его очистка

<4-1> Способ 1

Клетки каждого гибридомного клона, продуцирующие человеческое моноклональное антитело против AILIM человека, которые были получены, как было описано выше в разделе <2-4>, добавляли во флаконы для культивирования тканей (50 мл, FALCON) и культивировали в среде ASF104 (Ajinomoto), содержащей 10% FBS, содержащую IgG в следовых количествах (GIBCO-BRL), до образования конфлуэнта в атмосфере 5% СО₂ при 37°С.

После этого всю культуральную жидкость переносили в новые флаконы для культивирования тканей (750 мл, FALCON) и клетки культивировали в среде ASF104 (Ajinomoto), содержащей 10% FBS, содержащую IgG в следовых количествах (GIBCO-BRL), до образования конфлуэнта в атмосфере 5% СО₂ при 37°С.

Через 10-20 дней культивирования культуральный супернатант каждой гибридомы извлекали и переносили в 50-миллилитровые полипропиленовые конические пробирки (FALCON). Пробирки центрифугировали при 500хg в течение 5 минут.

После этого супернатант, полученный в результате центрифугирования, фильтровали через стерилизующий фильтр (NALGEN), получая фильтрат.

Фильтрат наносили на колонку HiTrap с протеином G (HiTrap affinity column Protein G; Amersham Pharmacia), предварительно уравновешенную фосфатным буфером (30 мл) при скорости тока 3 мл/мин. Затем колонку промывали фосфатным буфером (20 мл), после чего искомое антитело элюировали путем нанесения на колонку 100 мМ нитратного буфера (рН 2.0) при низкой скорости примерно 1 мл/мин. Затем элюированный раствор подвергали нейтрализации с помощью 750 мМ раствора Tris-HCl (рН 9.0),после чего пропускали через фильтр (Millipore) для удаления белого осадка. Полученный в результате фильтрат диализовали против фосфатного буфера (в течение ночи) и пропускали через фильтр (Millipore). Очищенное таким образом моноклональное антитело против AILIM человека было получено от каждой гибридомной линии.

Концентрацию белка определяли по поглощению при A₂₈₀, измеряемому на спектрофотометре (1A₂₈₀=1.41 мг/мл).

<4-2> Способ 2

Клетки каждого гибридомного клона, полученные, как было описано выше в разделе <2-4>, кондиционировали в среде ASF104 (Ajinomoto), содержащей 10% FBS, содержащую IgG в следовых количествах (GIBCO-BRL) (1-2×10⁶ клеток/мл), и высевали и культивировали в [среде] Integra Cell Line 1000 (INTEGRA CL1000, INTEGRA BIOSCIENCE). На 7-10 дни культивирования, когда плотность клеток достигала 1×10⁸ клеток/мл, извлекали супернатант каждой из гибридомных культур.

Супернатант каждой из гибридомных культур наносили на колонку HiTrap с протеином G (HiTrap affinity column Protein G; Amersham Pharmacia), предварительно уравновешенную фосфатным буфером (30 мл) при скорости тока 3 мл/мин. Затем колонку промывали фосфатным буфером (20 мл), после чего на колонку наносили 100 мМ цитратный буфер (рН 2.0) при низкой скорости примерно 1 мл/мин для элюции антитела. Затем для нейтрализации элюированного раствора добавляли 750 мМ раствор Tris-HCl (рН 9.0) и полученный в результате раствор пропускали через фильтр (Millipore) для удаления белого осадка. Полученный в результате фильтрат диализовали против фосфатного буфера (в течение ночи) и пропускали через фильтр (Millipore). Очищенное таким образом моноклональное антитело против AILIM человека было получено от каждой гибридомной линии.

Пример 5. Реактивность человеческого моноклонального антитела против AILIM человека в отношении AILIM человека и его перекрестная реактивность в отношении AILIM мыши и AILIM крысы

Различные очищенные человеческие моноклональные антитела против AILIM человека анализировали на их реактивность в отношении AILIM человека, а также на их перекрестную реактивность в отношении AILIM мыши и AILIM крысы, с помощью клеточного метода ELISA.

<5-1> Установка системы ELISA для определения концентрации IgG-антитела и получение калибровочных кривых

Поскольку все указанные выше очищенные человеческие моноклональные антитела против AILIM человека представляли собой IgG (IgG2)-антитело, систему ELISA устанавливали для определения концентрации IgG-антитела.

Козье антитело против IgG (Fc) человека (1.2 мкг/мл в PBS; 100 мкл/лунку; Organon Teknika) добавляли в каждую лунку 96-луночного микропланшета ELISA (Nunc). Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов, чтобы анти-IgG(Fc)-антитело адсорбировалось на микропланшете. После этого супернатант отбрасывали, а планшет трижды промывали фосфатным буфером (PBS), содержащим 0.05% Tween 20. Блокирующий агент (PBS, содержащий 0.5% бычий сывороточный альбумин (BSA) и 0.1% Tween 20) добавляли в каждую лунку (200 мкл/лунку) и планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов, чтобы блокировать свободные сайты анти-IgG(Fc)-антитела на планшете. После этого блокирующий агент удаляли и каждую лунку дважды промывали PBS.

Полученное у человека IgG2-антитело (50 мкл/лунку; сайт связывания), которое использовали в качестве стандартного антитела, добавляли в различных концентрациях (от 0 до 100 нг/мл) к соответствующим лункам планшета и планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Избыточные растворы стандартного антитела удаляли и каждую лунку трижды промывали фосфатным буфером, содержащим 0.05% Tween 20.

Затем в каждую лунку добавляли конъюгированное с пероксидазой козье антитело против IgG/κ (4000-кратно разведенное, 100 мкл/лунку, Protos) и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Супернатант отбрасывали, а микропланшеты трижды промывали фосфатным буфером, содержащим 0.05% Tween 20. Буфер, содержащий субстрат (состав: орто-фенилендиамин ((о-фенилендиамин, OPD; 20 мг)/цитратно-фосфатный буфер (рН 5.0, 50 мл)/водный раствор 30% перекиси водорода (15 мл)), добавляли в каждую лунку (100 мкл/лунку) и планшет инкубировали при комнатной температуре примерно в течение 7 минут.

Затем, чтобы остановить реакцию, в каждую лунку добавляли 2 М серную кислоту (50 мкл/лунку). Были построены калибровочные кривые (фиг.2) на основе величин поглощения, измеряемого при длине волны 490 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов.

Были предприняты контрольные анализы отдельно взятой культуральной среды или отдельно взятого раствора BSA в качестве тестируемого вещества тем же способом, который был описан выше.

<5-2> Анализы реактивности различных очищенных человеческих моноклональных антител против AILIM человека в отношении AILIM человека, также как и их поперечное связывание с AILIM мыши и с AILIM крысы

<5-2-1> Приготовление реагентов

Реагенты, используемые в данном клеточном методе ELISA, были получены следующим образом.

<5-2-1-1> Получение рекомбинантной клетки СНО с повышенной экспрессией AILIM мыши

Рекомбинантные клетки СНО, экспрессирующие в избыточном количестве AILIM мыши, были получены такими же способами, которые описаны выше в разделах <1-1> и <1-3>.

кДНК (Регистрационный номер в банке генов: АВ023132 (кДНК); ВАА82126 (аминокислота)), содержащая полноразмерную ORF AILIM мыши, была встроена в вектор pEF-neo, и затем полученный в результате рекомбинантный экспрессирующий вектор вводили в клетки яичника китайского хомячка (клетка СНО) общеизвестным методом электропорации (960 мкf, 320 V) с использованием устройства Gene Pulser (BioRad). Клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей генетицин (0.8 мг/мл; Gibco BRL) и 10% ЭБС, для отбора резистентных к действию лекарств трансформированных клеток, получая таким образом рекомбинантные клетки СНО с повышенной экспрессией AILIM мыши.

<5-2-1-2> Получение рекомбинантной клетки СНО с повышенной экспрессией AILIM крысы

Рекомбинантные клетки СНО, экспрессирующие в избыточном количестве AILIM крысы, были получены такими же способами, которые описаны выше в разделах <1-1> и <1-3>.

кДНК (Регистрационный номер в банке генов: АВ023134 (кДНК); ВАА82128 (аминокислота)), содержащая полноразмерную ORF AILIM крысы, была встроена в вектор pEF-neo, и затем полученный в результате рекомбинантный экспрессирующий вектор вводили в клетки яичника китайского хомячка (клетка СНО) общеизвестным методом электропорации (960 мкf, 320 V) с использованием устройства Gene Pulser (BioRad). Клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей генетицин (0.8 мг/мл; Gibco BRL) и 10% ЭБС, для отбора резистентных к действию лекарств трансформированных клеток, получая таким образом рекомбинантные клетки СНО с повышенной экспрессией AILIM крысы.

<5-2-1-3> Получение моноклонального антитела против AILIM человека

Рекомбинантные клетки СНО с повышенной экспрессией AILIM мыши, которые были получены в описанном выше разделе <5-2-1-1>, гомогенизировали и подвергали ультрацентрифугированию (100000×g). Полученный в результате осадок, содержащий фракцию клеточных мембран, суспендировали в PBS. Полученную в результате фракцию клеточных мембран инъецировали вместе с полным адъювантом Фрейнда крысам Вистар в подушечку задней лапки в качестве первичной иммунизации (день 0). После этого антиген клеточной мембранной фракции вводили крысам в подушечку задней лапки на 7-й, 14-й и 28-й дни после первичной иммунизации. Клетки лимфатического узла собирали у них за 2 дня после последней иммунизации.

Клетки лимфатических узлов и клетки мышиной миеломы PAI (JCR No.ВО 113; Res. Disclosure, Vol.217, p.155, 1982) объединяли в соотношении 5:1. Клетки сливали друг с другом с использованием полиэтиленгликоля 4000 (Boehringer Mannheim) в качестве агента слияния для получения гибридом, продуцирующих моноклональное антитело. Селекции гибридом достигали, культивируя их в среде ASF104 (Ajinomoto), содержащей HAT, 10% эмбриональную бычью сыворотку и аминоптерин.

Реактивность крысиного моноклонального антитела в культуральном супернатанте каждой гибридомы в отношении AILIM мыши определяли путем введения во взаимодействие культурального супернатанта указанных выше клеток СНО, экспрессирующих AILIM мыши, и затем путем измерения интенсивности флуоресценции клеток, окрашенных FITC-меченным антикрысиным IgG (Cappel), в проточном цитометре EPICS-ELITE. В результате скрининга получали множество гибридом, продуцирующих моноклональное антитело, обладающее реактивностью против AILIM мыши.

Среди них была получена гибридомная линия, которая была названа "BIO.5." Клетки этой гибридомы внутрибрюшинно инъецировали (от 10⁶ до 10⁷ клеток/0.5 мл/мышь) мышам ICR nu/nu (7-8-недельные самки). Через 10-20 дней после инъекции у каждой из мышей путем лапаротомии под наркозом, в соответствии с общепринятым методом, получали асцитную жидкость. Затем с использованием этих асцитов производили крупномасштабное получение крысиного моноклонального антитела BIO.5 (IgGI) против AILIM мыши.

<5-2-2> Реактивность антитела в отношении AILIM человека, мыши и крысы

Концентрации человеческого моноклонального антитела против AILIM человека и контрольного антитела для использования в описанном ниже методе ELISA определяли на основе ELISA и калибровочных кривых, описываемых выше в разделе <5-1>.

Каждый из следующих типов клеток (7×10³ клеток/лунку): рекомбинантных клеток СНО с повышенной экспрессией AILIM человека, полученных в примере 1, рекомбинантных клеток СНО с повышенной экспрессией AILIM мыши, полученных в разделе <5-2-1-1>, приведенном выше, и рекомбинантных клеток СНО с повышенной экспрессией AILIM крысы, полученных в разделе <5-2-1-2>, приведенном выше, наносили в лунки 96-луночных ELISA-микропланшетов и культивировали до стадии достижения конфлуэнта при 37°С.

Затем супернатант отбрасывали, а каждое из полученных выше разновидностей очищенных человеческих моноклональных антител против AILIM человека или контрольное антитело добавляли в каждую лунку (концентрации антитела: 200 мкг/мл антитела разбавляли PBS, содержащим 1% BSA, в 3 раза, в 3² раз, в 3³ раз, в 3⁴ раз, в 3⁵ раз, в 3⁶ раз, в 3⁷ раз, в 3⁸ раз, в 3⁹ раз, в 3¹⁰ раз, в 3¹¹ раз и в 3¹² раз) в количестве 50 мкл/лунку и реакционные планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворы моноклональных антител удаляли и каждую лунку трижды промывали фосфатным буфером, содержащим 1% BSA (Sigma).

Затем антитело против IgG (Fc) человека, конъюгированное с пероксидазой хрена, добавляли в каждую лунку (в 1000-кратном разведении, в количестве 50 мкл/лунку; American Qualex), и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа.

Надосадочный раствор меченого антитела удаляли, а микропланшеты трижды промывали фосфатным буфером, содержащим 1% BSA. Буфер, содержащий субстрат (состав: орто-фенилендиамин (о-фенилендиамин, OPD; 20 мг)/цитратно-фосфатный буфер (рН 5.0, 50 мл)/водный раствор 30% перекиси водорода (15 мкл)), добавляли в каждую лунку (100 мкл/лунку) и планшеты инкубировали при комнатной температуре приблизительно в течение 7 минут.

Затем для остановки реакции в каждую лунку (50 мкл/лунку) добавляли 2 М серную кислоту. Поглощение измеряли при длине волны 490 нм с помощью прибора для считывания микротитрационных планшет (Bio-Rad).

Для оценки указанных выше антител таким же образом, что и описанный выше, предпринимали контрольный анализ ELISA с использованием следующих контрольных антител:

(1) мышиного моноклонального антитела SA12 или SG430 против AILIM человека (JP-A 11-29599 (Пример 12) и WO 98/38216 (Пример 12));

(2) крысиного моноклонального антитела BIO.5 против AILIM мыши (представленный выше раздел <5-2-1-3>);

(3) мышиного моноклонального антитела JTT2 против AILIM крысы (моноклональное антитело, продуцируемое гибридомой, которое получило международную регистрацию 11 октября 1996 и имеет международный регистрационный номер FERM ВР-5708 в Национальном институте биологических наук и биотехнологии человека, Агентство индустриальной науки и технологии, Министерство Международной торговли и индустрии), которое депонировано и на которое, в соответствии с Будапештским Соглашением, имеется Международное авторское право; JP-A 11-29599 (Примеры 1 и 2) и WO 98/38216 (Примеры 1 и 2);

(4) полученного выше человеческого моноклонального антитела против KLH (гемоцианин моллюска морское блюдечко, PIERCE) вместо гибридомного супернатанта.

Контрольный эксперимент ELISA был предпринят таким же образом, что и описанный выше, с использованием клеток СНО дикого типа, показанных ниже, вместо рекомбинантных клеток СНО, экспрессирующих AILIM. Результаты приведены на фиг.3-14.

На основании полученного выше результата рассчитали 50%-ную эффективную концентрацию (ED_50, нг/мл) в качестве показателя реактивности каждого человеческого моноклонального антитела против AILIM человека в отношении AILIM человека (рекомбинантные клетки СНО с повышенной экспрессией AILIM человека), AILIM мыши (рекомбинантные клетки СНО с повышенной экспрессией AILIM мыши) или AILIM крысы (рекомбинантные клетки СНО с повышенной экспрессией AILIM крысы). Результаты, полученные путем вычисления, приведены ниже.

(A) ED50 для СНО с повышенной экспрессией AILIM человека:

AIF 34 (JMab-124): 5.3 нг/мл

AIF182 (JMab-126): 3.6 нг/мл

AIF348 (JMab-127): 9.1 нг/мл

AIF620 (JMab-128): 10.1 нг/мл

AIF1052 (JMab-135): 2.0 нг/мл

AIH5D3 (JMab-136): 7.5 нг/мл

AIH386 (JMab-137): 9.6 нг/мл

AII289 (JMab-138): 10.5 нг/мл

AII394 (JMab-139): 10.6 нг/мл

AII488 (JMab-140): 11.0 нг/мл

AIJ40 (JMab-141): 3.7 нг/мл

SA12: 1.8 нг/мл

SG430: 1.2 нг/мл

(В) ED50 для СНО с повышенной экспрессией AILIM мыши:

AIF 34 (JMab-124) 42 нг/мл

AIF348 (JMab-127) 81 нг/мл

AIF620 (JMab-128) 100 нг/мл

AII289 (JMab-138) 53 нг/мл

AII394 (JMab-139) 60 нг/мл

AII488 (JMab-140) 70 нг/мл

(С) ED50 для СНО с повышенной экспрессией AILIM крысы

AIF 34 (JMab-124) 45 нг/мл

AIF348 (JMab-127) 62 нг/мл

AIF620 (JMab-128) 97 нг/мл

AII289 (JMab-138) 57 нг/мл

AII394 (JMab-139) 90 нг/мл

AII488 (JMab-140) 90 нг/мл

Результаты показали, что человеческие моноклональные антитела против AILIM человека согласно изобретению проявляли значительно большую специфичность в отношении AILIM человека.

Далее, как было выяснено, 6 типов человеческих моноклональных антител против AILIM человека (показанных выше под рубрикой (В) и (С)) обладали реактивностью как в отношении AILIM мыши, так и в отношении AILIM крысы (связывающая способность, перекрестная реактивность).

Пример 6. Определение аффинности и нейтрализующая активность человеческого моноклонального антитела против AILIM человека в отношении антигена (AILIM человека)

Константу скорости ассоциации (ka), константу скорости диссоциации (kd), константу диссоциации (Kd) в отношении реакции между каждым из различных очищенных человеческих моноклональных антител против AILIM человека, полученных выше, и AILIM человека определяли с помощью коммерчески доступного набора Biacore X (Amersham-Pharmacia).

<6-1> Получение антигена для иммобилизации на сенсорном чипе

Антиген для иммобилизации на сенсорном чипе в указанном наборе был получен в виде рекомбинантного химерного антигена (называемого в дальнейшем "IgFc-AILIM человека"), состоящего из внеклеточной области AILIM человека и константной области (Fc) IgG1 человека.

IgFc-AILIM человека получали путем дальнейшей очистки антигена, полученного согласно способу, описанному в более ранних заявках (JP- A 11-29599 (Пример 16 (2)) и WO 98/38216 (Пример 16 (2)) одного из авторов настоящего изобретения, Tezuka.

Культуральный супернатант рекомбинантных клеток, продуцирующих IgFc-AILIM человека, наносили на колонку HiTrap с протеином G (HiTrap affinity column Protein G; Amersham-Pharmacia), предварительно уравновешенную фосфатным буфером (30 мл) со скоростью тока 3 мл/мин для адсорбции IgFc-AILIM человека, содержащегося в культуральном супернатанте, на колонке.

Затем колонку промывали фосфатным буфером (20 мл), после чего на колонку наносили 100 мМ цитратный буфер (рН 2.0) при скорости тока 1 мл/мин для элюирования IgFc-AILIM человека. Затем элюированный раствор нейтрализовали раствором (рН 9.0) 750 мМ Tris-HCl, после чего диализовали против фосфатного буфера (в течение ночи). Затем диализованный раствор фильтровали через фильтр (Millipore). Таким образом получали очищенный IgFc-AILIM человека.

Концентрацию белка определяли по поглощению при A₂₈₀, измеряемом с помощью спектрофотометра (1 A₂₈₀=1 мг/мл). Концентрация IgFc- AILIM человека была определена равной 0.28 мг/мл.

Очищенный химерный белок, состоящий из внеклеточной области AILIM крысы и константной области (Fc) человеческого IgG1 (IgFc-AILIM крысы; JP-A 11-29599 (Пример 16 (2)) и WO 98/38216 (Пример 16 (2)), тоже был получен тем же самым образом, который был описан выше. Полученная концентрация IgFc-AILIM крысы составляла 0.45 мг/мл.

<6-2> Определение аффинности и нейтрализующей активности

Экспериментальные процедуры, за исключением иммобилизации антигена (IgFc-AILIM человека) на сенсорном чипе, которая описана ниже, были основаны на описании протокола эксперимента, в соответствии с инструкцией для применения, прилагаемой к коммерчески доступному набору Biacore X (Amersham-Pharmacia).

Буфер HBS (содержащий 0.01 М HEPES, 0.15 М NaCl, 3 мМ EDTA и 0.005% детергент Р20, (рН7.0)) пропускали через прилагаемую к набору проточную кювету Flow Cell-1 со скоростью тока 5 мкл/мин. Затем добавляли раствор (15 мкл), содержащий 0.005 М NHS (N-гидроксисукцинимид) и 0.2 М EDC (N-этил-N'-(диметиламинопропил)карбодиимид), для активации карбоксильных групп СМ-покрытия на поверхности сенсорного чипа.

После этого добавляли 23 мкл раствора IgFc-AILIM человека (10 мкг/мл; растворенного в 10 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 5.0)) для иммобилизации IgFc-AILIM человека на сенсорном чипе. Затем непрореагировавшие активированные карбоксильные группы блокировали путем добавления 35 мкл 1 М этаноламингидрохлорида. Количества иммобилизованного IgFc-AILIM человека, полученные в результате дважды предпринятой процедуры иммобилизации, составили, соответственно, 2444 RU (резонансные единицы) и 2213 RU. Единица RU соответствует массе на единицу площади; 1RU=1 пг/мм².

Проточная кювета, являющаяся упомянутой проточной кюветой, была подвергнута действию кэппинга в отсутствие IgFc-AILIM человека таким же способом, что и описанный выше.

Фосфатный буфер пропускали через поток клеток (сенсорный чип) при скорости тока 20 мкл/мин и к ним добавляли каждое из очищенных человеческих моноклональных антител против AILIM человека, которые были получены выше в примере (от 10 до 50 мкг/мл, 60 мкл).

Стандартными условиями для измерения были следующие: ассоциативная фаза в течение 3 минут и диссоциативная фаза в течение 10 минут. Соответствующие количества антитела, связанного с антигеном и высвобождаемого из связанного с антигеном состояния, отслеживали во времени, чтобы получить сенсорграмму. Диссоциации антитела от антигена достигали путем пропускания PBS через сенсорный чип при скорости тока 20 мкл/мин.

На основе данных полученной в результате сенсорграммы были вычислены константа скорости ассоциации (ka), константа скорости диссоциации (kd) и константа диссоциации (Kd; Kd=kd/ka) с помощью аналитической программы (software), (BIAevaluation 3.0), прилагаемой к набору.

Аффинность нейтрализующей активности мышиных моноклональных антител SA12 и SG430 в отношении AILIM человека, полученного в Примере, описанном выше, также анализировали тем же способом, который был описан выше.

Полученные значения представлены в таблице.

<название клона><ka(1/М.сек)><kd[1/ceK]><Kd(M)>AIF 34(JMab-124)1.6×10⁴1.0×10^-46.3×10^-9AIF182(JMab-126)3.2×10⁴2.8×10^-58.8×10^-10AIF348(JMab-127)1.9×10⁴6.4×10^-53.4×10^-9AIF620(JMab-128)1.1×10⁴1.1×10^-41.0×10^-8AIF1052(JMab-135)1.6×10⁴6.3×10^-53.9×10^-9AIH5D3(JMab-136)2.8×10⁴4.9×10^-61.8×10^-10AIH386(JMab-137)1.2×10⁵3.1×10^-42.6×10^-10AII289(JMab-138)3.7×10⁴4.2×10^-51.1×10^-9AII394(JMab-139)3.1×10⁴2.4×10^-57.7×10^-10AII488(JMab-140)2.3×10⁴3.5×10^-51.5×10^-10AIJ 40(JMab-141)1.9×10⁴1.9×10^-51.0×10^-9SA 12 7.8×10³7.9×10^-51.0×10^-8SG430 2.2×10⁴1.5×10^-46.8×10^-9

Эти результаты показывают, что все человеческие моноклональные антитела против AILIM человека и мышиные моноклональные антитела против AILIM человека проявляют значительно более высокую аффинность связывания и нейтрализующую активность в отношении AILIM человека.

Пример 7. Активность человеческого моноклонального антитела против AILIM человека в отношении передачи костимулирующего сигнала в Т-клетке человека

Изучали вопрос о том, обладают ли человеческие моноклональные антитела против AILIM человека согласно изобретению способностью контролировать (усиливать и/или ингибировать) Т-клеточные ответы (продукцию цитокинов, таких как IFN-γ и IL-4, пролиферацию клеток и т.д.), иными словами, обладают ли эти антитела регуляторной активностью в отношении клеточной передачи опосредованного AILIM костимуляторного сигнала. Изучение было предпринято на основе количества цитокинов (IFN-γ и IL-4), продуцируемых в Т-клетках, также как и на основе степени пролиферации Т-клеток человека в качестве показателя.

<7-1> Разбавление антитела

Моноклональное антитело против CD3 человека, ОКТ3 (АТСС CRL- 8001), разбавляли фосфатным буфером (PBS) до конечной концентрации 8 мкг/мл.

Каждую из разновидностей человеческих моноклональных антител против AILIM человека, полученных выше, разбавляли буфером PBS до конечной концентрации 40 мкг/мл. Затем полученные растворы антител разбавляли далее буфером PBS с получением антител в различных концентрациях (от 40 до 0.0049 мкг/мл).

<7-2> Покрытие микропланшетов антителом

Каждую лунку 96-луночных микропланшетов покрывали (1) человеческим моноклональным антителом против CD3 человека, ОКТ3 (8 мкг/мл; 25 мкг на каждую лунку) и любой из разновидностей человеческих моноклональных антител против AILIM человека (от 40 до 0.0049 мкг/мл; 25 мкг на каждую лунку) или же (2) только моноклональным антителом против CD3 человека, ОКТ3 (8 мкг/мл; 25 мкг на каждую лунку). Планшеты инкубировали в течение 2 часов при 37°С. Затем растворы антител отбрасывали, а каждую лунку трижды промывали буфером PBS. После промывки в каждую лунку добавляли культуральную среду RPMI 1640, содержащую (100 мкл/лунку), и планшеты инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Таким образом, лунки микропланшетов были покрыты, соответственно, антителами, указанными выше под рубрикой (1) или (2).

Контрольные эксперименты проводили точно таким же способом с использованием планшетов, покрытых, вместо человеческих моноклональных антител против AILIM человека, соответствующими моноклональными антителами в качестве контрольных антител, которые указаны ниже.

(1) Мышиное моноклональное антитело SA12 или SG430 против AILIM человека (JP-A 11-29599 (Пример 12) и WO 98/38216 (Пример 12));

(2) Мышиное моноклональное антитело против СЕТР человека, JHC1 (также обозначаемое в виде JMab109; JP-A 9-20800), и

(3) Человеческое моноклональное антитело против KLH человека (также обозначаемое в виде JMab23; указанный выше Пример).

Микропланшеты, покрытые антителами, были использованы в следующих анализах.

<7-3> Получение суспензии Т-клеток человека

Периферическую кровь брали у каждого из нормальных здоровых доноров (5 человек; донор А, В, С, D и Е). Фракцию, содержащую мононуклеарные клетки, получали путем центрифугирования в градиенте плотности с использованием LymphoPrep (Nycomed). Т-клетки человека отделяли от фракции мононуклеарных клеток в соответствии с инструкцией по проведению экспериментальных манипуляций с использованием набора для выделения пан-Т-клеток (Miltenyi) и магнитного сортера клеток. Счет Т-клеток производили с помощью гемоцитометра. Т-клетки человека суспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% ЭБС, получая в результате суспензию Т-клеток человека (1×10⁶ клеток/мл).

<7-4> Культура клеток

(1) Культивирование с использованием микропланшета, покрытого антителом против CD3 человека и антителом против AILIM человека

Суспензию Т-клеток человека (донор А, В, С, D или Е; 100 мкл/лунку; 1×10⁵ клеток/лунку) добавляли в каждую лунку микропланшета, покрытого указанным выше антителом, и планшет инкубировали в течение 3 дней при 37°С в СО₂-инкубаторе.

После инкубации аликвоты результирующих культуральных супернатантов (50 мкл) хранили при -20°С, а затем использовали в анализе, описанном ниже (анализ IFNγ). После взятия аликвот культуральных супернатантов соответствующие микропланшеты были использованы для проведения следующих анализов:

(2) Культивирование с использованием микропланшета, покрытого только антителом против CD3 человека

Суспензию Т-клеток человека (донор D; 100 мкл/лунку; 1×10⁵ клеток/лунку) добавляли в каждую лунку микропланшетов, покрытых указанным выше антителом, после чего добавляли любую из разновидностей человеческих моноклональных антител против AILIM человека (25 мкл антитела в концентрациях от 40 до 0.0049 мкл/лунку). Планшеты инкубировали при 37°С в течение 3 дней в СО₂-инкубаторе.

<7-5> Определение пролиферативной активности Т-клеток

Метил-[³Н]-тимидин (0.5 мкКюри/лунку; Amersham-Pharmacia) добавляли в каждую лунку планшетов после инкубации и планшеты инкубировали при 37°С в течение 6 часов в CO₂-инкубаторе. После инкубации клетки собирали на GF/C-фильтрах (Packard) с помощью сборщика клеток. Затем фильтры сушили при 40°С в течение 3 или более часов, а потом к ним добавляли Microscinti 0 (20 мк Кюри/лунку; Packard). Для установления уровня пролиферации Т-клеток после культивирования измеряли радиоактивность ³Н, включенного в задержанные на фильтрах клетки, на β-счетчике (TOP COUNT).

Полученные результаты приведены на фиг.15-39.

В результате этого исследования показали, что Т-клетки человека значительно пролиферировали, в зависимости от концентрации клеток, когда микропланшеты были покрыты моноклональным антителом против AILIM человека (человеческим моноклональным антителом или мышиным моноклональным антителом) вместе с антителом против CD3 человека. Кроме того, между донорами имели место некоторые различия в степени пролиферации.

С другой стороны, не наблюдалось значительного роста Т-клеток человека, когда планшеты были покрыты только антителом против CD3 человека и когда в процессе культивирования клеток использовали моноклональные антитела против AILIM человека (человеческое моноклональное антитело или мышиное моноклональное антитело) в растворе (жидкая фаза).

<7-6> Количественное определение IFNγ в культуральных супернатантах Т-клеток

Для определенных культур Т-клеток (доноры В и С), описанных под рубрикой (1) в разделе <7-4>, в культуральных супернатантах определяли количества IFNγ с помощью коммерчески доступного набора ELISA для IFNγ человека (Amersham-Pharmacia; Endogen).

Полученные результаты приведены на фиг.40-47.

Результат этого исследования показал, что продукция IFNγ значительно возрастала в зависимости от концентрации моноклонального антитела против AILIM человека (человеческого моноклонального антитела или мышиного моноклонального антитела).

Пример 8. Регуляторная активность человеческого моноклонального антитела против AILIM человека в отношении смешанной реакции лимфоцитов (MLR)

Проверяли то, способны ли или не способны человеческие моноклональные антитела против AILIM человека согласно изобретению контролировать (усиливать и/или ингибировать) Т-клеточные ответы (продукцию цитокинов IFNγ и IL-4, клеточную пролиферацию и т.д.), иными словами, способность регуляции передачи AILIM-опосредованного костимуляторного сигнала в клетки путем изучения активности (в частности, синтеза ДНК в клетках) контролирования Т-клеточной пролиферации, ассоциированной с аллогенной реакцией смешанных лимфоцитов (аллогенная MLR), в качестве показателя.

<8-1> Получение РВМС и Т-клеток человека

Периферическую кровь (200 мл), собранную у каждого из нормальных здоровых индивидуумов (7 человек; донор А, В, С, D, Е, F и G), наносили на слои Lymphoprep (15 мл; Nycomed) в микропробирках (50 мл; Falcon). После центрифугирования (при 1600 об/мин в течение 10 минут) собирали промежуточные слои. Полученные клетки разбавляли в 2 или более раз фосфатным буфером, а затем центрифугировали (при 1800 об/мин в течение 10 минут). Таким образом получали РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови; 2×10⁸-5×10⁸ клеток). Счет клеток производили с помощью гемоцитометра. Аликвоту клеток, предназначенную для анализа MLR (1.08×10⁸ клеток/9 микропланшетов), отбирали и хранили на льду. Оставшиеся клетки использовали для описанных выше Т-клеток.

Для получения Т-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови, РВМС, использовали набор для выделения пан-Т-клеток (Miltenyi Biotech). Согласно прилагаемой к набору инструкции оставшиеся РВМС добавляли к раствору, который прилагается к набору, и проводили инкубирование полученного раствора. Затем клетки промывали буфером PBS, содержащим 5 мМ EDTA и 0.5% BSA, а затем ресуспендировали в PBS. После этого клеточную суспензию наносили на колонку для позитивной селекции VS+ (Miltenyi Biotech), пропитанную PBS, и неадсорбированную фракцию удаляли. Затем колонку промывали буфером PBS и смывной раствор собирали. Эту же процедуру повторяли еще раз. Полученные растворы объединяли друг с другом, получая таким образом Т-клеточную фракцию. После центрифугирования Т-клеточной фракции клетки ресуспендировали в PBS. Счет клеток в полученной Т-клеточной фракции производили с помощью гемоцитометра. Клетки использовали в следующем анализе.

<8-2> Смешанная реакция лимфоцитов (MLR)

Как описано выше, известно два пути передачи сигнала, необходимых для активации лимфоцитов, таких как Т-клетки и т.д., и сравнительный анализ этих путей в деталях был представлен выше: один - между CD28 и CD80 (В7-1)/CD86 (В7-2), и другой - между CTLA4 и CD80 (В7-1)/CD86 (В7-2).

В частности, пролиферация Т-клеток в ответ на смешанную реакцию лимфоцитов (MLR) может быть индуцирована путем передачи сигнала через каждый из двух известных путей.

Таким образом, с использованием веществ, указанных ниже, можно провести проверку данного изобретения с помощью анализа (1) ингибирования MLR путем блокирования опосредованного CTLA4 пути передачи сигнала; (2) ингибирования MLR путем блокирования опосредованного CD80 (B7-1)/CD86 (В7-2) пути передачи сигнала; (3) ингибирования MLR путем блокирования обоих - опосредованного CTLA4 и опосредованного CD80 (B7-1)/CD86 (В7-2) - путей передачи сигнала; (4) ингибирования MLR путем блокирования пути третичного сигналирования, ассоциированного с AILIM, и (5) ингибирования MLR путем блокирования обоих - опосредованного CTLA4 и опосредованного AILIM - путей передачи сигнала.

Для проверки были использованы следующие вещества:

(1) человеческое моноклональное антитело против AILIM человека (полученное в Примере, описанном выше);

(2) мышиное моноклональное антитело против AILIM человека, SA12 (то же самое, что и в приведенном выше Примере);

(3) человеческое моноклональное антитело против KLH человека (отрицательный контроль; такое же, что и в приводимом выше Примере);

(4) мышиное IgG-антитело (антитело против CD34 человека; отрицательный контроль; Immunotech);

(5) смесь моноклонального антитела против CD80 человека (Pharmingen) и моноклонального антитела против CD86 человека (Pharmingen) и

(6) химерная молекула CTLA4-IgFc человека (Ancell).

Смешанную реакцию лимфоцитов (MLR) проводили на следующих шести комбинациях с использованием РВМС и Т-клеток, полученных у доноров, как описано выше в разделе <8-1>:

(i) Т-клетки (донор А)/РВМС (донор D),

(ii) Т-клетки (донор D)/РВМС (донор В),

(iii) Т-клетки (донор С)/РВМС (донор А),

(iv) Т-клетки (донор Е)/РВМС (донор G),

(v) Т-клетки (донор F)/PBMC (донор Е),

(vi) Т-клетки (донор G)/РВМС (донор F).

Используемые в тесте концентрации РВМС и Т-клеток описаны ниже.

РВМС были суспендированы в PBS, а затем перенесены в культуральные плашки (60 мм). Клетки подвергали рентгеновскому облучению (50 Gy) с помощью облучающего устройства (Hitachi MEDICO). Клетки собирали, центрифугировали, а затем переносили в среду PRMI 1640, содержащую 10% ЭБС. Количество клеток доводили до 2×10⁵ клеток/50 мкл.

Полученные в результате от каждого донора Т-клетки также вносили в среду PRMI 1640, содержащую 10% ЭБС, и количество клеток доводили до 1×10⁵ клеток/50 мкл.

<8-2-1> Ингибирование MLR под действием человеческого моноклонального антитела против AILIM человека

Среду PRMI 1640, содержащую 10% ЭБС, добавляли в каждую лунку 96-луночного микропланшета, имеющего U-образную форму лунок. Раствор человеческого моноклонального антитела против AILIM человека или мышиного моноклонального антитела против AILIM человека, SA12, разбавляли средой PRMI 1640, содержащей 10% ЭБС, для получения растворов с различными концентрациями антитела. Разбавленные растворы антитела добавляли в лунки (конечная концентрация: 0, 0.31, 1.25, 5 и 20 мкг/мл). Затем Т-клетки (50 мкл) добавляли в лунки. Планшет инкубировали при 37°С в течение 1 часа в СО₂-инкубаторе (NAPCO). После того как реакция была завершена, РВМС (50 мкл), полученные у различных доноров, добавляли в лунки для инициации MLR.

Когда MLR проводили с использованием антитела, отличного от человеческого антитела против AILIM человека (описанного выше в (3)-(6)), в качестве тестируемого вещества, Т-клеткам, полученным у различных доноров, давали возможность прореагировать после инкубации РВМС с тестируемым веществом.

На пятый день культивирования меченный тритием тимидин (³H-тимидин; 20 мкл; 1 мкКи/лунку), разбавленный средой PRMI 1640, содержащей 10% ЭБС, добавляли в каждую лунку. Культивирование продолжалось 1 день. После того как культивирование было завершено, клетки собирали с помощью устройства для сборки клеток (Packard). Радиоактивность ³Н, включенного в клетки, измеряли на счетчике (TOP COUNT; Packard) с целью определения скорости пролиферации Т-клеток после культивирования.

Результаты приведены на фиг.48-59.

<8-2-2> Ингибирование MLR под действием человеческого моноклонального антитела против AILIM человека в системе MLR, когда опосредованный CTLA4 путь передачи сигнала был предварительно заблокирован

Среду PRMI 1640, содержащую 10% ЭБС, добавляли в каждую лунку 96-луночного микропланшета, имеющего U-образную форму лунок. Раствор человеческого моноклонального антитела против AILIM человека или мышиного моноклонального антитела против AILIM человека, SA12, разбавляли средой PRMI 1640, содержащей 10% ЭБС, для получения растворов с различными концентрациями антитела. Разбавленные растворы антитела добавляли в лунки (конечная концентрация: 0, 0.31, 1.25, 5 и 20 мкг/мл). Затем Т-клетки (50 мкл) добавляли в лунки. Планшет инкубировали при 37°С в течение 1 часа в CO₂-инкубаторе (NAPCO).

Вдобавок к культурам Т-клеток, РВМС (в среде RPMI 1640, содержащей 10% ЭБС), полученные у других доноров, независимо культивировали после добавления CTLA4-IgFc человека к РВМС. Культивирование проводили при 37°С в течение 1 часа в CO₂-инкубаторе (NAPCO). Концентрацию CTLA4-IgFc вначале реакции MLR доводили до 20 мкг/мл.

После этого для инициации MLR к описанной выше Т-клеточной культуре добавляли РВМС (50 мкл).

Когда MLR проводили с использованием антитела, отличного от человеческого антитела против AILIM человека (описанного выше в (3)-(5)), в качестве тестируемого вещества Т-клеткам, полученным у различных доноров, давали возможность прореагировать после инкубации РВМС, которые были культивированы в присутствии CTLA4-IgFc, с тестируемым веществом.

На пятый день культивирования меченный тритием тимидин (³H-тимидин; 20 мкл; 1 мкКи/лунку), разбавленный средой PRMI 1640, содержащей 10% ЭБС, добавляли в каждую лунку. Культивирование продолжалось 1 день. После того как культивирование было завершено, клетки собирали с помощью устройства для сборки клеток (Packard). Радиоактивность ³Н, включенного в клетки, измеряли на счетчике (TOP COUNT; Packard) с целью определения скорости пролиферации Т-клеток после культивирования.

Результаты приведены на фиг.60-69.

Результаты, полученные из двух тестов, описанных выше, суммированы ниже.

(1) CTLA4-IgFc блокирует передачу сигнала, опосредованного CTLA-4, ингибируя таким образом индуцированную аллогенной MLR пролиферацию Т-клеток.

(2) Антитело против CD80 и антитело против CD86 ингибирует передачу сигнала, опосредованного CD80/CD86, который является лигандом для CTLA4 и CD28 и ингибирует таким образом индуцированную аллогенной MLR пролиферацию Т-клеток.

(3) Моноклональное антитело против AILIM человека, подобно CTLA4-IgFc, антителу против CD80 и антителу против CD86, значительно ингибирует индуцированную аллогенной MLR пролиферацию Т-клеток, ассоциированную с опосредованной AILIM передачей сигнала зависимым от концентрации антитела образом.

Иными словами, эти результаты показывают, что третичный путь, опосредованный AILIM и его лигандом, вдобавок к известным путям, опосредованным CTLA4/CD80/CD86 и опосредованным CD28/CD80/CD86, существует в качестве костимуляторных путей сигналирования, необходимых для активации Т-клеток, также как и то, что опосредованный AILIM путь передачи сигнала ингибируется антителом против AILIM.

Более того, возникает вероятность того, что вклад опосредованного AILIM пути в передачу сигнала может быть сравним с таковым пути, опосредованного CTLA4/CD80/CD86, и пути, опосредованного CD28/CD80/CD86.

Пример 9. Активность человеческого моноклонального антитела против AILIM человека в индукции антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC)

Биологические активности, вызываемые антителами, включают в себя индукцию антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). ADCC представляет собой цитотоксическое действие, которое требует [участия] антитела вдобавок к эффекторным клеткам и клеткам-мишеням, которое индуцирует повреждение на клетках-мишенях, индуцируемое эффекторными клетками, такими как лимфоциты, макрофаги или полиморфноядерные лейкоциты.

Активность моноклонального антитела против AILIM человека согласно изобретению в индукции ADCC анализировали следующим образом.

⁵¹Cr (0.1 мКи/10⁶ клеток; Amersham-Pharmacia) добавляли к культуре рекомбинантных клеток HPB-ALL с повышенной экспрессией AILIM человека, полученных в Примере, описанном выше, и смесь инкубировали при 37°С в течение 2 часов. Клетки промывали 8 раз средой RPMI 1640. Полученные в результате меченные изотопом клетки использовали в качестве клеток-мишеней.

В контрольных экспериментах тем же способом, который описан выше, были использованы человеческие клетки HPB-ALL дикого типа, меченные изотопом, в качестве контрольных клеток.

С помощью устройства Lymphosepar I (IBL) фракции РВМС отделяли от периферической крови, собранной у нормальных здоровых доноров. Полученные в результате РВМС человека были использованы в качестве контрольных клеток.

Клетки-мишени (1×10⁴ клеток/лунку; 25 мкл/лунку) вносили в каждую лунку 96-луночного микропланшета (Nunc), имеющего U-образную форму лунок. Затем в каждую лунку добавляли одну из различных концентраций человеческих моноклональных антител против AILIM человека, где антитела разбавляли средой RPMI 1640, содержащей 5% FBS (0.0001-1.0 мкг/мл; 25 мкг/лунку), только среду (25 мкл/лунку) или 1% Nonidet Р-40 (25 мкл/лунку; детергент, обладающий активностью по лизису клеток), и планшеты инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре.

При культивировании, вместо антитела против AILIM человека, в качестве положительного контроля использовали моноклональное антитело против CD3 человека, ОКТ3 (АТСС CRL-8001), таким же способом, который был описан выше.

Затем эффекторные клетки (отношение Е/Т=50; 1×10⁵ клеток/лунку; 50 мкл/лунку) были добавлены к каждой лунке, и планшеты инкубировались в течение 16 часов при 37°С в инкубаторе в атмосфере 5% СО₂.

После культивирования образцы центрифугировали (при 1500 об/мин при 4°С в течение 10 минут). Полученный в результате центрифугирования супернатант собирали. Радиоактивность в супернатанте после центрифугирования измеряли на γ-счетчике. Эта радиоактивность представляет собой количество ⁵¹Cr, высвобождающееся из клеток в культуральный супернатант при повреждении клеточной мембраны под действием ADCC.

Процент повреждения клеточных мембран (процент клеточного лизиса), которое было вызвано ADCC, индуцированным антителом против AILIM или антителом против CD3, определяли, считая, что радиоактивность, наблюдаемая в пробе, содержащей только среду, соответствует 0% повреждения клеточных мембран (0), в то время как радиоактивность, наблюдаемая в пробе, содержащей Nonidet, соответствует 100%-ному повреждению клеточных мембран.

Результаты представлены на фиг.70 и 71.

Результаты этого теста показали, что человеческое моноклональное антитело против AILIM человека согласно изобретению проявляет ADCC-индуцирующую активность зависимым от концентрации образом.

Пример 10. Определение генной и аминокислотной последовательностей человеческого моноклонального антитела против AILIM человека и их анализ

Последовательности кДНК, кодирующей тяжелые цепи, также как и кДНК, кодирующей легкие цепи различных человеческих моноклональных антител против AILIM человека, которые были получены в описанном выше Примере, определяли, как описано ниже. Изучали также и структурные свойства указанных генов.

С помощью экспресс-набора для очистки мРНК (Amersham-Pharmacia) из каждой из гибридом (клоны: AIH5D3 (JMab-136), AII289 (JMab-138) и AII394 (JMab-139)), которые продуцируют человеческие моноклональные антитела против AILIM человека, полученные в описанном выше Примере, были экстрагированы и очищены поли-А⁺РНК.

Клетки гибридом суспендировали в буфере для лизиса клеток (Lysis Buffer), а затем их лизировали с помощью шприца, чтобы добиться их солюбилизации. К солюбилизированному материалу добавляли смолу олиго-dT) и смесь перемешивали. После этого смолу олиго-dT) отмывали, а затем элюционным буфером смывали поли-А⁺РНК. Элюированную поли-А⁺РНК осаждали этанолом, а затем растворяли в буфере Tris-EDTA. Полученную концентрацию поли-А⁺РНК определяли по поглощению при длине волны 260 нм.

Двунитевую кДНК синтезировали с использованием поли-A⁺PHK в качестве матрицы согласно методу обратной транскриптазы М-MLV с использованием коммерчески доступного набора для синтеза кДНК (GIBCOBRL) и синтетической NotI-T-олиго-ДНК (SEQ ID NO: 1) в качестве праймера.

В частности, однонитевую кДНК синтезировали в растворе (примерно 50 мкл), содержащем поли-А⁺РНК (примерно 5 мкг), очищенную из гибридом, в качестве матрицы, праймер (приблизительно 400 пмоль) и обратную транскриптазу M-MLV, при 37°С в течение 1 часа. Затем к реакционному раствору добавляли dNTP, ДНК-полимеразу I, Н-РНКазу, ДНК-лигазу, буфер и дистиллированную воду (4 мкл) и смесь инкубировали при 16°С в течение 2 часов для синтеза двунитевой кДНК. Полученную в результате двунитевую кДНК экстрагировали смесью фенол/хлороформ, а затем осаждали этанолом.

Затем ДНК-линкер EcoRI (приблизительно 300 пмоль) и ДНК-лигазу (высокое лигирование; 33 мкл; TOYOBO) добавляли к раствору, содержащему двунитевую кДНК в ТЕ-буфере (приблизительно 50 мкл), и смесь инкубировали в течение 80 минут при 16°С с целью лигирования кДНК с линкерной ДНК. Использованная линкерная ДНК представляла собой двунитевую ДНК, состоящую из олиго-ДНК (20 adp; SEQ ID NO: 2) и олиго-ДНК (24 adp; SEQ ID NO: 3), которые были подвергнуты 5'-фосфорилированию и отжигу с помощью общеизвестных методов.

ДНК-лигазу экстрагировали смесью фенол/хлороформ, после чего осаждали этанолом. Затем ДНК-реактант переваривали коммерчески доступным рестрикционным ферментом NotI (TOYOBO), а потом инкубировали совместно с коммерчески доступным раствором АТФ (GIBCO BRL) и коммерчески доступной Т4-киназой (TOYOBO) при 37°С в течение 30 минут с целью фосфорилирования ее 5'-конца.

Полученную в результате ДНК осаждали этанолом, а затем фракционировали путем электрофореза в полиакриламидном геле. Вырезали участок геля, содержащий ДНК приблизительно от 500 п.н. до 2000 п.н. Вырезание геля производили, когда окрашенную бромидом этидия ДНК визуализировали путем облучения ультрафиолетовым светом в фотографическом устройстве.

Вырезанный гель разрушали, а затем подвергали суспендированию в ТЕ-буфере. Суспензию центрифугировали и отбирали образовавшийся супернатант. Полученную ДНК лигировали с коммерчески доступным вектором лямбда-фага λEXcell (0.25 мкг; Amersham Pharmacia) в присутствии коммерчески доступной ДНК-лигазы (Высокое лигирование; TOYOBO) (при 16°С в течение 30 минут). На следующем этапе ДНК-лигазу упаковывали в лямбда-фаг с помощью коммерчески доступного упаковывающего лямбда-фаг набора Gigapack III Gold (STRATAGENE) и полученными в результате частицами фага инфицировали Е.coli NM522 в качестве хозяина для получения библиотеки кДНК. Все манипулиции проводились в полном соответствии с инструкцией по проведению экспериментальных процедур, прилагаемой к набору.

После этого библиотеку кДНК подвергали скринингу методом гибридизации на планшетах (Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Labolatory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) следующим образом.

Библиотека кДНК (1×10⁴ пятен) наносилась на агаровые планшеты, и с помощью нейлоновых мембран Hybond-N получали фильтры с их отпечатками (Amersham Pharmacia). Полученные фильтры с отпечатками подвергали гибридации с помощью проб, меченных γ³²Р-АТФ, в гибридизационном буфере согласно методу гибридизации пятен. Используемыми пробами являлись HIGLC (SEQ ID NO: 4) для легких цепей антитела и NHCc2 (SEQ ID NO: 5) для тяжелых цепей антитела. Из позитивных клонов, полученных при первичном скрининге и при вторичном скрининге, выделяли Single-plaque отдельные пятна (клоны).

Каждая из цепей антитела - тяжелая и легкая - были амплифицированы методом PCR с помощью единственного PCR-праймера и набора Taq-PCR (TAKARA) с использованием фаговой суспензии из каждого позитивного клона в качестве матрицы ДНК. Используемой парой праймеров для легких цепей антитела служили ExcellE (SEQ ID NO: 6) и ck117 (SEQ ID NO: 7), и парой праймеров, используемых для тяжелых цепей антитела, служили ExcellE (SEQ ID NO: 6) и NHCc2 (SEQ ID NO: 5). Полученные в результате PCR-продукты фракционировали согласно обычно используемой методике с использованием электрофореза в агарозном геле. Вырезали участки геля, содержащие ДНК приблизительно в 600 п.н., соответствующие тяжелой цепи и легкой цепи. Нуклеотидные последовательности ДНК, очищенной из геля, анализировали с помощью секвенатора ДНК (37ЗА; PE-Applied Biosystems), ABI PRISM Sequencing Software (PE-Applied Biosystems) и ABI PRISM Auto Assembler (PE-Applied Biosystems). Для ДНК из каждого позитивного клона подтверждали наличие достаточной длины нуклеотидной последовательности.

γ-фагом из пятна каждого позитивного клона инфицировали Е. coil NP66 для вырезания in vivo нужной плазмидной ДНК и полученные в результате филаментные фаги наносили на содержащие ампициллин планшеты для образования колоний. Затем получали плазмидные ДНК, общеизвестным способом очищали их от колоний и с помощью этих плазмид осуществляли трансформацию Е. Coil JM109. Затем трансформированные клетки наносили на ампициллинсодержащие планшеты с питательным агаром для образования колоний.

Затем суспензию бактерий в ампициллинсодержащей среде LB, полученную из каждой колонии, переносили в жидкую питательную среду и бактерии культивировали в течение 24 часов при 37°С. Бактерии собирали из культуры и затем плазмидную ДНК очищали с помощью набора для очистки плазмид (Quiagen).

Каждую из плазмидных ДНК подвергали перевариванию под действием ферментов рестрикции EcoRI/NotI с целью выявления наличия векторной ДНК и ДНК-вставки (кДНК тяжелой или легкой цепи).

Каждую нуклеотидную последовательность кДНК, кодирующую тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела, которая была встроена в каждую очищенную плазмиду, определяли с помощью общеизвестного метода с использованием секвенатора ДНК (377А; PE-Applied Biosystems), ABI PRISM Sequencing Software (PE-Applied Biosystems) и ABI PRISM Auto Assembler (PE-Applied Biosystems).

Праймеры, используемые для определения последовательности, были следующими.

<Праймеры, используемые для определения кДНК тяжелой цепи>

Праймер M13R (SEQ ID NO: 8; STRATAGENE), ExcellE (SEQ ID NO: 6), 136H (SEQ ID NO: 9), 138/9H (SEQ ID NO: 10), AILIMHCl (SEQ ID NO: 11), HCcl (SEQ ID NO: 12), NHCc2 (SEQ ID NO: 5), HCc7 (SEQ ID NO: 13), HCc8 (SEQ ID NO: 14), НСс3 (SEQ ID NO: 15), HCc4 (SEQ ID NO: 16), НСс6 (SEQ ID NO: 17), HIGHC (SEQ ID NO: 18), HCc9 (SEQ ID NO: 19), HCc5 (SEQ ID NO: 20) и поли-А (SEQ ID NO: 21).

<Праймеры, используемые для определения кДНК легкой цепи>

Праймер M13R (SEQ ID NO: 8; STRATAGENE), ExcellE (SEQ ID NO: 6), AILIMLCl (SEQ ID NO: 22), AILIMLC2 (SEQ ID NO: 23), LCc1 (SEQ ID NO: 24), ck117 (SEQ ID NO: 7), HIGLC (SEQ ID NO: 4), LCc2 (SEQ ID NO: 25), HIK (SEQ ID NO: 26) и поли-А (SEQ ID NO: 21).

Список последовательностей, приведенный ниже, содержит последовательность кДНК, кодирующую тяжелую цепь, и последовательность кДНК, кодирующую легкую цепь человеческого моноклонального антитела против AILIM человека, которое продуцируется каждой из указанных выше гибридом, также как и аминокислотные последовательности, полученные из последовательностей кДНК.

Клон AIH5D3 (JMab-136)

<Тяжелая цепь>

Последовательность ДНК: SEQ ID NO: 27 (сигнальная последовательность: количество нуклеотидов от 69 до 125, V-область: количество нуклеотидов от 126 до 419)

Аминокислотная последовательность: SEQ ID NO: 28 (содержащая сигнальную последовательность: количество аминокислот от 1 до 19, вариабельная область: число аминокислот от 20 до 118)

<Легкая цепь>

Последовательность ДНК: SEQ ID NO: 29 (сигнальная последовательность: количество нуклеотидов от 39 до 104, V-область: количество нуклеотидов от 105 до 386)

Аминокислотная последовательность: SEQ ID NO: 30 (содержащая сигнальную последовательность: количество аминокислот от 1 до 22, вариабельная область: число аминокислот от 23 до 116)

Клон AII289 (JMab-138)

<Тяжелая цепь>

Последовательность ДНК: SEQ ID NO: 31 (содержащая сигнальную последовательность: количество нуклеотидов от 94 до 150, V-область: количество нуклеотидов от 151 до 441)

Аминокислотная последовательность: SEQ ID NO: 32 (содержащая сигнальную последовательность: количество аминокислот от 1 до 19, вариабельная область: число аминокислот от 20 до 116)

<Легкая цепь>

Последовательность ДНК: SEQ ID NO: 33 (содержащая сигнальную последовательность: количество нуклеотидов от 28 до 87, V-область: количество нуклеотидов от 88 до 375)

Аминокислотная последовательность: SEQ ID NO: 34 (содержащая сигнальную последовательность: количество аминокислот от 1 до 20, вариабельная область: число аминокислот от 21 до 116)

Клон AII394 (JMab-139)

<Тяжелая цепь>

Последовательность ДНК: SEQ ID NO: 35 (сигнальная последовательность: количество нуклеотидов от 96 до 152, V-область: количество нуклеотидов от 153 до 443)

Аминокислотная последовательность: SEQ ID NO: 36 (содержащая сигнальную последовательность: количество аминокислот от 1 до 19, вариабельная область: число аминокислот от 20 до 116

<Легкая цепь>

Последовательность ДНК: SEQ ID NO: 37 (сигнальная последовательность: количество нуклеотидов от 33 до 92, V-область: количество нуклеотидов от 93 до 380)

Аминокислотная последовательность: SEQ ID NO: 38 (содержащая сигнальную последовательность: количество аминокислот от 1 до 20, вариабельная область: число аминокислот от 21 до 116)

С использованием аналитического программного обеспечения для последовательности генов изучали библиотеку последовательности V BASE для генов вариабельной области иммуноглобулина человека, сконструированную Tomlinson et al. (Immunol. Today, Vol.16, No.5, p.237-242, 1995), для каждой из определяемых здесь последовательностей ДНК.

Результаты показали, что гены V-области соответственно тяжелой цепи и легкой цепи указанных выше моноклональных антител состояли из следующих сегментов:

<Ген V-области тяжелой цепи>

клон AIH5D3 (JMab-136): 1-02

клон AII289 (JMab-138): 3-13

клон AII394 (JMab-139): 3-13

<Ген V-области легкой цепи>

клон AIH5D3 (JMab-136): L5

клон AII289 (JMab-138): A27

клон AII394 (JMab-139): A27

Пример 11. Ингибиторный эффект человеческого моноклонального антитела против AILIM человека в отношении гиперчувствительности замедленного типа DTH)

Биологическая система иммунного ответа, функцией которой является элиминация вредных для живого организма антигенов (патогенных микроорганизмов, таких как вирусы, бактерии и паразиты, инородное тело и т.д.), в общем виде может быть разделена на врожденный иммунитет и приобретенный иммунитет.

Врожденный иммунитет связан с системой элиминации, основанной на неспецифическом узнавании, включая фагоцитоз фагоцитами (полиморфноядерные лейкоциты, моноциты, макрофаги и т.д.), атаку природными киллерами (NK-клетки) и опсонизацию антигена комплементом, и т.д.

Последний же, приобретенный иммунный ответ, связан с системой элиминации лимфоцитами (главным образом Т-клетки и В-клетки), которые приобретают специфичность (активируются) в ответ на конкретный антиген.

Далее, приобретенный иммунный ответ может быть глобально разделен на клеточный иммунитет и гуморальный иммунитет.

В отличие от зависящего от антитела гуморального иммунитета, клеточный иммунитет представляет собой иммунный ответ, экспрессируемый главным образом посредством прямого действия Т-клеток на антиген как на мишень. Клеточный иммунитет, как известно, вовлечен в иммунный ответ на вирусы или опухоли, в иммунный ответ, индуцируемый после трансплантации ткани или органа, в гиперчувствительность к некоторым лекарственным средствам и некоторые аутоиммунные заболевания.

Наиболее типичным явлением, относящимся к клеточному иммунитету, является хорошо известная туберкулиновая аллергия (почти синонимичная туберкулиновой гиперчувствительности). Туберкулиновая аллергия представляет собой аллергию замедленного типа, запускаемую туберкулезной бациллой. Такая аллергия возникает в результате инфицирования туберкулезной бациллой и может быть индуцирована в результате иммунного ответа организма при внутрикожной инъекции на туберкулиновый белок, продуцируемый в супернатанте культуры туберкулезной бациллы.

Аллергия замедленного типа представляет собой аллергию, опосредованную Т-клеткой (Т-клеткой памяти, запоминающей антиген), сенсибилизированной антигеном. Такая аллергия называется аллергией "замедленного типа", поскольку организму, сенсибилизированному антигеном, требуется от 24 до 48 часов для развития аллергического ответа на воспаление, индуцируемое Т-клеткой памяти при повторном контакте с антигеном.

Явление туберкулиновой аллергии, которая является представителем аллергий замедленного типа, обычно используется в "туберкулиновом тесте" для диагностирования того, был ли прежде когда-нибудь организм данного животного сенсибилизирован инфекцией, вызванной тебуркулезной бациллой. Конкретнее, указанный тест проводится следующим образом: очищенный туберкулин (очищенное производное белка; PPD; обычно при диагностике используют 0.1 мл производного, 0.05 мкг/0.1 мл (2.5 TU)), который представляет собой туберкулиновый белок, очищенный из культуры туберкулезной бациллы, вводится животному внутрикожно; диаметр общего покраснения кожи в месте инъекции измеряют через 48 часов после инъекции; наличие инфекции туберкулиновой бациллой может быть диагностировано на основе измеряемого размера покраснения кожи. В случае, если диаметр общего покраснения составляет менее 4 мм, считается, что субъект имеет отрацительную реакцию; если диаметр покраснения составляет от 4 до 9 мм, субъект считается имеющим ложноположительную реакцию; а в случае, когда размер покраснения достигает в диаметре 10 мм или более, считается, что у субъекта реакция положительная.

Аллергии замедленного типа, ассоциированные с клеточным иммунитетом, включают в себя, например, гиперчувствительность типа феномена Джоунса-Моута, которая транзиторно индуцируется малыми количествами белка или чего-нибудь подобного, контактную аллергию к лекарственным препаратам, таким как пикрилхлорид или растительные токсины, такие как японская смола (Japanese lacquer), или аллергия, связанная с отторжением трансплантата (например, аллогенного трансплантата), а также указанная выше аллергия на антиген из инфекционного патогена, такая как туберкулиновая аллергия, вызванная описанной выше туберкулезной бациллой.

В этом тесте ингибиторный эффект анти-AILIM-антитела на гиперчувствительность замедленного типа (отложенную аллергию) оценивали путем визуализации с использованием указанного выше туберкулинового теста. Тестирование проводили следующим образом.

Каждую из обезьян cynomolgus (самцы, вес тела: 6.0-8.5 кг. Объединенный Центр Изучения Биологии Окружающей Среды (Environmental Biological Life Science Research Center Inc.); по 3 особи в каждой группе), которых сенсибилизировали с помощью BCG (туберкулезная вакцина), которая представляет собой ослабленную живую бактерию туберкулезной бациллы бычьего типа, анестезировали кетамина гидрохлоридом (10 мг/кг, внутримышечная инъекция), а затем внутрикожно вводили любую из указанных ниже тестируемых проб в количестве 0.1 мл в каждое место инъекции (6 мест инъекции/особь) на грудной клетке. Расстояние между местами инъекций составляло 3 см или более:

(1) смесь 1:1 раствора человеческого моноклонального антитела против AILIM человека (JMab-136; 0.2 мг; 10 мкг на каждое место инъекции) и туберкулина (4 мкг/1 мл физиологического раствора);

(2) смесь 1:1 раствора человеческого моноклонального антитела против AILIM человека (JMab-136; 2 мг; 100 мкг на каждое место инъекции) и туберкулина (4 мкг/1 мл физиологического раствора);

(3) фосфатный буфер (PBS (-)) в качестве контроля;

(4) смесь 1:1 раствора коммерчески доступного стероидного противовоспалительного агента, преднизолона (0.2 мг; 10 мкг на каждое место инъекции) и туберкулина (4 мкг/1 мл физиологического раствора) в качестве позитивного контроля;

(5) смесь 1:1 раствора человеческого моноклонального антитела против KLH человека (Пример <2-2>; 0.2 мг; 10 мкг на каждое место инъекции) и туберкулина (4 мкг/1 мл физиологического раствора) в качестве негативного контроля.

Через 24 часа после инъекции каждой пробы в месте каждой инъекции измеряли области основного и минорного покраснений, чтобы оценить [общую] область покраснения.

Результат представлен на фиг.72.

Результаты показали, что покраснение вследствие аллергии замедленного типа значительно ингибировалось в любой из групп, инъецированных анти-AILIM-антителами, по сравнению с группами контроля и негативного контроля. Ингибиторный эффект был сравним с таковым стероидного противовоспалительного агента, использованного в качестве позитивного контроля.

Пример 12. Анализ экспрессии AILIM в различных тканях больных с заболеванием трансплантат против хозяина (GVHD)

Экспрессию AILIM в различных тканях, полученных при биопсии у пациентов, которые являлись реципиентами, подвергнутыми пересадке аллогенного трансплантата от доноров, и у которых после трансплантации клинически диагностировали острое поражение заболеванием трансплант против хозяина (GVHD), изучали общеизвестным традиционным способом. Ткани окрашивали НЕ (гематоксилин-эозином) и человеческим моноклональным антителом против AILIM человека (JMab-36), полученным в описанном выше Примере.

Анализ проводили с использованием 33 проб из различных тканей, полученных у больных с острым GVHD (28 случаев), а также 5 проб от больных с хроническим GVHD (5 случаев).

Результаты были следующими: AILIM-позитивная реакция была обнаружена в 15 из 29 проб кожной ткани, в 1 из 3 проб ткани желудка и в 1 из 1 пробы ткани кишечника, все из которых были получены у пациентов с острым GVHD. AILIM-позитивная реакция была обнаружена в 1 из 3 проб кожной ткани, в 2 из 2 проб ткани кишечника, все из которых были получены у пациентов с хроническим GVHD. Далее, AILIM-позитивная реакция была обнаружена в 10 из 13 проб, где наблюдалась значительная инфильтрация лимфоцитов.

Пример 13. Активность человеческого моноклонального антитела против AILIM человека в отношении передачи костимуляторного сигнала в Т- клетках обезьян

Эксперимент, проведенный, как описано в Примере 7, показал, что человеческие моноклональные антитела против AILIM человека согласно изобретению способны усиливать пролиферацию Т-клеток человека через контролирование Т-клеточного ответа у человека, в частности, контролирование передачи опосредованного AILIM костимуляторного сигнала клеткам. В этом тесте изучали то, способны ли или нет человеческие моноклональные антитела проявлять активность, усиливающую пролиферацию T-клеток обезьяны, такими же методами, которые описаны в Примере 7.

<13-1> Разбавление антитела

Моноклональное антитело против CD3 человека, SP34 (BD-Pharmingen), разбавляли фосфатным буфером (PBS) до конечной концентрации 1 мкг/мл.

Полученное выше человеческое моноклональное антитело против AILIM человека, JMab136, разбавляли фосфатным буфером до конечной концентрации 40 мкг/мл. Затем растворы антитела разбавляли с помощью PBS для получения различных концентраций антител (от 40 до 0.064 мкг/мл).

<13-2> Покрытие микропланшетов антителом

Каждую лунку 96-луночных микропланшетов покрывали моноклональным антителом против CDS человека, SP34 (1 мкг/мл; по 25 мкл в каждую лунку), и человеческим моноклональным антителом против AILIM человека, JMab136 (от 40 до 0.064 мкг/мл; по 25 мкл в каждую лунку). Планшеты инкубировали при 37°С в течение 2 часов. Затем растворы антитела отбрасывали и каждую лунку промывали 3 раза буфером PBS. После промывки в каждую лунку добавляли среду RPMI 1640, содержащую 10% ЭБС (100 мкл/лунку), и планшеты инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Соответствующие лунки планшетов покрывали упомянутыми выше антителами.

Контрольные эксперименты проводили таким же образом, используя планшеты, покрытые человеческим моноклональным антителом против KLH (JMab23; см. предыдущий пример) в качестве контрольных антител, вместо человеческих моноклональных антител против AILIM человека.

Микропланшеты, покрытые антителами, были использованы в следующих анализах.

<13-3> Получение суспензии Т-клеток обезьяны

Периферическую кровь собирали у обезьян cynomolgus и мононуклеарные клетки фракционировали путем центрифугирования в градиенте плотности с помощью NycoPrepI.077А (Nycomed). В соответствии с прилагаемой инструкцией Т-клетки обезьяны отделяли от мононуклеарных клеток обезьян cynomolgus с использованием антитела против CD4 человека, М-Т477 (BD-Pharmingen), антитела против CD8 человека, RPA-T8 (BD-Pharmingen), микробусинок противомышиного IgG (Miltenyi) и магнитного сортера. Счет Т-клеток осуществляли с помощью гемоцитометра. Обезьяньи Т-клетки суспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% ЭБС. Таким образом получали суспензию Т-клеток (1×10⁶ клеток/мл).

<13-4> Клеточная культура

(1) Культура с использованием микропланшет, покрытых антителом против CD3 человека и антителом против AILIM человека

Суспензию Т-клеток обезьяны добавляли к каждой лунке микропланшета, покрытого указанным выше антителом, и планшет инкубировали в течение 2 дней при 37°С в CO₂-инкубаторе.

После того как культивирование было завершено, соответствующие микропланшеты использовали в следующем анализе.

<13-5> Определение пролиферативной активности Т-клеток

Метилированный [³Н]-тимидин (0.5 мкКи/лунку; Amersham-Pharmacia) добавляли после инкубации к каждой лунке планшетов и планшеты инкубировали в течение 6 часов при 37°С в CO₂-инкубаторе. После инкубации клетки собирали на фильтрах GF/C (Packard) с помощью коллектора клеток. Затем фильтры сушили при 40°С в течение 3 или более часов, а затем к ним добавляли микросцинти 0 (20 мкл/лунку; Packard). Радиоактивность ³Н, встроенного в клетки, задержанные на фильтрах, измеряли на счетчике (TOP COUNT) с целью определения степени пролиферации Т-клеток после культивирования

Результат показан на фиг.73.

Результат этого анализа показал, что обезьяньи Т-клетки значительно пролиферировали, в зависимости от концентрации клеток, когда микропланшеты были покрыты моноклональным антителом против AILIM человека (человеческое моноклональное антитело или мышиное моноклональное антитело) совместно с антителом против CD3 человека.

Эти результаты также предполагают, что человеческие моноклональные антитела против AILIM человека согласно изобретению могут связываться с мышиным AILIM и обладают активностью, связанной с регуляцией функции AILIM обезьян.

Пример 14. Установление способа идентификации и количественного определения веществ, способных связываться с AILIM или с лигандом AILIM

Метод ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) был использован для идентификации или количественного определения веществ, способных связываться с AILIM (ICOS) или с лигандом AILIM (B7h/B7RP1/GL50/LICOS).

Принцип метода, подробно описанного ниже в качестве примера, основан на установлении с помощью метода ELISA степени ингибирования связывания растворимого AILIM человека (hAILIM-IgFc) и растворимого лиганда AILIM человека (hB7h-IgFc), вызванного указанным веществом.

<14-1> Проба

Были использованы следующие пробы:

(1) стрептавидин-HRP (Southern Biotechnology Associates, Inc.);

(2) растворимый лиганд AILIM человека (слитый белок внеклеточной области B7h человека и константной области IgGI человека), указанный белок был получен способом, описанным ниже в <14-2>;

(3) меченный биотином растворимый AILIM-IgFc, AILIM-IgFc получали путем дальнейшей очистки антигена, полученного согласно тому же методу, который был описан в более ранних заявках (JP-A 11-29599 (Пример 16 (2)) и WO 98/38216 (Пример 16 (2))) одного из авторов данного изобретения, Tezuka;

(4) человеческое моноклональное антитело против AILIM человека (JMab-136. описанное выше),

(5) человеческое моноклональное антитело против KLH (антитело в качестве негативного контроля; JMab-23, описанное выше);

(6) фосфатный буфер (PBS (-); Nikken Seibutsu);

(7) среда PRMI 1640 (Nikken Seibutsu);

(8) эмбриональная бычья сыворотка (ЭБС; JRH-Bioscience);

(9) 30% бычий сывороточный альбумин (BSA; Sigma);

(10) Tween 20 (BioRad);

(11) хромогенный субстрат ТМВ⁺ (Dako).

<14-2> Получение растворимого лиганда AILIM человека (слитый белок (hB7h-IgFc) внеклеточной области B7h человека и константной области IgG1 человека)

Тотальную РНК получали из мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови человека, тем же самым способом, который описан ранее в Примере. кДНК синтезировали из полученной тотальной РНК (5 мкг), используемой в качестве матрицы, с помощью системы Superscript преамплификации для синтеза первой цепи кДНК (GIBCO-BRL).

Далее, 5'-праймер (5'-GAGGTCTCCGCCCTCGAGATGCGGCTGGGCAGTCC-3', SEQ ID NO: 39), имеющий сайт рестрикции XhoI, и 3'-праймер (5'-CACAGGACAGCCAGGGGATCCCACGTGGCCGCG-3', SEQ ID NO: 40), имеющий сайт рестрикции BamHI на соответствующих их концах, были сконструированы и синтезированы для амплификации кДНК, кодирующей внеклеточную область лиганда AILIM человека (hB7h), методом PCR. Используя кДНК в качестве матрицы и пару праймеров, проводили полимеразную цепную реакцию для получения ДНК, имеющей Xhol и BamHI на соответствующих ее концах, содержащую кДНК, кодирующую внеклеточную область B7h человека. Полученные в результате PCR продукты были подвержены перевариванию под действием Xhol и BamHI и фракционированию под действием электрофореза в агарозном геле для выделения полосы, соответствующей фрагменту кДНК приблизительно в 720 п.н., который, как было предсказано, кодирует искомую внеклеточную область. Выделенный фрагмент кДНК субклонировали в плазмиду pBluescript II SK (+) (Stratagene), предварительно подвергнутую перевариванию под действием XhoI и BamHI. Было выявлено, что фрагмент кДНК содержал часть, кодирующую внеклеточную область B7h человека, путем секвенирующего анализа с помощью автоматизированного флуориметрического ДНК-секвенатора (Applied Biosystems).

С другой стороны, ДНК, кодирующая Fc человеческого IgG1 в качестве партнера слияния, была получена в виде ДНК-фрагмента BamHI-XbaI (приблизительно 1.3 т.п.н.) путем переваривания плазмиды (см. Cell, Vol.61, p.1303-1313, 1990; получено Dr. Seed et al., Massachusetts General Hospital) с помощью BamHI и XbaI. Этот фрагмент содержал экзоны, кодирующие шарнирные области IgGI, Сγ12 и Сγ13.

Фрагмент XhoI-BamHI, кодирующий внеклеточную область B7h человека (h B7h), и фрагмент BamHI-XbaI, содержащий экзоны, кодирующие Fc человеческого IgG1 (сокращаемые как "IgFc"), полученные, как описано выше, были субклонированы в плазмиду pBluescript II SK (+) (Stratagene), предварительно подвергнутую перевариванию под действием Xhol и XbaI.

Затем плазмиду подвергали перевариванию под действием XhoI и XbaI для получения фрагмента ДНК приблизительно в 1.8 т.п.н., содержащего слитую ДНК внеклеточной области B7h человека и IgFc человека. С помощью ДНК-лигазы Т4 этот слитый фрагмент ДНК вставляли в экспрессирующий вектор pME18S (Medical Immunology, Vol.20, No.1, p.27-32, 1990, и "Handbook for Genetic Engineering, "Experimental Medicine, supplement, Yodosha, pp.101-107, 1992) между сайтами XhoI и XbaI, чтобы сконструировать плазмиду phB7h-IgFc.

Однослойные клетки COS7 (АТСС CRL-1651), культивируемые в среде DMEM, содержащей 10% бычью эмбриональную сыворотку и ампициллин, до стадии образования конфлуэнта, были трансформированы плазмидой phB7h-IgFc путем электропорации с получением трансформированных клеток.

Трансформированным клеткам предоставляли возможность экспрессировать hB7h-IgFc, культивируя их в бессывороточной среде ASF104 в течение 72 часов.

HB7h-IgFc очищали с помощью аффинной колонки с протеин G-сефарозой (Amersham Pharmacia) следующим образом.

Указанный выше культуральный супернатант центрифугировали для получения супернатанта после центрифугирования. Полученный в результате супернатант наносили на аффинную колонку протеин G-сефароза, предварительно уравновешенную связывающим буфером. Затем колонку промывали связывающим буфером, а потом промывали элюирующим буфером. Элюированный раствор собирали и затем диализовали против фосфатного буфера. Внешний диализующий буфер меняли дважды или более. Таким образом получали hB7h-IgFc.

<14-3> Разбавление антитела и растворимого AILIM человека (hAILIM-IgFc) и их реакция

Первоначальные растворы (20 мкг/мл) моноклонального антитела против AILIM человека (JMab-136) и моноклонального антитела против KLH человека (JMab-23) в качестве отрицательного контрольного антитела разбавляли в серии из 11 уровней и каждую пробу (200 мкл) комбинировали и тщательно перемешивали с 200 мкл среды RPMI 1640, содержащей 10% ЭБС. Таким образом получали растворы с различной концентрацией антитела. Меченное биотином hAILIM-IgFc (2 мкл/пробирку; конечная концентрация 1 мкг/мл) добавляли к каждому из полученных растворов с различной концентрацией антитела. Полученные в результате растворы тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут.

<14-4> Анализ активности моноклонального антитела против AILIM в отношении ингибирования связывания hAILIM-IgFc с hB7h-IgFc

hB7h-IgFc добавляли в каждую лунку 96-луночного микропланшета (50 мкл/лунку (800 нг/лунку)). Планшеты заклеивали, а затем инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Потом из каждой лунки удаляли раствор, а лунки трижды промывали PBS (120 мкл). Затем в каждую лунку добавляли PBS, содержащий 0.5% BSA (100 мкл/лунку), чтобы заблокировать нереактивные сайты. Планшеты заклеивали, а затем инкубировали при 37°С в течение 1 часа. После инкубации раствор удаляли, а лунки трижды промывали PBS (120 мкл). После этого в лунки добавляли каждый из образцов (50 мкл/лунку), полученный в разделе <14-3>. Планшеты заклеивали, а затем инкубировали при 37°С в течение 1 часа. После инкубации раствор из каждой лунки удаляли. Лунки трижды промывали средой RPMI 1640, содержащей 10% ЭБС (120 мкл), предварительно прогретой при 37°С. После этого PBS, содержащий 3.7% формалина (100 мкл/лунку), добавляли в каждую лунку и планшет инкубировали на льду в течение 5 минут. Раствор удаляли из каждой лунки и лунки трижды промывали 0.1% Tween 20 (120 мкл). Затем в каждую лунку вносили стрептавидин-HRP (50 мкл/лунку). Планшеты заклеивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Раствор удаляли из каждой лунки и лунки трижды промывали PBS, содержащим 0.1% Tween 20 (120 мкл). Затем в каждую лунку вносили хромогенный субстрат TMB⁺ (50 мкл/лунку) и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. После этого для остановки реакции в каждую лунку вносили 2 N серную кислоту (50 мкл/лунку). Поглощение в каждой лунке измеряли при длине волны 450 нм с помощью устройства THERMO max (Molecular Devices).

Результаты представлены на фиг.74-76.

Полученные результаты показали, что антитело против AILIM обладает активностью по ингибированию связывания hAILIM-IgFc и hB7h-IgFc дозо-зависимым образом.

Соответственно, этот Пример показывает, что система анализа, иллюстрируемая данным способом, может быть использована для скрининга и идентификации веществ, способных связываться с AILIM или с лигандом AILIM (например, антитела или искусственного низкомолекулярного соединения).

Пример 15. Активность человеческого моноклонального антитела против AILIM человека в отношении ингибирования пролиферации Т-клеток человека, связанных с передачей костимуляторного сигнала, опосредованного AILIM-AILIM-лигандом

Изучали то, обладают ли или не обладают моноклональные антитела против AILIM человека согласно изобретению регулирующей активностью в отношении передачи сигнала, опосредованного AILIM на поверхности Т-клеток человека, на основе измерения ингибирующего эффекта человеческого моноклонального антитела против AILIM человека на пролиферацию клеток, вызванную контактированием Т-клеток человека с лигандом AILIM (B7h/B7RPl/GL50/LICOS).

<15-1> Разбавление антитела

Моноклональное антитело против CD3 человека, ОКТ3 (АТСС CRL-8001), разбавляли фосфатным буфером (PBS) до конечной концентрации 8 мкг/мл.

Растворимый лиганд AILIM человека (hB7h-lgFc), полученный выше, разбавляли PBS до конечной концентрации 40 мкг/мл. Затем растворы антитела дополнительно разбавляли PBS для получения различных концентраций антител (от 40 до 0.064 мкг/мл).

<15-2> Покрытие микропланшета антителом

Каждую лунку 96-луночных микропланшетов покрывали (1) моноклональным антителом против CD3 человека, ОКТ3 (8 мкг/мл; по 25 мкл в каждую лунку) и hB7h-lgFc (от 40 до 0.064 мкг/мл; по 25 мкл в каждую лунку). Планшеты инкубировали при 37°С в течение 2 часов. Затем растворы антитела отбрасывали, а каждую лунку трижды промывали PBS. После промывки в каждую лунку добавляли среду RPMI 1640, содержащую 10% ЭБС (100 мкг/лунку), и планшеты инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Таким образом покрывали соответствующие лунки планшетов.

<15-3> Получение суспензии Т-клеток человека

У здоровых нормальных доноров собирали периферическую кровь и путем центрифугирования в градиенте плотности с использованием LymphoPrep (Nycomed) фракционировали мононуклеарные клетки. В соответствии с прилагаемым руководством для экспериментального применения Т-клетки человека отделяли от мононуклеарных клеток человека с использованием набора для выделения пан-Т-клеток (Miltenyi) и магнитного сортера клеток. Счет Т-клеток производили с помощью гемоцитометра. Т-клетки человека суспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% ЭБС, обогащенной человеческим моноклональным антителом против AILIM человека, Jmab136 (20 мкг/мл). Полученную суспензию Т-клеток человека (1×10⁶ клеток/мл) инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут.

Человеческое моноклональное антитело против KLH, JMAb23 (20 мкг/мл) использовали в качестве отрицательного контрольного антитела.

<15-4> Культура клеток

Таким же способом, который был описан выше, суспензию Т-клеток человека (100 мкл/лунку; 1×10⁵ клеток/лунку) добавляли в каждую лунку микропланшета, покрытого антителом против CD3 человека и hB7h-IgFc, и планшеты инкубировали при 37°С в течение 3 дней в CO₂-инкубаторе.

<15-5> Определение пролиферативной активности Т-клеток

Метилированный [³H]-тимидин (0.5 мкКи/лунку; Amersham-Pharmacia) добавляли после культивирования в каждую лунку планшетов и планшеты инкубировали в течение 6 часов при 37°С в СО₂-инкубаторе. После инкубации клетки собирали на фильтрах GF/C (Packard) с помощью коллектора клеток. Затем фильтры сушили при 40°С в течение 3 или более часов, а затем к ним добавляли микросцинти 0 (20 мкл/лунку; Packard). Радиоактивность ³H, встроенного в клетки, задержанные на фильтрах, измеряли на счетчике (TOP COUNT) с целью определения степени пролиферации Т-клеток после культивирования.

Результат показан на фиг.77.

Полученный в этом тесте результат показал, что Т-клетки человека существенно росли, в зависимости от концентрации B7h-IgFc человека (в анализе с использованием отрицательного контрольного антитела). Кроме того, моноклональное антитело против AILIM человека значительно ингибировало протиферацию Т-клеток человека.

Пример 16. Активность человеческого моноклонального антитела против AILIM человека в отношении ингибирования пролиферации Т-клеток обезьяны, ассоциированных с передачей костимуляторного сигнала, опосредованного AILIM-AILIM-лигандом

Такой же самый тест был проведен с использованием Т-клеток обезьяны вместо Т-клеток человека в описанном выше Примере 15.

<16-1> Разбавление антитела и прочего

Моноклональное антитело против CD3 человека, SP34 (BD-Pharmingen), разбавляли фосфатным буфером (PBS) до конечной концентрации 1 мкг/мл.

Полученный выше B7h-IgFc человека разбавляли PBS до конечной концентрации 40 мкг/мл. Затем раствор антитела дополнительно разбавляли PBS с получением различных концентраций антитела (от 40 до 0.0064 мкг/мл).

<16-2> Покрытие микропланшета антителом

Каждую лунку 96-луночных микропланшетов покрывали (1) моноклональным антителом против CD3 человека, SP34 (BD-Pharmingen) (1 мкг/мл; по 25 мкл в каждую лунку), и B7h-IgFc человека (от 40 до 0.0064 мкг/мл; по 25 мкл в каждую лунку). Планшеты инкубировали при 37°С в течение 2 часов. После этого раствор антитела отбрасывали и каждую лунку трижды промывали PBS. После промывки в каждую лунку добавляли среду RPMI 1640, содержащую 10% ЭБС (100 мкл/лунку), и планшеты инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Таким образом, соответствующие лунки микропланшетов были покрыты антителом.

<16-3> Получение суспензии Т-клеток обезьяны

У обезьян cynomolgus собирали периферическую кровь. Фракцию, содержащую мононуклеарные клетки, получали в результате центрифугирования в градиенте плотности с помощью NycoPrepl.077A (Nycomed.). Согласно руководству для применения обезьяньи Т-клетки отделяли от мононуклеарных клеток, используя антитело против CD4 человека, М-Т477 (BD-Pharmingen), антитело против CD8 человека, RPA- T8 (BD-Pharmingen), микробусинок противомышиного IgG (Miltenyi) и магнитного сортера. Счет Т-клеток осуществляли с помощью гемоцитометра. Обезьяньи Т-клетки суспендировали в среде RPMI 1640, содержащей человеческое моноклональное антитело против AILIM человека, JMab-136 (20 мкг/мл) и 10% ЭБС, с получением Т-клеточной суспензии (1×10⁶ клеток/мл). Суспензию инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут.

Человеческое моноклональное антитело против KLH человека, JMab- 23 (20 мкг/мл) использовали в качестве антитела для отрицательного контроля.

<16-4> Культура клеток

Таким же способом, который описан выше, суспензию Т-клеток обезьяны (100 мкл/лунку; 1×10⁵ клеток/лунку) добавляли в каждую лунку микропланшета, покрытого антителом против CD3 человека и hB7h-IgFc, и планшет инкубировали при 37°С в течение 3 дней в CO₂-инкубаторе.

<16-5> Определение пролиферативной активности Т-клеток

Метилированный [³H]-тимидин (0.5 мкКи/лунку; Amersham-Pharmacia) добавляли после культивирования в каждую лунку планшетов и планшеты инкубировали в течение 6 часов при 37°С в СО₂-инкубаторе. После инкубации клетки собирали на фильтрах GF/C (Packard) с помощью коллектора клеток. Затем фильтры сушили при 40°С в течение 3 или более часов, а затем к ним добавляли микросцинти 0 (20 мкл/лунку; Packard). Радиоактивность ³Н, встроенного в клетки, задержанные на фильтрах, измеряли на β-счетчике (TOP COUNT) с целью определения степени пролиферации Т-клеток после культивирования.

Полученный результат приведен на фиг.78.

Результат этого теста показал, что рост Т-клеток обезьяны в значительной степени зависел от концентрации B7h-IgFc человека (в анализе с использованием антитела в качестве отрицательного контрольного антитела). Кроме того, моноклональное антитело против AILIM человека в значительной степени ингибировало пролиферацию Т-клеток обезьяны.

Промышленная применимость

Человеческие моноклональные антитела согласно изобретению, способные связываться с AILIM человека, имеют человеческую природу, а следовательно, эти антитела не должны вызывать серьезных иммунных реакций отторжения у человека, т.е. НАМА (человеческая антигенность против мыши) у хозяина, которая представляет собой серьезную терапевтическую проблему (побочный эффект) в антительных фармацевтических препаратах, содержащих антитело, полученное у млекопитающих, не являющихся человеком, такое как антитело, полученное у мыши. Таким образом, антитело согласно изобретению приобретает огромное значение в качестве фармацевтического антитела.

Таким образом, человеческое моноклональное антитело согласно изобретению против AILIM (в частности, AILIM человека) и фармацевтические композиции, содержащие человеческое моноклональное антитело, вообще не индуцируют иммунного отторжения у хозяина, которое вызывается при действии НАМА; таким образом, оно может быть использовано в качестве фармацевтических препаратов, способных контролировать различные биологические реакции (например, пролиферацию клеток, экспрессирующих AILIM, продукцию цитокинов клетками, экспрессирующими AILIM, иммунный лизис клеток или смерть клеток (апоптоз), экспрессирующих AILIM, и активность индуцирования антитело-зависимого повреждения клеток, экспрессирующих AILIM), ассоциированные с передачей опосредованного AILIM костимуляторного сигнала (вторичный сигнал) клеткам, экспрессирующим AILIM; и/или может быть использовано для лечения или предупреждения различных заболеваний, ассоциированных с передачей опосредованного AILIM сигнала, контролируя и ингибируя запуск и/или прогрессирование заболевания.

В частности, обеспечив фармацевтические препараты, содержащие человеческое моноклональное антитело против AILIM согласно изобретению или часть его в качестве активного ингредиента, можно добиться ингибирования или лечения, или предотвращения, например, множества заболеваний (таких, например, как ревматоидный артрит, множественный склероз, аутоиммунный тиреоидит, аллергический контактный дерматит, плоский лишай как хроническое воспалительное заболевание кожи, системная эритематозная красная волчанка, инсулинозависимый сахарный диабет и псориаз и т.д.), классифицируемых как аутоиммунные заболевания или аллергические заболевания (в частности, аутоиммунные заболевания и аллергии замедленного типа за счет клеточного иммунитета); артропатии (например, ревматоидный артрит (RA), остеоартрит (ОА)), воспаление (например, гепатит); реакция трансплантат против хозяина (реакция GVH); заболевание трансплантат против хозяина (болезнь трансплантат против хозяина, GVHD); иммунное отторжение, ассоциированное с трансплантацией (аллогенный трансплантат или гетерогенный трансплантат) тканей (таких тканей как кожа, роговица и костная ткань) или органов (печень, сердце, легкое, почка, поджелудочная железа и т.д.); иммунный ответ на чужеродный антиген или собственный антиген (например, продукция антитела против антигена, клеточная пролиферация, продукция цитокина и т.д.); и заболевания, которые являются потенциально вызванными аномалиями в кишечном иммунитете (в частности, воспалительного заболевания кишечника (в частности, болезнь Крона и язвенный колит); и алиментарная аллергия и т.д.

Фармацевтические композиции согласно изобретению создают возможность для лечения или предупреждения некоторых воспалений, при которых используют в качестве противовоспалительных средств стероидные лекарственные препараты, например воспаления, ассоциированные с различными артритами (ревматоидный артрит, остеоартрит и т.д.), пневмония, гепатит (включая вирусный гепатит), воспаление, ассоциированное с инфекционными заболеваниями, воспалительное заболевание кишечника, энтериты, нефриты (гломерулонефрит, воспаление, ассоциированное с почечным фиброзом, гастрит, васкулит, панкреатит, перитонит, бронхит, миокардит, энцефалит, воспаление, ассоциированное с ишемически-реперфузионным повреждением (миокардиальное ишемически-реперфузионное повреждение и т.д.), воспаление, ассоциированное с иммунным отторжением после трансплантации тканей или органов, ожогом, различные кожные воспаления (псориаз, аллергический контактный дерматит, плоский лишай как хроническое воспалительное заболевание кожи), воспаление, ассоциированное с множественным повреждением органов, воспаление после операции РТСА или PTCR и воспаление, ассоциированное с атеросклерозом, аутоиммунным тиреоидитом и т.д.

Кроме того, в связи с указанным выше ингибированием и лечением иммунного отторжения, ассоциированного с трансплантацией тканей и органов, как описано выше, фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть использованы в сочетании с известными иммуносупрессантами, используемыми для ингибирования иммунного отторжения в трансплантационной терапии, усиливая тем самым действие известных лекарственных средств для ингибирования отторжения трансплантата.

Более того, путем применения способа идентификации веществ, способных связываться с AILIM или с лигандом AILIM, который находится в рамках объема защиты настоящего изобретения, становится возможным контролировать передачу сигнала, ассоциированного со взаимодействием между AILIM и лигандом AILIM, путем связывания с AILIM или с лигандом AILIM и таким образом производить скрининг и отбор фармацевтических агентов (синтетических химических соединений и антител), обладающих потенциальной активностью для лечения указанного выше множества заболеваний.

Список последовательностей

SEQ ID NO: 1

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, NotI-T.

SEQ ID NO: 2

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного линкера, 20adp.

SEQ ID NO: 3

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного линкера, 24adp.

SEQ ID NO: 4

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, HIGLC.

SEQ ID NO: 5

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, NHCc2.

SEQ ID NO: 6

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, ExcellE.

SEQ ID NO: 7

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, ck117.

SEQ ID NO: 8

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, M13R.

SEQ ID NO: 9

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, 136Н.

SEQ ID NO: 10

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, 138/9Н.

SEQ ID NO: 11

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, AILIMHC1.

SEQ ID NO: 12

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, HCcl.

SEQ ID NO: 13

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, НСс7.

SEQ ID NO: 14

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, НСс8.

SEQ ID NO: 15

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, НСс3.

SEQ ID NO: 16

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, НСс4.

SEQ ID NO: 17

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, НСс6.

SEQ ID NO: 18

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, HIGHC.

SEQ ID NO: 19

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, НСс9.

SEQ ID NO: 20

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, НСс5.

SEQ ID NO: 21

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, polyA.

SEQ ID NO: 22

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, AILIMLC1.

SEQ ID NO: 23

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, AILIMLC2.

SEQ ID NO: 24

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, LCcl.

SEQ ID NO: 25

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, LCc2.

SEQ ID NO: 26

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера, HIK.

SEQ ID NO: 39

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера.

SEQ ID NO: 40

Дополнительная информация: Описание искусственной последовательности: Последовательность искусственно синтезированного праймера.

Изобретение относится к иммунобиотехнологии и может найти применение в медицине для лечения заболеваний, связанных с AILIM-опосредованной передачей костимулирующего сигнала. Человеческое моноклональное антитело (монАт) или его фрагменты включает тяжелую и/или легкую цепь, имеет константу скорости связывания с AILIM 1,0×10³ (1/М.сек) и более и константу скорости диссоциации между монАт и AILIM 1,0×10^-3 (1/сек) или менее. МонАт характеризуется также нуклеотидной последовательностью, кодирующей вариабельную область легкой и/или тяжелой цепи, а также соответствующими аминокислотными последовательностями. Изобретение касается ДНК и ее части, кодирующей монАт или его фрагменты, а также векторы, включающие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело или его фрагменты. Человеческое монАт может быть получено с использованием генетически рекомбинантного хозяина. МонАт включает в состав фармацевтических композиций для ингибирования или индукции опосредованной AILIM передачи сигнала в клетку для индукции антитело-зависимой цитотоксичности против AILIM-экспрессирующих клеток и др. Использование изобретения представляется эффективным для лечения различных аутоиммунных заболеваний, связанных с AILIM-опосредованной передачей костимуляторного сигнала. 21 н. и 54 з.п. ф-лы, 78 ил., 1 табл.

1. Человеческое моноклональное антитело, которое связывается с AILIM, или его часть, где указанная часть выбрана из группы, состоящей из F(ab')₂, Fab', Fab, Fv, sFv, dsFv и dAb, которое включает тяжелую и/или легкую цепь, константа скорости связывания (ka) с AILIM составляет 1,0×10³ (1/М.с) или более и константа скорости диссоциации (kd) между антителом и AILIM составляет 1,0×10^-3 (1/с) или менее.2. Человеческое моноклональное антитело или его часть по п.1, где AILIM происходит от человека.3. Человеческое моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1 и 2, где антитело обладает активностью ингибирования передачи сигнала в клетку опосредуемого AILIM.4. Человеческое моноклональное антитело или его часть по п.3, где активность ингибирования передачи сигнала соответствует (а) или (b) из нижеследующих:

(a) активности ингибирования пролиферации AILIM-экспрессирующих клеток или

(b) активности ингибирования продукции цитокинов AILIM-экспрессирующими клетками.

(a) активность индукции пролиферации AILIM-экспрессирующих клеток или

(b) активность индукции продукции цитокинов AILIM-экспрессирующими клетками.

(a) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 20 до 117 последовательности SEQ ID NO: 28,

(b) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 20 до 117 последовательности SEQ ID NO: 28, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены,

(c) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 20 до 116 последовательности SEQ ID NO: 32,

(d) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 20 до 116 последовательности SEQ ID NO: 32, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены,

(e) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 20 до 116 последовательности SEQ ID NO: 36, или

(f) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 20 до 116 последовательности SEQ ID NO: 36, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены.

(a) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 20 до 470 последовательности SEQ ID NO: 28,

(b) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 20 до 470 последовательности SEQ ID NO: 28, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены,

(c) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 20 до 470 последовательности SEQ ID NO: 32,

(d) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 20 до 470 последовательности SEQ ID NO: 32, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены,

(e) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 20 до 470 последовательности SEQ ID NO: 36, или

(f) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 20 до 470 последовательности SEQ ID NO: 36, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены.

(a) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 23 до 116 последовательности SEQ ID NO: 30,

(b) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 23 до 116 последовательности SEQ ID NO: 30, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены,

(c) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 21 до 116 последовательности SEQ ID NO: 34,

(d) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 21 до 116 последовательности SEQ ID NO: 34, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены,

(e) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 21 до 116 последовательности SEQ ID NO: 38, или

(f) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 21 до 116 последовательности SEQ ID NO: 38, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены.

(a) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 23 до 236 последовательности SEQ ID NO: 30,

(b) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 23 до 236 последовательности SEQ ID NO: 30, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены,

(c) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 21 до 236 последовательности SEQ ID NO: 34,

(d) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 21 до 236 последовательности SEQ ID NO: 34, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены,

(e) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 21 до 236 последовательности SEQ ID NO: 38, или

(f) аминокислотная последовательность, включающая в себя аминокислотные остатки в положениях от 21 до 236 последовательности SEQ ID NO: 38, в которой один или более аминокислотных остатков делетированы или заменены или в которую один или более аминокислотных остатков вставлены или добавлены.

(a) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, включающую в себя последовательность аминокислотных остатков в положениях от 20 до 117 последовательности SEQ ID NO: 28 и

(b) вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, включающую в себя последовательность аминокислотных остатков в положениях от 23 до 116 последовательности SEQ ID NO: 30.

(a) полипептид тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность из аминокислотных остатков в положениях от 20 до 470 последовательности SEQ ID NO: 28, и

(b) полипептид легкой цепи имеет аминокислотную последовательность из аминокислотных остатков в положениях от 23 до 236 последовательности SEQ ID NO: 30.

(a) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность от аминокислоты 20 до 116 согласно последовательности SEQ ID NO: 32, и

(b) вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность от аминокислоты 21 до 116 согласно последовательности SEQ ID NO: 34.

(a) полипептид тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую последовательность аминокислотных остатков в положениях от 20 до 470 последовательности SEQ ID NO: 32, и

(b) полипептид легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую последовательность аминокислотных остатков в положениях от 21 до 236 последовательности SEQ ID NO: 34.

(a) вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую последовательность аминокислотных остатков в положениях от 20 до 116 последовательности SEQ ID NO: 36, и

(b) вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую последовательность аминокислотных остатков в положениях от 21 до 116 последовательности SEQ ID NO: 38.

(a) полипептид тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую последовательность аминокислотных остатков в положениях от 20 до 470 последовательности SEQ ID NO: 36, и

(b) полипептид легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, содержащую последовательность аминокислотных остатков в положениях от 21 до 236 последовательности SEQ ID NO: 38.

(a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислотных остатков в положениях от 20 до 117 последовательности SEQ ID NO: 28,

(b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислотных остатков в положениях от 20 до 116 последовательности SEQ ID NO: 32,

(c) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность аминокислотных остатков в положениях от 20 до 116 согласно последовательности SEQ ID NO: 36.

(a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислотных остатков в положении от 23 до 116 последовательности SEQ ID NO: 30,

(b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислотных остатков в положении от 21 до 116 согласно последовательности SEQ ID NO: 34, и

(c) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислотных остатков в положении от 21 до 116 последовательности SEQ ID NO: 38.

(a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислотных остатков в положении от 20 до 470 последовательности SEQ ID NO: 28,

(b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислотных остатков в положении от 20 до 470 последовательности SEQ ID NO: 34, и

(c) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислотных остатков в положении от 20 до 470 последовательности SEQ ID NO: 36.

(а) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислотных остатков в положении от 23 до 236 последовательности SEQ ID NO: 30,

(b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислотных остатков в положении от 21 до 236 последовательности SEQ ID NO: 34, и

(c) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из аминокислотных остатков в положении от 21 до 236 последовательности SEQ ID NO: 38.

(a) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 126 до 419 последовательности SEQ ID NO: 27,

(b) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 151 до 441 последовательности SEQ ID NO: 31, и

(c) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 153 до 443 согласно последовательности SEQ ID NO: 35.

(a) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 105 до 386 последовательности SEQ ID NO: 29,

(b) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 88 до 375 согласно последовательности SEQ ID NO: 33, и

(с) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 93 до 380 согласно последовательности SEQ ID NO: 37.

(a) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 69 до 1481 последовательности SEQ ID NO: 27,

(b) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 94 до 1506 последовательности SEQ ID NO: 31, и

(c) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 96 до 1508 последовательности SEQ ID NO: 35.

(a) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 39 до 749 последовательности SEQ ID NO: 29,

(b) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 28 до 738 последовательности SEQ ID NO: 33, и

(c) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 33 до 743 последовательности SEQ ID NO: 37.

(a) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 126 до 419 последовательности SEQ ID NO: 27,

(b) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 151 до 441 последовательности SEQ ID NO: 31, и

(c) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 153 до 443 последовательности SEQ ID NO: 35.

(a) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 105 до 386 последовательности SEQ ID NO: 29,

(b) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 88 до 375 последовательности SEQ ID NO: 33, и

(c) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 93 до 380 последовательности SEQ ID NO:37.

(a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 69 до 1481 последовательности SEQ ID NO: 27,

(b) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 94 до 1506 последовательности SEQ ID NO: 31, и

(c) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 96 до 1508 последовательности SEQ ID NO: 35.

(a) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 39 до 749 последовательности SEQ ID NO: 29,

(b) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 28 до 738 последовательности SEQ ID NO: 33, и

(c) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность из нуклеотидов в положении от 33 до 743 последовательности SEQ ID NO: 37.