СРЕДСТВА, ПОДАВЛЯЮЩИЕ ОТТОРЖЕНИЕ ТРАНСПЛАНТАТА Российский патент 2005 года по МПК A61K38/02 A61K39/395 A61K31/711 A61P37/06 

Область техники

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим вещество, которое обладает активностью модуляции биологической активности, «индуцируемой активацией лимфоцитарной иммуномодулирующей молекулы» (AILIM) (известной также как «индуцируемый совместный стимулятор» (ICOS), в частности модуляции трансдукции сигнала, опосредованного AILIM.

Конкретно, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим в себя вещество, которое обладает активностью модуляции (например, ингибирования) пролиферации клеток, экспрессирующих AILIM, или модуляции (например, ингибирования) продукции цитокина (например, интерферона-γ, или интерлейкина-4) клетками, экспрессирующими AILIM.

Более конкретно, настоящее изобретение относится (1) к фармацевтическим композициям для ингибирования, лечения или профилактики отторжения трансплантата (иммунологического отторжения), сопровождающего трансплантацию органа, его части или ткани; и (2) к фармацевтическим композициям для усиления ингибирующего, терапевтического или профилактического эффекта иммуносупрессорных агентов на отторжение трансплантата (иммунологическое отторжение), сопровождающее трансплантацию органа, его части или ткани.

Предшествующий уровень техники

Ввиду недавнего пересмотра законов по трансплантации органов в Японии было выполнено несколько трансплантаций органов от пациентов со смертью головного мозга. В одном случае такую выгоду получили от одного донора семь пациентов. В последующем ожидается увеличение количества трансплантаций органов.

С другой стороны, по оценкам, в Японии количество пациентов, пораженных тяжелыми сердечно-сосудистыми и другими заболеваниями, такими как заболевания печени (острая печеночная недостаточность, цирроз печени и т.д.), сердечные заболевания (тяжелая сердечная недостаточность, миокардиопатия, гипертрофия сердца и т.д.), почечные заболевания (почечная недостаточность, хронический гломерулонефрит, диабетическая нефропатия, пиелонефрит и т.д.), легочные заболевания (нарушение функции обоих легких и т.д.) и заболевания поджелудочной железы (лечение больных диабетом), у которых трансплантация органов жизненно важна для лечения, каждый год увеличивается приблизительно на 600 кардиологических пациентов, приблизительно на 3000 пациентов с заболеваниями печени и приблизительно на 500 пациентов с легочными заболеваниями. Хотя законодательные аспекты развиваются, отсутствие органов, которые можно трансплантировать, также является реально существующей в настоящий момент проблемой. Аналогичным образом, отсутствие органов является также серьезной проблемой в США, которые являются продвинутой страной с точки зрения трансплантации. В США приблизительно 4300 человек (1999 г.) ожидают трансплантации сердца и приблизительно 43000 человек (1999 г.) ожидают трансплантации почки. В действительности приблизительно 800 и приблизительно 2300 человек умирают ежегодно, не имея возможности получить соответственно трансплантаты сердца и почки.

Под трансплантацией ткани (такой как кожа, роговица и кость) или органа (такого как печень, сердце, почка, легкое и поджелудочная железа) подразумевают: (1) аутотрансплантацию (аутологичную трансплантацию), (2) изотрансплантацию, (3) аллотрансплантацию и (4) ксенотрансплантацию.

Аутотрансплантация относится к трансплантации части индивидуума в другую часть того же индивидуума и производится, например, в случае лечения ожога путем пересадки собственной здоровой кожи на пораженную область.

Изотрансплантация производится между гомогенными животными. У человека такая трансплантация производится между монозиготными близнецами (например, трансплантация одной из почек или печеночной ткани).

Аллотрансплантация производится между двумя различными индивидуумами, имеющими различный генетический фон, и у человека такая трансплантация производится между дизиготными близнецами или между индивидуумами, которые абсолютно не имеют кровного родства друг с другом.

Ксенотрансплантация производится между индивидуумами различных видов животных. Примером является случай, когда ткань или орган шимпанзе или свиньи пересаживается человеку.

Как указано выше, ожидается, что количество случаев аллотрансплантации от пациентов со смертью мозга увеличится вследствие разработки законодательства, относящегося к трансплантации органов. Однако для разрешения проблемы полного отсутствия органов, которые можно трансплантировать, в настоящее время активно проводятся различные исследования, направленные на практические виды применения ксенотрансплантации, более конкретно на трансплантацию человеку тканей или органов от не относящихся к человеку млекопитающих, таких как свинья.

Хотя и ожидается, что вопрос отсутствия трансплантируемых тканей и органов разрешится разработкой законов о смерти мозга и трансплантации и усовершенствованием методик ксенотрансплантации, существует другое крайне большое препятствие при лечении заболеваний путем аллотрансплантации и ксенотрансплантации. Более конкретно, препятствием является тяжелое иммунологическое отторжение (отторжение трансплантата) у реципиентов, которое происходит после трансплантации тканей или органов от доноров.

Отторжение трансплантата относится к различным иммунным реакциям, которые направлены на отторжение и уничтожение трансплантата (часть живого организма, которая трансплантирована, клетку, ткань или орган) от донора, чей генетический фон отличается от такового у реципиента (т.е. при аллотрансплантации или ксенотрансплантации), поскольку реципиент распознает трансплантат как инородное вещество. Иммунные реакции, которые сопровождают указанную трансплантацию, можно классифицировать на (1) сверхострое отторжение, которое представляет собой сильное отторжение, происходящее непосредственно после трансплантации; (2) острое отторжение, которое наблюдается в пределах нескольких месяцев после трансплантации; и (3) хроническое отторжение, наблюдаемое через несколько месяцев после трансплантации. Кроме того, хотя клеточный иммунитет благодаря иммунокомпетентным клеткам, представленным Т-клетками, и гуморальный иммунитет благодаря антителам происходит эндогенно координированным образом, основная реакция осуществляется клеточным иммунитетом.

В результате отторжения органа трансплантат в конечном итоге становится некротическим и отпадает. Кроме того, у реципиента развиваются не только системные симптомы, такие как лихорадка, лейкоцитоз и ощущение усталости, но также отек и болезненность в участке трансплантации. Кроме того, могут возникнуть тяжелые осложнения, такие как инфекции.

В частности, при трансплантации ксеногенного трансплантата, такого как трансплантат от свиньи, возникает серьезная проблема сверхострого отторжения, в результате которого трансплантат отторгается в пределах нескольких минут.

Для подавления иммунологического отторжения (отторжения трансплантата), сопровождающего такие трансплантации, применяется ограниченное число иммуносупрессорных средств, потому что иммунологическое отторжение, вызванное аллотрансплантацией, происходит главным образом вследствие клеточного иммунитета. Такие иммуносупрессорные средства включают в себя циклоспорин (CsA); такролимус (FK-506); азатиоприн (AZ); микофенолат мофетил (MMF); мизорибин (MZ); лефлуномид (LEF); адренокортикостероиды (также известные как гормоны коры надпочечников, кортикостероиды, кортикоиды), такие как преднизолон и метилпреднизолон; сиролимус (также известный как рапамицин); дезоксиспергуалин (DSG); и FTY720 (химическое название: 2-амино-2-[2-(4-октилфенил)этил]-1,3-пропандиол гидрохлорид).

CTLA4 и CD28, которые являются молекулами, ответственными за трансдукцию совместных стимулирующих сигналов, необходимых для активации Т-клеток (молекулы трансдукции совместных стимулирующих сигналов), и особенно препараты CTLA4, в которых используется растворимая область CTLA4 и кодирующий ее ген, также проходят клиническую разработку в качестве иммуносупрессорных средств.

С другой стороны, недавно, аналогично CTLA4 и CD28, которые являются молекулами, обеспечивающими трансдукцию совместных стимулирующих сигналов, была идентифицирована молекула, названная индуцируемой активацией лимфоцитарной иммуномодулирующей молекулой (AILIM; human, mouse, and rat; Int. Immunol., 12(1), p.51-55, 2000), называемой также индуцируемым совместным стимулятором (ICOS; human; Nature, 397 (6716), р.263-266, 1999); J. Immunol., 166(1), p.1, 2001; J. Immonol., 165(9), р.5035, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun., 276(1), р.335, 2000; Immunity, 13(1), р.95, 2000; J. Exp. MecL, 192(1), р.53, 2000; Eur. J. Immunol., 30(4), р.1040, 2000), в качестве третьей молекулы, преобразующей совместные стимулирующие сигналы, которая преобразует второй сигнал (совместно стимулирующий сигнал), необходимый для активации лимфоцитов, таких как Т-клетки, и сопряжена с сигналом, регулирует функцию активированных лимфоцитов, таких как активированные Т-клетки.

На основании данных недавно проведенных исследований, относящихся к указанной молекуле, прогнозируется, что молекула AILIM, возможно, участвует в развитии различных заболеваний (например, аутоиммунных заболеваний, аллергических состояний и воспалений), вызванных активацией иммунокомпетентных клеток, таких как Т-клетки (в частности, Т-лимфоциты). Однако пока нет сообщений о связи между функциональной модуляцией молекулы AILIM и отторжением трансплантата (иммунологическим отторжением), сопровождающим трансплантацию тканей или органов, а также о попытках подавления, лечения или профилактики таких реакций отторжения, сопровождающих трансплантацию тканей или органов, путем модуляции активности молекулы AILIM.

Кроме того, совсем недавно была идентифицирована новая молекула, названная B7h, B7RP-1, GL50 или LICOS, которая, как считают, является лигандом, взаимодействующим с молекулой трансдукции совместного стимулирующего сигнала AILIM (Nature, Vol.402, №6763, pp.827-832, 1999; Nature Medicine, Vol.5, №12, pp.1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol.164, pp.1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol.10, №6, pp.333-336, 2000).

В результате идентификации указанных двух видов новых молекул, а именно AILIM (ICOS) и B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS), было выявлено, что в дополнение к известным первому и второму путям трансдукции сигналов между CD28 и CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2) и между CTLA4 и CD80 (B7-1)/CD 86 (B7-2) имеется новый третий путь трансдукции совместного стимулирующего сигнала, который существенен для указанной выше активации лимфоцитов, таких как Т-клетки, и регуляции функции активированных Т-клеток, которая функционирует посредством взаимодействия между AILIM (ICOS) и B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS).

Проводятся тщательные исследования биологических функций указанных новых молекул, регуляции данными молекулами функций лимфоцитов, таких как Т-клетки, через третью трансдукцию совместного стимулирующего сигнала данными молекулами и связи между новой трансдукцией сигналов и заболеваниями.

Описание изобретения

Более конкретно, целью настоящего изобретения является предоставление способов и фармацевтических средств, которые подавляют, лечат или предотвращают иммунологическое отторжение (отторжение трансплантата), сопровождающее трансплантацию ткани или органа (аллотрансплантацию или ксенотрансплантацию), путем применения медицинских и фармацевтических методик (например, фармацевтических агентов, таких как соединения с низкой молекулярной массой, и антител) для модуляции биологической функции новой молекулы, AILIM, которая, как считают, трансдуцирует второй сигнал (совместно стимулирующий сигнал), необходимый для активации лимфоцитов, таких как Т-клетки, и сопряжена с сигналом, модулирует функцию активированных лимфоцитов, таких как активированные Т-клетки.

Другой целью является предоставление способов усиления супрессорного эффекта на отторжение трансплантата существующими иммуносупрессорными средствами (циклоспорином, азатиоприном, адренокортикостероидами, FK-506 и т.д.) с использованием таких фармацевтических средств, которые модулируют биологическую функцию AILIM (например, таких фармацевтических средств как соединения с низкой молекулярной массой и антитела).

В результате тщательных исследований биологической функции AILIM млекопитающих и способа подавления иммунологического отторжения (отторжения трансплантата), которое представляет собой серьезную проблему, сопровождающую трансплантацию (аллотрансплантацию или ксенотрансплантацию) трансплантатов (клеток, ткани или органа), авторы настоящего изобретения обнаружили, что (1) фармацевтические агенты, которые модулируют функцию AILIM, значимо подавляют иммунологическое отторжение (отторжение трансплантата), сопровождающее трансплантацию ткани (тканей) или органа (органов), и (2) супрессорный эффект существующих иммуносупрессорных агентов на отторжение трансплантата усиливается при использовании фармацевтических средств, которые модулируют функцию AILIM; и в результате было оформлено настоящее изобретение.

Фармацевтическая композиция согласно изобретению может применяться в качестве лекарственного средства для модуляции различных реакций in vivo, в которые вовлечена трансдукция совместно стимулирующего сигнала к клеткам, экспрессирующим AILIM, опосредуемая AILIM (например, пролиферации клеток, экспрессирующих AILIM, продукции цитокина (цитокинов) клетками, экспрессирующими AILIM, иммунного цитолиза или апоптоза клеток, экспрессирующих AILIM, и активности для индукции зависимой от антител клеточной цитотоксичности против клеток, экспрессирующих AILIM), и/или в качестве лекарственного средства для профилактики начала и/или прогрессирования различных заболеваний, которые связаны с трансдукцией сигналов, опосредованной AILIM, и для лечения или профилактики таких заболеваний.

В частности, фармацевтическая композиция согласно изобретению может модулировать (подавлять или стимулировать) пролиферацию клеток, экспрессирующих AILIM, или может модулировать (подавлять или стимулировать) продукцию цитокинов (например, интерферона-γ или интерлейкина-4) клетками, экспрессирующими AILIM, и может предотвращать различные патологические состояния, запускаемые различными физиологическими феноменами, при которых вовлечена трансдукция сигналов, опосредованная AILIM, и обеспечивает возможность лечения или профилактики различных заболеваний.

Применение фармацевтической композиции согласно изобретению обеспечивает возможность подавления, профилактики и/или лечения иммунологического отторжения (отторжения трансплантата), которое является серьезной проблемой при тех видах лечения, при которых орган (печень, сердце, легкое, почка, поджелудочная железа и т.д.), его часть или ткань (такая как кожа, роговица и кость) от донора трансплантируется (аллотрансплантируется или ксенотрансплантируется) реципиенту, пораженному тяжелым сердечно-сосудистым заболеванием.

Кроме того, применение фармацевтической композиции согласно изобретению обеспечивает возможность усиления подавляющего отторжение трансплантата эффекта существующих иммуносупрессорных средств, вводимых для подавления иммунологического отторжения при таких видах лечения путем трансплантации.

Более конкретно, настоящие изобретения включают в себя следующее:

(1) Фармацевтическую композицию для подавления, лечения или предотвращения отторжения трансплантата, сопровождающего трансплантацию органа, его части или ткани, причем указанная композиция включает в себя вещество, обладающее активностью модуляции трансдукции сигнала, опосредованной AILIM, и фармацевтически приемлемый носитель.

(2) Фармацевтическую композицию для усиления эффекта одного или нескольких иммуносупрессорных средств для подавления, лечения или предотвращения отторжения трансплантата, сопровождающего трансплантацию органа, его части или ткани, причем указанная композиция включает в себя вещество, обладающее активностью модуляции трансдукции сигнала, опосредованной AILIM, и фармацевтически приемлемый носитель.

(3) Фармацевтическую композицию по п.(2), в которой указанное иммуносупрессорное средство представляет собой одно или несколько терапевтических средств, выбранных из группы, состоящей из азатиоприна, адренокортикостероида, циклоспорина, мизорибина и тикролимуса (FK-506), микофенолата мофетила, лефлуномида, сиролимуса, деоксиспергулина, FTY720 и препарата CTLA4.

(4) Фармацевтическую композицию по любому из пп.(1)-(3), причем указанная трансплантация представляет собой аллотрансплантацию.

(5) Фармацевтическую композицию по любому из пп.(1)-(3), причем указанная трансплантация представляет собой ксенотрансплантацию.

(6) Фармацевтическую композицию по любому из пп.(1)-(5), причем указанный орган представляет собой печень, сердце, почку, легкое или поджелудочную железу.

(7) Фармацевтическую композицию по любому из пп.(1)-(5), причем указанная ткань представляет собой кожу, роговицу или костную ткань.

(8) Фармацевтическую композицию по любому из пп.(1)-(7), в которой указанное вещество представляет собой белковое вещество.

(9) Фармацевтическую композицию по п. (8), причем указанное белковое вещество выбрано из группы, состоящей из

a) антитела, которое связывается с AILIM, или части указанного антитела;

b) полипептида, содержащего целиком или частично внеклеточную область AILIM;

c) гибридного полипептида, содержащего целиком или частично внеклеточную область AILIM и целиком или частично константную область тяжелой цепи иммуноглобулина; и

а) полипептида, который связывается с AILIM.

(10) Фармацевтическую композицию по любому из пп.(1)-(7), в которой указанное вещество представляет собой небелковое вещество.

(11) Фармацевтическую композицию по п.(10), причем указанное небелковое вещество представляет собой ДНК, РНК или химически синтезированное соединение.

Настоящие изобретения подробно описаны ниже с введением определений терминов и способов получения веществ, применяемых в данном изобретении.

В данном описании термин «млекопитающее» означает человека, корову, козу, кролика, мышь, крысу, хомяка и морскую свинку; предпочтительным является человек, корова, крыса, мышь или хомяк, а особенно предпочтительным является человек.

"AILIM" согласно изобретению представляет собой аббревиатуру «индуцируемая активацией лимфоцитарная иммуномодулирующая молекула» и означает молекулу поверхности клетки млекопитающего, имеющую структуру и функцию, описанные в предыдущих сообщениях (J. Immunol., 166 (1), p.1, 2001; J. Immunol., 165 (9), р.5035, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun., 276 (1), p.335, 2000; Immunity, 13(1), р.95, 2000; J. Exp. Med., 192 (1), р.53, 2000; Eur. J. Immunol., 30 (4), р.1040, 2000; Int. Immunol., 12 (1), р.51, 2000; Nature, 397 (6716), р.263, 1999; GenBank Accesion Number: BAA82129 (человек); ВАА82128 (крыса); ВАА82127 (крысиный вариант); ВАА82126 (мышь)).

Особенно предпочтительно термин означает AILIM, полученную у человека (например, International Immunology, Vol.12, №1, р.51-55, 2000).

Указанная AILIM также называется ICOS (Nature, Vol.397, №6716, р.263-266, 1999) или антиген JTT-1/антиген JTT-2 (не прошедшая экспертизу опубликованная заявка на патент Японии №(JP-A) Hei 11-29599, Международная патентная заявка №WO98/38216), и указанные названия молекул взаимозаменяемы и относятся к одной и той же молекуле.

Кроме того, "AILIM", на которую имеются ссылки в данном изобретении, включает в себя полипептид, имеющий аминокислотные последовательности AILIM от каждого млекопитающего, описанные в ранее опубликованных литературных источниках, а особенно предпочтительно также полипептид, имеющий по существу такую же аминокислотную последовательность, что и последовательность человеческой AILIM. Более того, варианты человеческой AILIM, аналогичные ранее идентифицированному варианту AILIM, полученному у крысы (GenBank Accesion Number: BAA82127), также включены в термин "AILIM" согласно изобретению.

В настоящем описании выражение «имеющий по существу такую же аминокислотную последовательность» означает, что "AILIM" согласно изобретению включает в себя полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, в которой множественные аминокислоты, предпочтительно от 1 до 10 аминокислот, особенно предпочтительно от 1 до 5 аминокислот, были замещены, подвергнуты делеции и/или модифицированы, и полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, в которой множественные аминокислоты, предпочтительно от 1 до 10 аминокислот, особенно предпочтительно от 1 до 5 аминокислот, были добавлены, пока полипептиды имеют по существу такие же биологические свойства, как и полипептид, включающий в себя аминокислотную последовательность, показанную в предыдущих сообщениях.

Такие замены, делеции или инсерции аминокислот могут быть достигнуты в соответствии с обычным способом (Experimental Medicine: SUPPLEMENT, "Handbook of Genetic Engineering" (1992), и т.д.).

Примерами являются синтетический олигонуклеотид с сайт-направленным мутагенезом (дуплексный способ с гэпами), точковый мутагенез, посредством которого точковую мутацию вводят случайным методом путем обработки нитритом или сульфитом, способ, при котором делеционный мутант получают с помощью фермента Ва131 и т.д., кассетный мутагенез, способ сканирования линкера, способ ошибки включения, способ затравки ошибочного спаривания оснований, способ синтеза сегмента ДНК и т.д.

Синтетический олигонуклеотид с сайт-направленным мутагенезом (дуплексный способ с гэпами) можно осуществить, например, следующим образом. Область, которую желают подвергнуть мутагенезу, клонируют в вектор фага М13, имеющий амбер-мутацию, для получения одноцепочечной ДНК фага. Затем RF I ДНК вектора М13, не имеющую амбер-мутации, линеаризуют путем обработки рестриктазой, ДНК смешивают с указанной выше одноцепочечной ДНК фага, денатурируют и подвергают отжигу, посредством этого формируя «дуплексную ДНК с гэпами». Синтетический олигонуклеотид, в который вводят мутации, гибридизируют с дуплексной ДНК с гэпами, и закрытую кольцевую двунитевую ДНК получают, обеспечивая реакцию с ДНК-полимеразой и ДНК-лигазой. Клетки Е. coli mutS с недостаточной репаративной активностью ошибочного спаривания трансфицируют указанной ДНК. Клетки Е. coli, не обладающие супрессорной активностью, инфицируют выращенными фагами и проводят скрининг только фагов, не имеющих амбер-мутаций.

В способе, которым вводится точечная мутация нитратом, используют, например, принцип, как указано ниже. Если ДНК обрабатывают нитритом, нуклеотиды дезаминируются, в результате чего аденин превращается в гипоксантин, цитозин - в урацил, а гуанин - в ксантин. Если дезаминированная ДНК вводится в клетки, "А:Т" и "G:C" замещаются соответственно "G:C" и "А:Т", потому что основания гипоксантина, урацила и ксантина спариваются соответственно с цитозином, аденином и тимином при репликации ДНК. Действительно, фрагменты одноцепочечной ДНК, обработанные нитритом, гибридизируются с «дуплексной ДНК с гэпами», а затем мутантные штаммы отделяют путем манипулирования таким же образом, как при получении синтетического олигонуклеотида с сайт-направленным мутагенезом (дуплексный способ с гэпами).

Термин «цитокин», как во фразе «продукция цитокина клетками, экспрессирующими AILIM», в настоящем изобретении означает произвольный цитокин, продуцируемый клетками, экспрессирующими AILIM» (в частности, Т-клетками).

Примерами Т-клеток являются Т-клетки типа Th1 и типа Th2, a цитокин согласно изобретению, в частности, означает цитокин, продуцируемый Т-клетками типа Тh1 и/или произвольный цитокин, продуцируемый Т-клетками типа Th2.

Цитокины, продуцируемые Т-клетками типа Th1, включают в себя IFN-γ, IL-2, TNF, IL-3, а цитокины, продуцируемые Т-клетками типа Th2, включают в себя IL-3, IL-4, IL-5, IL-10 и TNF (Cell, Vol.30, №9, pp.343-346, 1998).

Термин «вещество», используемый в настоящем изобретении, конкретно «вещество, обладающее активностью модуляции трансдукции сигнала, опосредованной AILIM», а конкретнее «вещество, обладающее активностью ингибирования пролиферации клеток, экспрессирующих AILIM, или ингибирования продукции цитокина клетками, экспрессирующими AILIM», означает естественно встречающееся вещество или произвольное искусственно полученное вещество.

Здесь выражение «трансдукция сигнала, опосредованная AILIM» означает трансдукцию сигнала через AILIM, ведущую к изменению любого фенотипа описанных выше клеток, экспрессирующих AILIM, или в следующих примерах (изменение клеточной пролиферации, активации клеток, инактивации клеток, апоптоэа и/или способности продуцировать произвольный цитокин из клеток, экспрессирующих AILIM).

«Вещество» можно главным образом классифицировать на «белковое вещество» и «небелковое вещество».

Примеры «белковых веществ» следующие: полипептиды, антитела (поликлональные антитела, моноклональные антитела или части моноклональных антител).

Когда вещество представляет собой антитело, оно предпочтительно является моноклональным антителом. Когда вещество представляет собой моноклональное антитело, оно включает в себя не только моноклональные антитела, полученные у млекопитающего, не являющегося человеком, но также следующие рекомбинантные химерные моноклональные антитела, рекомбинантные гуманизированные моноклональные антитела и человеческие моноклональные антитела.

Когда вещество представляет собой полипептид, оно включает в себя следующие полипептиды, фрагменты полипептидов (олигопептиды), гибридные полипептиды и химически модифицированные полипептиды. Примерами олигопептидов являются пептиды, включающие в себя от 5 до 30 аминокислот, предпочтительно от 5 до 20 аминокислот. Химическую модификацию можно конструировать в зависимости от различных целей, например для увеличения периода полужизни в крови в случае введения in vivo, или для увеличения устойчивости против распада, или для увеличения всасывания в пищеварительном тракте при пероральном введении.

Примеры полипептидов следующие:

(1) Полипептид, содержащий полностью или частично внеклеточную область AILIM;

(2) Гибридный полипептид, содержащий полностью или частично внеклеточную область AILIM и полностью или частично константную область тяжелой цепи иммуноглобулина; или

(3) Полипептид, который связывается с AILIM.

Примерами «небелковых веществ» являются ДНК, РНК и химически синтезированные соединения.

Здесь «ДНК» означает «ДНК, которую можно применять в качестве препарата антисмысловой ДНК, включающего в себя частичную нуклеотидную последовательность ДНК, кодирующую указанную выше AILIM (предпочтительно человеческую AILIM), или ее химически модифицированную ДНК, которая может быть сконструирована на основе ДНК (кДНК или геномной ДНК), кодирующей AILIM». Конкретно, антисмысловая ДНК может ингибировать транскрипцию ДНК, кодирующей AILIM, в мРНК, или трансляцию мРНК в белок путем гибридизации с ДНК или РНК, кодирующей AILIM.

Используемая здесь фраза «частичная нуклеотидная последовательность» относится к частичной нуклеотидной последовательности, содержащей произвольное число нуклеотидов в произвольной области. Частичная нуклеотидная последовательность содержит от 5 до 100 последовательных нуклеотидов, предпочтительно от 5 до 70 последовательных нуклеотидов, предпочтительнее - от 5 до 50 последовательных нуклеотидов, а еще предпочтительнее - от 5 до 30 последовательных нуклеотидов.

Когда ДНК используют в качестве препарата антисмысловой ДНК, последовательность ДНК может быть химически частично модифицирована для продления периода полужизни (устойчивости) в крови, когда ДНК вводят пациентам, для увеличения способности проникновения ДНК через внутрицитоплазматическую мембрану или для увеличения устойчивости к разрушению или всасывания перорально введенной ДНК в пищеварительных органах. Химические модификации включают в себя, например, модификацию фосфатной связи, рибозы, нуклеотида, сахарного фрагмента и 3'-конца и/или 5'-конца в структуре ДНК олигонуклеотида.

Модификации фосфатных связей включают в себя, например, превращение одной или нескольких связей в фосфодиэфирные связи (D-олиго), фосфоротиоатные связи, фосфородитиоатные связи (S-олиго), метилфосфатные (МР-олиго) связи, фосфороамидатные связи, нефосфатные связи или метилфосфонотиоатные связи или их комбинации. Модификация рибозы включает в себя, например, превращение в 2'-фторрибозу или 2'-O-метилрибозу. Модификация нуклеотида включает в себя, например, превращение в 5-пропинилурацил или 2-аминоаденин.

Здесь «РНК» означает «РНК, которую можно использовать в качестве препарата антисмысловой РНК, содержащей частичную нуклеотидную последовательность РНК, кодирующей указанную выше AILIM (предпочтительно человеческую AILIM}, или ее химически модифицированную РНК, которая может быть сконструирована на основе РНК, кодирующей AILIM». Антисмысловая РНК может ингибировать транскрипцию ДНК, кодирующей AILIM, в мРНК или трансляцию мРНК в белок путем гибридизации с ДНК или РНК, кодирующие AILIM.

Используемая здесь фраза «частичная нуклеотидная последовательность» относится к частичной нуклеотидной последовательности, включающей в себя произвольное число нуклеотидов в произвольной области. Частичная нуклеотидная последовательность содержит от 5 до 100 последовательных нуклеотидов, предпочтительно от 5 до 70 последовательных нуклеотидов, предпочтительнее - от 5 до 50 последовательных нуклеотидов, а еще предпочтительнее - от 5 до 30 последовательных нуклеотидов.

Последовательность антисмысловой РНК может быть химически частично модифицирована для продления периода полужизни в крови, когда РНК вводят пациентам, для увеличения способности проникновения РНК через внутрицитоплазматическую мембрану или для увеличения устойчивости к разрушению или всасывания перорально введенной РНК в пищеварительных органах. Химические модификации включают в себя такие модификации как модификации, которые относятся к указанной выше антисмысловой ДНК.

Примерами «химически синтезированного соединения» являются произвольные соединения, за исключением указанной выше ДНК, РНК и белковые вещества, имеющие молекулярную массу примерно от 100 до 1000 или менее, предпочтительно соединение, имеющее молекулярную массу примерно от 100 до 800, а предпочтительнее - молекулярную массу примерно от 100 до 600.

Термин «полипептид», включенный в определение указанного выше «вещества», означает часть (фрагмент) полипептидной цепи, составляющей AILIM (предпочтительно человеческую AILIM), предпочтительно всю или часть внеклеточной области полипептида, составляющего AILIM (от 1 до 5 аминокислот могут быть необязательно добавлены в N-концевую и/или С-концевую области).

AILIM в соответствии с настоящим изобретением представляет собой трансмембранную молекулу, проникающую через клеточную мембрану и содержащую 1 или 2 полипептидные цепи.

В настоящем описании «трансмембранный белок» означает белок, который соединен с клеточной мембраной посредством гидрофобной области пептида, который «прошивает» липидную двухслойную мембрану один или несколько раз, и структура которого в целом состоит из трех основных областей, то есть внеклеточной области, трансмембранной области и цитоплазматической области, как и во многих рецепторах или молекулах клеточной поверхности. Такой трансмембранный белок составляет каждый рецептор или молекулу клеточной поверхности в виде мономера или в виде гомодимера, гетеродимера или олигомера, сопряженного с одной или несколькими цепями, имеющими такую же или другую аминокислотную последовательность(и).

Здесь «внеклеточная область» означает всю или часть частичной структуры (частичная область) всей структуры упомянутого выше трансмембранного белка, где частичная структура существует снаружи мембраны. Другими словами, она означает всю или часть области трансмембранного белка, за исключением области, включенной в мембрану (трансмембранной области), и области, существующей в цитоплазме, следующей за трансмембранной областью (цитоплазматическая область).

«Гибридный полипептид», включенный в упомянутые выше «белковые вещества», означает гибридный полипептид, включающий в себя всю или часть внеклеточной области полипептида, составляющего AILIM (предпочтительно человеческую AILIM), и «всю или часть константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (Ig, предпочтительно человеческого Ig)≫. Предпочтительно гибридный полипептид представляет собой гибридный полипептид, имеющий внеклеточную область AILIM и часть константной области тяжелой цепи человеческого IgG, и особенно предпочтительно гибридный полипептид внеклеточной области AILIM и области (Fc) тяжелой цепи человеческого IgG, включающей в себя шарнир, домен С_H2 и домен С_H3. В качестве IgG предпочтителен IgG1, а в качестве AILIM предпочтительна человеческая, мышиная или крысиная AILIM (предпочтительно человеческая).

Используемое здесь выражение «вся или часть константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (Ig)» означает константную область или область Fc тяжелой цепи полученного у человека иммуноглобулина (Н-цепи) или ее часть. Иммуноглобулин может представлять собой любой иммуноглобулин, относящийся к любому классу и любому подклассу. В частности, иммуноглобулин включает в себя иммуноглобулины IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4), IgM, иммуноглобулины IgA (IgA1 и IgA2), IgD и IgE. Предпочтительно иммуноглобулин представляет собой IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) или IgM. Примеры особенно предпочтительных иммуноглобулинов согласно изобретению представляют собой те, которые относятся к IgG, полученным у человека (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4).

Иммуноглобулин имеет Y-образную структурную единицу, в которой четыре цепи составлены из двух гомологичных легких цепей (L-цепей), а две гомологичные тяжелые цепи (Н-цепи) соединены посредством дисульфидных связей (связей S-S). Легкая цепь составлена из вариабельной области (V_L) легкой цепи и константной области (С_L) легкой цепи. Тяжелая цепь составлена из вариабельной области (V_H) тяжелой цепи и константной области (С_H) тяжелой цепи.

Константная область тяжелой цепи составлена из некоторых доменов, имеющих аминокислотные последовательности, уникальные для каждого класса (IgG, IgM, IgA, IgD и IgE) и каждого подкласса (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgA1 и IgA2).

Тяжелая цепь иммуноглобулинов G ((IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) составлена из V_H, домена С_H1, шарнира, домена С_H2 и домена С_H3 в данном порядке от N-конца.

Аналогичным образом тяжелая цепь IgG1 составлена из V_H, домена Cγ₁l, шарнира, домена Cγ₁2 и домена Cγ₁3 в данном порядке от N-конца. Тяжелая цепь IgG2 составлена из V_H, домена Cγ₂l, шарнира, домена Cγ₂2 и домена Сγ₂3 в данном порядке от N-конца. Тяжелая цепь IgG3 составлена из V_H, домена Сγ₃1, шарнира, домена Сγ₃2 и домена Сγ₃3 в данном порядке от N-конца. Тяжелая цепь IgG4 составлена из V_H, домена Cγ₄1, шарнира, домена Сγ₄2 и домена Сγ₄3 в данном порядке от N-конца.

Тяжелая цепь IgA составлена из V_H, домена Cα1, шарнира, домена Сα2 и домена Сα3 в данном порядке от N-конца.

Аналогичным образом, тяжелая цепь IgA1 составлена из V_H, домена Cα₁l, шарнира, домена Cα₁2 и домена Cα₁3 в данном порядке от N-конца. Тяжелая цепь IgA2 составлена из V_H, домена Cα₂1, шарнира, домена Сα₂2 и домена Сα₂3 в данном порядке от N-конца.

Тяжелая цепь IgD составлена из V_H, домена Сδ1, шарнира, домена Сδ2 и домена Сδ3 в данном порядке от N-конца.

Тяжелая цепь IgM составлена из V_H, домена Сμ1, домена Сμ2, домена Сμ3 и домена Сμ4 в данном порядке от N-конца и не имеет шарнира, как видно у IgG, IgA и IgD.

Тяжелая цепь IgE составлена из V_H, домена Сε1, домена Сε2, домена Сε3 и домена Сε4 в данном порядке от N-конца и не имеет шарнира, как видно у IgG, IgA и IgD.

Если, например, IgG обработан папаином, он расщепляется на слегка N-концевой стороне вне дисульфидных связей, находящихся в шарнире, где дисульфидные связи соединяют две тяжелых цепи для генерирования двух гомологичных Fab-фрагментов, где фрагмент тяжелой цепи, составленный из V_H и С_H1, соединен с одной легкой цепью посредством дисульфидной связи; и один Fc, в котором два гомологичных фрагмента тяжелой цепи, составленные из шарнира, домена С_H2 и домена С_H3, соединены посредством дисульфидных связей (см. "Immunology Illustrated", original 2nd ed., Nankodo, pp.65-75 (1992); и "Focus of Newest Medical Science 'Recognition Mechanism of Immune System'", Nankodo, pp.4-7 (1991); и т д.).

Конкретно, «часть константной области тяжелой цепи иммуноглобулина», упомянутая выше, означает часть константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, имеющую структурные характеристики, как упомянуто выше, а предпочтительно представляет собой константную область без домена С1 или области Fc. В частности, примером ее является область, составленная из шарнира, домена С2 и домена С3 каждого из IgG, IgA и IgD или представляет собой область, составленную из домена С2, домена С3 и домена С4 каждого из IgM и IgE. Особенно предпочтительным примером ее является область Fc IgG1, полученного у человека.

Упомянутый выше гибридный полипептид имеет преимущество возможности его крайне легкой очистки с применением аффинной колоночной хроматографии с использованием свойства белка А, который специфично связывается с фрагментом иммуноглобулина, потому что гибридный полипептид согласно изобретению имеет часть константной области (например, Fc) иммуноглобулина, такого как IgG, как упомянуто выше, в качестве партнера гибридизации. Более того, поскольку имеются различные антитела против Fc различных иммуноглобулинов, иммунный анализ для выявления гибридных полипептидов можно легко выполнить с антителами против Fc.

«Полипептид, который связывается с AILIM» охватывается понятием «полипептид», включенным в определение указанного выше «вещества».

Конкретным примером «полипептида, который связывается с AILIM», является весь полипептид или его часть, включающий известную молекулу, называемую B7h, B7RP-1, GL50 или LICOS, которая представляет собой лиганд, взаимодействующий с AILIM (Nature, Vol.402, №6763, pp.827-832, 1999; Nature Medicine, Vol.5, №12, pp.1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol.164, pp.1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol.10 №6, pp.333-336, 2000).

Предпочтительно полипептид представляет собой полипептид, включающий всю или часть внеклеточной области указанных выше лигандов (B7h, B7RP-1, GL50, LICOS), или гибридный полипептид, включающий полипептид и всю или часть константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (предпочтительно человеческого иммуноглобулина). Здесь выражение «внеклеточная область» и «константная область тяжелой цепи иммуноглобулина» имеют то же значение, которое указано выше.

Указанные выше полипептиды, части полипептида (фрагмент) и гибридные полипептиды могут быть получены не только с использованием технологии рекомбинантной ДНК, как указано ниже, но также способом, хорошо известным в данной области, таким как способ химического синтеза или способ клеточной культуры, или его модифицированный способ.

«Антитело» согласно изобретению может представлять собой поликлональное антитело (антисыворотку) или моноклональное антитело против определенной выше AILIM млекопитающих (особенно предпочтительно, человеческой AILIM), а предпочтительно моноклональное антитело.

В частности, антитело представляет собой антитело, обладающее активностью ингибирования пролиферации клеток, экспрессирующих AILIM, путем связывания с AILIM, или активностью ингибирования продукции интерферона-γ или интерлейкина-4 клетками, экспрессирующими AILIM, посредством связывания с AILIM.

Антитела согласно изобретению могут представлять собой природные антитела, полученные в результате иммунизации млекопитающих, таких как мыши, крысы, хомяки, морские свинки и кролики, антигеном, таким как клетки (природные клетки, клеточные линии, опухолевые клетки и т.д.), экспрессирующие AILIM согласно изобретению, трансформанты, полученные с использованием технологии рекомбинантной ДНК, с тем, чтобы избыточно экспрессировать AILIM на их поверхности, полипептиды, составляющие AILIM, или указанные выше гибридные полипептиды, включающие в себя полипептид AILIM или внеклеточную область AILIM. Антитела согласно изобретению также включают в себя химерные антитела и гуманизированные антитела (CDR-трансплантированные антитела), которые могут быть получены с помощью технологии рекомбинантной ДНК, и человеческие антитела, которые могут быть получены с использованием трансгенных животных, вырабатывающих человеческие антитела.

Моноклональные антитела включают в себя антитела, имеющие любой из изотипов IgG, IgM, IgA, IgD или IgE. Предпочтителен IgM.

Поликлональное антитело (антисыворотки) или моноклональное антитело может быть получено известными способами. А именно млекопитающее, предпочтительно мышь, крысу, хомяка, морскую свинку, кролика, кошку, собаку, свинью, козу, лошадь или корову, или более предпочтительно мышь, крысу, хомяка, морскую свинку или кролика иммунизируют, например, указанным выше антигеном, если необходимо, с адъювантом Фрейнда.

Поликлональное антитело может быть получено из сыворотки, полученной от иммунизированного таким образом животного. Кроме того, моноклональные антитела получают следующим образом. Получают гибридомы из вырабатывающих антитела клеток, полученных у иммунизированного таким образом животного, и клетки миеломы, которые не способны вырабатывать антитела. Гибридомы клонируют и проводят скрининг для выявления клонов, продуцирующих моноклональные антитела, которые проявляют специфический аффинитет к антигену, использованному для иммунизации млекопитающего.

В частности, моноклональное антитело можно получить следующим образом. Иммунизации выполняют путем однократной или повторной инъекции или имплантации указанного выше антигена в качестве иммуногена, если необходимо, с адъювантом Фрейнда, подкожно, внутримышечно, внутривенно, через подушечку лапы или внутрибрюшинно млекопитающему, кроме человека, в частности мыши, крысе, хомяку, морской свинке или кролику, предпочтительно мыши, крысе или хомяку (включая трансгенное животное, генерированное с тем, чтобы выбрабатывать антитела, полученные от другого животного, такого как указанную ниже трансгенную мышь, продуцирующую человеческие антитела). Обычно иммунизацию выполняют от одного до четырех раз через каждые 1-14 дней после первой иммунизации. Клетки, продуцирующие антитела, получают от иммунизированного таким образом млекопитающего приблизительно через 1-5 дней после последней иммунизации. Частоту и интервал между иммунизациями можно соответствующим образом подобрать в зависимости, например, от свойства используемого иммуногена.

Гибридомы, которые секретируют моноклональное антитело, могут быть получены способом Кőhler и Molstein (Nature, Vol.256, pp.495-497 (1975)) или его модифицированным способом. А именно гибридомы получают путем гибридизации продуцирующих антитела клеток, содержащихся в селезенке, лимфоузлах, костном мозге или небных миндалинах, полученных у млекопитающего, кроме человека, иммунизированного, как указано выше, предпочтительно в селезенке, с клетками миеломы без способности продуцировать аутоантитела, которые получены предпочтительно у млекопитающего, такого как мышь, крыса, морская свинка, хомяк, кролик или человек, или предпочтительнее у мыши, крысы или человека.

Например, полученная у мышей миелома P3/X63-AG8.653 (653), P3/NSI/1-Ag4-1 (NS-1), P3/X63-Ag8.U1 (P3U1), SP2/0-Ag14 (Sp2/0, Sp2), PAI, FO, NSO или BW5147, полученная у крыс миелома 210RCY3-Ag.2.3. или полученная у человека миелома U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 или СЕМ-Т15 могут использоваться в качестве миеломы для слияния клеток.

Скрининг для выявления продуцирующих моноклональные антитела гибридом можно проводить при культивировании гибридом, например, в микротитровочных планшетах, путем измерения реактивности надосадочной жидкости культуры в лунках, в которых наблюдается рост гибридомы, в отношении указанного выше иммуногена, используемого для иммунизации, например, с использованием ферментного иммунного анализа, такого как радиоиммунный анализ (RIA) и иммуноферментый анализ (ELISA).

Моноклональные антитела могут быть получены из гибридом путем культивирования гибридом in vitro или in vivo, как, например, в асцитической жидкости мыши, крысы, морской свинки, хомяка или кролика, предпочтительно мыши или крысы, предпочтительнее мыши, и выделения антител из полученной надосадочной жидкости культуры или асцитной жидкости млекопитающего.

Культивирование гибридом in vitro может выполняться в зависимости, например, от свойства клеток, культивирование которых предполагается, цели исследования и различных условий способа культивирования - использования известных питательных сред или любой питательной среды, полученной из известной базовой среды для выращивания, поддержания и хранения гибридом для продукции моноклональных антител в надосадочной жидкости культуры.

Примерами базовых сред являются такие среды с низкой концентрацией кальция как среда Ham'F12, среда MCDB152 или среда MEM с низкой концентрацией кальция, и среды с высокой концентрацией кальция, такие как среда MCDB104, среда MEM, среда D-MEM, среда RPMI1640, среда ASF104 или среда RD. Базовая среда может содержать, например, сыворотки, гормоны, цитокины и/или различные неорганические и органические вещества, в зависимости от цели.

Моноклональные антитела могут быть выделены и очищены из указанных выше надосадочной жидкости культуры или асцитной жидкости путем осаждения насыщенным сульфатом аммония, методом осаждения эуглобулином, методом капроновой кислоты, методом каприловой кислоты, ионообменной хроматографии (DEAE или DE52) и аффинной хроматографии с использованием антииммуноглобулиновой колонки или колонки белка А.

«Рекомбинантное химерное моноклональное антитело» представляет собой моноклональное антитело, полученное с помощью генной инженерии, и конкретно означает химерное антитело, такое как мышиное/человеческое химерное моноклональное антитело, вариабельные области которого получены из иммуноглобулина млекопитающего, не являющегося человеком (мыши, крысы, хомяка и т.д.), но константные области которого получены из человеческого иммуноглобулина.

Константная область, полученная из человеческого иммуноглобулина, имеет аминокислотную последовательность, уникальную для каждого изотипа, такого как IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD и IgE. Константная область рекомбинантного химерного моноклонального антитела может представлять собой таковую человеческого иммуноглобулина, относящегося к любому изотипу. Предпочтительно она представляет собой константную область человеческого IgG.

Химерное моноклональное антитело может быть получено, например, следующим образом. Нет необходимости говорить, что способ получения им не ограничивается.

Мышиное/человеческое химерное моноклональное антитело может быть получено способом, описанным в публикации Experimental Medicine: SUPPLEMENT, Vol.1.6, No.10 (1988); и в прошедшей экспертизу опубликованной заявке на патент Японии №(JP-B) Hei 3-73280. А именно оно может быть получено путем оперативной инсерции гена СН (гена С, кодирующего константную область Н-цепи), полученного из ДНК, кодирующей человеческий иммуноглобулин ниже по течению от активных генов V_H (реоранжированный ген VDJ, кодирующий вариабельную область Н-цепи), полученных из ДНК, кодирующей мышиное моноклональное антитело, выделенное из гибридомы, продуцирующей мышиное моноклональное антитело, и гена С_L, (гена, кодирующего константную область L-цепи), полученного из ДНК, кодирующей человеческий иммуноглобулин ниже по потоку от активных генов V_L (реаранжированный ген VJ, кодирующий вариабельную область L-цепи), полученных из ДНК, кодирующей мышиное моноклональное антитело, выделенное из гибридомы, в тот же вектор или другой вектор экспрессируемым образом с последующей трансформацией клеток-хозяев вектором экспрессии, а затем культивированием трансформантов.

В частности, ДНК сначала экстрагируют из мышиных гибридом, продуцирующих моноклональные антитела обычным способом, переваривают соответствующими рестрикционными ферментами (например, EcoRI и HindIII), подвергают электрофорезу (с использованием, например, 0,7% агарозного геля) и анализируют методом саузерн-блоттинга. После окрашивания подвергнутого электрофорезу геля, например, этидийбромидом и фотографирования гелю присваивают маркерные положения. Дважды промывают водой и пропитывают в 0,25 М HCl в течение 15 мин. Затем гель пропитывают в 0,4н. растворе NaOH в течение 10 мин при осторожном перемешивании. ДНК переносят на фильтр на 4 часа обычным способом. Фильтр извлекают и промывают дважды 2×SSC, после того как фильтр достаточно высушен, его подвергают отжигу при 75°С в течение 3 часов. После отжига фильтр обрабатывают 0,1×SSC/0,1% SDS при 65°С в течение 30 мин. Затем его пропитывают в 3×SSC/0,1% SDS. Полученный фильтр обрабатывают прегибридизационным раствором в пластиковом мешке при 65°С в течение 3-4 часов.

Затем зонд ДНК, меченной ³²P, и гибридизационный раствор добавляют в мешок и обеспечивают возможность реакции при 65°С в течение 12 часов. После гибридизации фильтр промывают при соответствующей солевой концентрации, температуре реакции и времени (например, 2×SSC/0,1% SDS, комнатная температура, 10 мин). Фильтр кладут в пластиковый мешок небольшого объема 2×SSC и подвергают авторадиографии после герметичной укупорки мешка.

Реаранжированный ген VDJ и ген VJ, кодирующие Н-цепь и L-цепь мышиного моноклонального антитела, идентифицируют указанным выше методом саузерн-блоттинга. Область, содержащую идентифицированный фрагмент ДНК, фракционируют путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и осуществляют инсерцию в вектор фага (например, Charon 4А, Charon 28, λEMBL3 и λEMBL4). Е.coli (например, LE392 и NM539) трансформируют вектором фага для создания геномной библиотеки. Проводят скрининг геномной библиотеки методом гибридизации в бляшках, таким как способ Benton-Davis (Science, Vol.196, pp.180-182 (1977)), с использованием соответствующих зондов (Н-цепь гена J, L-цепь (κ) гена J), чтобы получить позитивные клоны, содержащие реаранжированный VDJ-ген или VJ-ген. Изготавливая рестрикционную карту и определяя нуклеотидные последовательности полученных клонов, подтверждают, то, действительно ли были получены гены, включающие желаемый реаранжированный ген V_E (VDJ) или ген V_L (VJ).

Отдельно выделяют человеческий ген С_Е и человеческий ген С_L, используемые для химеризации. Например, при получении химерного антитела с использованием человеческого IgG1, Cγ1 ген выделяют в виде гена С_H, а ген Сκ в виде гена С_L. Указанные гены можно выделить из человеческой геномной библиотеки с помощью мышиного гена Сγ1 и мышиного гена Сκ, соответствующих соответственно человеческому гену Сγ1 и человеческому гену Сκ, в качестве зондов, используя преимущество высокой гомологии между нуклеотидными последовательностями гена мышиного иммуноглобулина и гена человеческого иммуноглобулина.

В частности, фрагменты ДНК, включающие в себя ген Сκ и область энхансера, выделяют из человеческой геномной библиотеки λ Charon 4A HaeIII-AluI (Cell, Vol.15, pp.1157-1174 (1978)), например, с использованием фрагмента 3 т.п.н. HindIII-BamHI клона Ig146 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.75, pp.4709-4713 (1978)) и фрагмента 6,8 т.п.н. EcoRI клона МЕР10 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.78, pp.474-478 (1981)) в качестве зондов. Кроме того, например, после переваривания ДНК плодного гепатоцита HindIII и фракционирования электрофорезом на агарозном геле осуществляют инсерцию фрагмента 5,9 т.п.н. в λ788, а затем выделяют человеческий ген Сγ1, используя указанные выше зонды.

Используя полученные таким образом мышиный ген V_H, мышиный ген V_L, человеческий ген С_H и человеческий ген С_L и принимая во внимание область промотера и область энхансера, осуществляют инсерцию человеческого гена С_H ниже по течению от мышиного гена V_H, а инсерцию человеческого гена С_L осуществляют ниже по течению от мышиного гена V_L в такой вектор экспрессии как pSV2gpt или pSV2neo, с помощью соответствующих рестрикционных ферментов и ДНК-лигазы обычным способом. В данном случае можно произвести инсерцию соответственно химерных генов мышиного гена V_H/человеческого гена С_H и мышиного гена V_L/человеческого гена С_L в один и тот же вектор экспрессии или в различные векторы экспрессии.

Полученные таким образом вектор(ы) экспрессии с инсерцией гена вводят в миеломы, которые не продуцируют антитела, например клетки Р3Х63'Аg8'653 или клетки SP210, способом слияния с протопластом, способом с использованием DEAE-декстрана, способом с использованием фосфата кальция или методом электропорации. Проводят скрининг трансформантов, культивируя их в средах, содержащих препарат, соответствующий гену резистентности к препарату, встроенному в вектор экспрессии, а затем получают клетки, продуцирующие желаемые химерные моноклональные антитела.

Желаемые химерные моноклональные антитела получают из надосадочной жидкости культуры подвергнутых такому скринингу клеток, продуцирующих антитела.

«Гуманизированное моноклональное антитело (CDR-трансплантированное антитело)» согласно изобретению представляет собой моноклональное антитело, полученное методами генной инженерии и, значит, в частности, гуманизированное моноклональное антитело, в котором часть или все определяющие комплементарность области гипервариабельной области происходят из определяющих комплементарность областей гипервариабельной области моноклонального антитела млекопитающего, кроме человека (мыши, крысы, хомяка и т.д.), области антигенной детерминанты вариабельной области происходят из человеческого иммуноглобулина, а константная область происходит из константной области иммуноглобулина, полученного у человека.

Определяющая комплементарность область гипервариабельной области находится в гипервариабельной области в вариабельной области антитела и означает три области, которые непосредственно и комплементарно связываются с антигеном (определяющие комплементарность остатки, CDR1, CDR2 и CD3). Находящиеся в рамке считывания участки вариабельной области означают четыре сравнительно консервативных области, находящихся выше по течению, ниже по течению или между тремя областями, определяющими комплементарность (в рамке считывания участок FR1, FR2, FR3 и FR4).

Другими словами, гуманизированное моноклональное антитело означает то антитело, в котором все области, кроме части всех определяющих комлементарность областей гипервариабельной области моноклонального антитела, полученного у млекопитающего, за исключением человека, были замещены их соответствующими областями, полученными из человеческого иммуноглобулина.

Константная область, полученная из человеческого иммуноглобулина, имеет аминокислотную последовательность, уникальную для каждого изотипа, такого как JgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD и IgE. Константная область гуманизированного моноклонального антитела в настоящем изобретении может быть таковой из человеческого иммуноглобулина, относящегося к любому изотипу. Предпочтительно она представляет собой константную область человеческого IgG. Рамка считывания участков константной области, полученной из человеческого иммуноглобулина, особо не ограничена.

Гуманизированное моноклональное антитело можно получить, например, следующим образом. Нет необходимости говорить, что способ продуцирования не ограничивается им.

Например, рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело, полученное из мышиного моноклонального антитела, можно получить методами генной инженерии, со ссылкой на опубликованный перевод на японский язык заявки на международный патент (JP-WA) №Hei 4-506458 и JP-A Sho 62-296890. А именно по меньшей мере один мышиный ген CDR Н-цепи и по меньшей мере один мышиный ген CDR L-цепи, соответствующий мышиному гену CDR Н-цепи, выделяют из гибридом, продуцирующих мышиное моноклональное антитело, и человеческий ген Н-цепи, кодирующий все области, за исключением человеческого CDR Н-цепи, соответствующего указанному выше мышиному CDR Н-цепи, и человеческий ген L-цепи, кодирующий всю область, за исключением человеческого CDR L-цепи, соответствующего указанному выше мышиному CDR L-цепи, выделяют из генов человеческого иммуноглобулина.

Выделенные таким образом мышиный ген(ы) CDR Н-цепи и человеческий ген(ы) Н-цепи оперативно вставляют в соответствующий вектор с тем, чтобы они могли экспрессироваться. Аналогичным образом мышиный ген(ы) CDR и человеческий ген(ы) L-цепи оперативно вставляют в другой соответствующий вектор с тем, чтобы он(и) мог(ли) экспрессироваться. Альтернативно мышиный ген(ы) CDR Н-цепи/ человеческий ген(ы) Н-цепи и мышиный ген(ы) CDR L-цепи/ человеческий ген(ы) L-цепи могут экспрессируемым образом оперативно вставляться в один и тот же вектор экспрессии. Клетки хозяина трансформируются полученным таким образом вектором экспрессии для получения трансформантов, продуцирующих гуманизированное моноклональное антитело. Культивированием трансформантом из надосадочной жидкости культуры получают желаемое гуманизированное моноклональное антитело.

«Человеческое моноклональное антитело» представляет собой иммуноглобулин, в котором все области, включающие вариабельную и константную область Н-цепи, и вариабельную и константную область L-цепи, составляющие иммуноглобулин, получают из генов, кодирующих человеческий иммуноглобулин.

Человеческое антитело (предпочтительно человеческое моноклональное антитело) можно получить хорошо известными способами, например, тем же путем, что и указанный выше способ получения поликлональных или мноноклональных антител, путем иммунизации антигеном трансгенного животного, полученного интегрированием по меньшей мере гена человеческого иммуноглобулина в локус гена млекопитающего, кроме человека, такого как мышь.

Например, трансгенную мышь, продуцирующую человеческие антитела, получают способами, описанными в Nature Genetics, Vol.7, pp.13-21 (1994); Nature Genetics, Vol.15, pp.146-156 (1997); JP-WA Hei 4-504365; JP-WA Hei 7-509137; Nikkei Science, №6, pp.40-50 (1995); WO 94/25585; Nature, Vol.368, pp.856-859 (1994) и JP-WA №Hei 6-500233.

Кроме того, можно также применить недавно разработанную методику производства полученного у человека белка из молока трансгенной коровы или свиньи (Nikkei Science, pp.78-84 (April, 1997)).

Фраза «часть антитела», используемая в настоящем изобретении, означает частичную область моноклонального антитела, как указано выше. Она, в частности, означает F(ab')₂, Fab', Fab, Fv (вариабельный фрагмент антитела), sFv, dsFv (Fv, стабилизированный дисульфидом) или dAb (антитело с одним доменом) (Exp. Opin. Ther. Patents, Vol.6, №5, pp.441-456 (1996)).

«F(ab')₂ и Fab'» можно получить обработкой иммуноглобулина (моноклонального антитела) протеазой, такой как пепсин и папаин, и означает фрагмент антитела, генерированный перевариванием иммуноглобулина рядом с дисульфидными связями в шарнирных областях, существующими между каждыми двумя Н-цепями. Например, папаин расщепляет IgG выше по течению от дисульфидных связей в шарнирных областях, существующих между каждыми двумя Н-цепями, для генерирования двух гомологичных фрагментов антитела, в которых L-цепь, составленная из V_L - (вариабельная область L-цепи) и С_L - (константная область L-цепи) и фрагмент Н-цепи, составленный из V_H - (вариабельная область Н-цепи) и С_Hγ1 (γ1-область в константной области Н-цепи) соединены у их С-концевых областей через дисульфидную связь. Каждый из таких двух фрагментов гомологичного антитела называется Fab'. Пепсин также расщепляет IgG ниже по течению от дисульфидных связей в шарнирных областях, существующих между каждыми из двух Н-цепей, для генерирования фрагмента антитела, несколько большего, чем фрагмент, в котором указанные выше два Fab' соединены вблизи шарнирной области. Указанный фрагмент антитела называется F(ab')₂.

Термин «отторжение трансплантата» согласно изобретению относится к различным иммунным реакциям, которые участвуют в отторжении и уничтожении трансплантата (части живого организма, которая трансплантирована: клетки, ткани или органа) от донора, чей генетический фон отличается от такового реципиента (т.е. при аллотрансплантации или ксенотрансплантации), поскольку реципиент распознает трансплантат как инородное вещество. Иммунные реакции, которые сопровождают указанную трансплантацию, можно классифицировать на (1) сверхострое отторжение, которое представляет собой сильное отторжение, происходящее немедленно после трансплантации, (2) острое отторжение, которое наблюдается в пределах нескольких месяцев после трансплантации, и (3) хроническое отторжение, наблюдаемое через несколько месяцев после трансплантации. Кроме того, хотя клеточный иммунитет благодаря иммунокомпетентным клеткам, представленным Т-клетками, и гуморальный иммунитет благодаря антителам происходят эндогенно координированным образом, основная реакция осуществляется клеточным иммунитетом.

В результате отторжения трансплантат в конечном счете становится некротическим и отпадает. Кроме того, у пациентов развиваются не только тяжелые системные симптомы, такие как лихорадка, лейкоцитоз и усталость, но также отек и болезненность в участке трансплантации. Кроме того, могут возникнуть тяжелые осложнения, такие как инфекции.

В частности, при трансплантации ксеногенного трансплантата, такого как трансплантат от свиньи, возникает серьезная проблема сверхострого отторжения, в результате которого трансплантат отторгается в пределах минут.

Термин «трансплантат» согласно изобретению относится к «органу или его части» или «ткани», которые трансплантируются млекопитающему-реципиенту от млекопитающего-донора.

Фраза «орган или его часть», относящаяся к трансплантации согласно изобретению, относится к произвольному органу или его части, которые составляют живое тело млекопитающего (предпочтительно человека или свиньи, а особенно предпочтительно человека). Предпочтительным примером является печень, сердце, легкое, поджелудочная железа, почка, толстая кишка, тонкая кишка или их часть. Особенно предпочтительной является печень или ее часть.

Термин «ткань», относящийся к трансплантации согласно изобретению, относится к произвольной ткани, полученной из живого тела млекопитающего (предпочтительно человека или свиньи, а особенно предпочтительно человека). Предпочтительным примером является ткань, такая как кожа, роговица, кость или сердечный клапан; однако она не ограничивается ими.

Термин «иммуносупрессорное средство» согласно изобретению относится к любому одному или нескольким существующим иммуносупрессорным средствам, используемым для подавления иммунологического отторжения (отторжения трансплантата) у реципиента, которое вызвано трансплантацией трансплантата при клинической трансплантации клеток, тканей или органов, чье производство и продажи в качестве фармацевтического средства было утверждено правительственной организацией; или любое одно или несколько иммуносупрессорных средств, которые применяются в настоящее время в клинических или предклинических испытаниях или будут применяться в клинических испытаниях в будущем, чье производство и продажи в качестве фармацевтического средства могут быть утверждены правительственной организацией после испытаний.

Такие иммуносупрессорные средства применяются не только отдельно, но также в комбинации с 2, 3 или более средствами. Поэтому термин «иммуносупрессорное средство» в соответствии с данным изобретением включает в себя применение одного типа фармацевтического средства или комбинированное применение множества фармацевтических средств (предпочтительно применяемого в комбинации с 2 или 3 средствами).

Предпочтительно иммуносупрессорное средство представляет собой, например, одно или несколько фармацевтических средств, выбранных из циклоспорина (CsA); таклоримуса (FK-506); азатиоприна (AZ); микофенолатмофетила (MMF); мизорибина (MZ); лефлуномида (LEF); адренокортикостероидов (иначе именуемых гормонами коры надпочечников; кортикостероидами; кортикоидами), таких как преднизолон и метилпреднизолон; сиролимуса (иначе именуемого рапамицином); дезоксиспергулина (DSG); FTY720 (химическое название: 2-амино-2-[2-(4-октилфенил)этил]-1,3-пропандиол гидрохлорид) и «препарата CTLA4», описанных ниже. Особенно предпочтительным является любой из таклоримуса (FK-506) и циклоспорина.

Термин «препарат CTLA4» согласно изобретению относится к лекарственному препарату, который содержит в качестве активного ингредиента (1) полипептид, включающий в себя полную длину (включая молекулы, имеющие практически одинаковую аминокислотную последовательность) или же полностью или частично внеклеточную область человеческого CTLA4 (связанный с цитотоксическим Т-лимфоцитом антиген 4; <аминокислотная последовательность> Генетический Банк № доступа NP 005205; <кДНК> Генетический Банк № доступа NM 005214); (2) гибридный полипептид, включающий в себя полностью или частично внеклеточную область человеческого CTLA4 и полностью или частично другой белок (особенно предпочтительно, полностью или частично константную область тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина) (далее здесь представленного аббревиатурой CTLA4-IgFc или CTLA4-Ig); или (3) ДНК, которая может предоставить млекопитающему (особенно предпочтительно человеку) полипептид по п.(1), или гибридный полипептид по п. (2), или вектор, включающий в себя ДНК (особенно предпочтительной является плазмида, обычно используемая при генной терапии, или вирусный вектор, полученный из вируса (ретровируса, аденовируса, адено-ассоциированного вируса и т.д.), или тому подобное).

В данном описании каждый из терминов/фраз, таких как «внеклеточная область», «часть», «константная область тяжелой цепи иммуноглобулина», «гибридный полипептид» и «практически такой же» имеют такое же значение, как определено выше.

Имеется ряд сообщений о значимом иммуносупрессорном эффекте упомянутого выше CTLA4-Ig. Например, высокий иммуносупрессорный эффект Y100F (тирозин в положении 100 замещен фенилаланином), разработанный Bristol-Myers Squibb/Repligen, был подтвержден в различных экспериментах на животных, и данный продукт также включен в качестве одного из препаратов CNLA4 данного изобретения (Igaku no Ayumi, Vol.194, №14, р.1195-1200, 2000; J. Clin. Invest., Vol.103, p.1223-1225, 1999; N. Engl. J. Med., Vol.335, p.1369-1377, 1996; J. Exp. Med., Vol.178, p.1801-1806, 1993; Blood, Vol.94, p.2523-2529, 1999; Nature Med., Vol.6, p.464-469, 2000; Blood, Vol.83, p.3815-3823, 1995; J. Clin. Invest., Vol.2, p.473-482, 1998; Blood, Vol.86, p.2607-2612, 1995; N. Engl. J. Med., Vol.340, p.1704-1714, 1999; N. Engl. J. Med., Vol.335, p.1369-1377, 1996; J. Clin. Invest., Vol.103, p.1243-1252, 1999).

Фраза «фармацевтически приемлемый носитель» согласно изобретению включает в себя наполнитель, разбавитель, заполнитель, разрыхлитель, стабилизатор, консервант, буфер, эмульгатор, ароматический агент, красящий агент, подслащивающий агент, агент, увеличивающий вязкость, отдушку, агент, увеличивающий растворимость или некоторую другую добавку. При использовании одного или нескольких таких носителей фармацевтическая композиция может быть составлена в таблетки, пилюли, порошки, гранулы, растворы для инъекций, растворы, капсулы, драже, эликсиры, суспензии, эмульсии, сиропы и т.д.

Фармацевтическую композицию можно вводить перорально или парентерально. Другие формы парентерального введения включают в себя раствор для наружного применения, суппозиторий для ректального введения и пессарий, назначаемый обычным способом, который включает в себя один или несколько активных ингредиентов.

Дозировка может варьировать в зависимости от возраста, пола, массы тела и симптомов у пациента, эффекта лечения, пути введения, периода лечения, вида активного ингредиента (указанного выше «вещества» в соответствии с настоящим изобретением), содержащегося в фармацевтической композиции, и т.д. Обычно фармацевтическую композицию можно вводить взрослому в дозе от 10 мкг до 1000 мг (или от 10 мкг до 500 мг) на одно введение. В зависимости от различных условий в некоторых случаях может быть достаточна дозировка, меньшая, чем указанная выше, а в других может быть необходима дозировка, большая, чем указанная выше.

В случае раствора для инъекции он может быть получен путем растворения или суспендирования антитела в нетоксичном фармацевтически приемлемом носителе, таком как физиологический солевой раствор или имеющаяся в продаже дистиллированная вода для инъекций, при доведении концентрации до диапазона от 0,1 мкг антитела/мл носителя до 10 мг антитела/мл носителя. Полученный таким образом раствор для инъекций можно вводить человеку-пациенту, нуждающемуся в лечении, в диапазоне доз от 1 мкг до 100 мг/кг массы тела, предпочтительно в диапазоне от 50 мкг до 50 мг/кг массы тела, один или несколько раз в сутки. Примеры путей введения представляют собой целесообразные с медицинской точки зрения пути введения, такие как внутривенная инъекция, подкожная инъекция, внутрикожная инъекция, внутримышечная инъекция, внутрибрюшинная инъекция или им подобные, предпочтительно внутривенная инъекция.

Раствор для инъекций может также быть получен в неводном разбавителе (например, пропиленгликоле, полиэтиленгликоле, растительном масле, таком как оливковое масло, и в спирте, таком как этанол), суспензии или эмульсии. Раствор для инъекций можно стерилизовать путем фильтрации через фильтр, отфильтровывающий бактерии, путем смешивания с бактерицидным агентом или облучения. Раствор для инъекций может быть получен таким образом, что его готовят во время применения. А именно его лиофилизируют для того, чтобы он представлял собой твердую композицию, которую можно растворить в стерильной дистиллированной воде для инъекций или в другом растворителе перед применением.

Фармацевтическая композиция согласно изобретению крайне полезна для подавления, профилактики и/или лечения иммунологического отторжения (отторжения трансплантата), которое является серьезной проблемой при таких видах лечения, когда орган (печень, сердце, легкое, почка, поджелудочная железа и т.д.) или его часть, или ткань (такая как кожа, роговица и кость) от донора трансплантируют (аллотрансплантируют или ксенотрансплантируют) реципиенту, пораженному тяжелым сердечно-сосудистым заболеванием.

Кроме того, фармацевтическая композиция согласно изобретению может увеличить эффект подавления иммунологического отторжения (отторжения трансплантата) существующими иммуносупрессорными средствами, назначаемыми для подавления отторжения трансплантата во время таких видов лечения трансплантатом, когда фармацевтическую композицию применяют в комбинации с иммуносупрессорными средствами.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показан эффект антитела против AILIM и/или иммуносупрессорного средства на подавление иммунологического отторжения (отторжения трансплантата), сопровождающего трансплантацию органов, с использованием в качестве показателя продления выживания трансплантата у реципиента, которому пересадили печень от донора.

На фиг.2 показан эффект подавления иммунологического отторжения (отторжения трансплантата), которое происходит, сопровождая трансплантацию органа, антителом против AILIM и/или иммуносупрессорным средством, при использовании в качестве показателя увеличения в днях выживания трансплантата печени, пересаженной от донора реципиенту.

На фиг.3 показан эффект подавления иммунологического отторжения (отторжения трансплантата), которое происходит, сопровождая трансплантацию органа, антителом против AILIM (иначе именуемым антителом против ICOS) при использовании в качестве показателя увеличения в днях выживания трансплантата сердца, пересаженного от донора реципиенту.

Фиг.4 представляет собой фотографию, показывающую степень инфильтрации клеток, экспрессирующих AILIM, в трансплантированное сердце.

На фиг.5 показан эффект подавления иммунологического отторжения (отторжения трансплантата), которое происходит, сопровождая трансплантацию органа, антителом против AILIM/или AdCTLA4-Ig, при использовании в качестве показателя увеличения в днях выживания трансплантата сердца, пересаженного от донора реципиенту.

На фиг.6 показан эффект антитела против AILIM, применяемого в комбинации с AdCTLA4-Ig, на подавление иммунологического отторжения (отторжения трансплантата), сопровождающего трансплантацию органа, при использовании в качестве показателя наличия присутствия или отсутствия выживания трансплантата пересаженного сердца (первичная трансплантация сердца и вторичная трансплантация сердца) и пересаженной кожи (первичная трансплантация кожи) реципиенту.

Лучший способ осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет конкретно проиллюстрировано со ссылкой на примеры, но его не следует рассматривать как ограниченное вариантами реализации, описанными в примерах.

[Пример 1] подавление отторжения трансплантата веществом, модулирующим AILIM при трансплантации печени

<1> Материалы и методы

<1-1> Животные

Взрослых крыс линии Lewis (самцы, 210-250 г) и крыс линии DA (самцы, 210-250 г) использовали соответственно в качестве реципиентов и доноров.

<1-2> Моноклональное антитело против крысиного AILIM

Использовали моноклональное антитело, очищенное из асцитной жидкости или надосадочной жидкости культуры, полученной в результате культивирования in vitro или in vivo гибридомы, названной "JTT-1", о которой сообщалось ранее (данная гибридома была депонирована на международном уровне 11 октября 1996 г. в Национальном институте биологических наук и технологии человека, Передовой научной индустрии и технологии Министерства экономики, торговли и промышленности, которое представляет собой международное депозитарное агентство, сертифицированное в соответствии с Будапештским договором. Номер международного доступа: FERM ВР-5707), которое продуцирует мышиное моноклональное антитело против крысиного AILIM (мышиное моноклональное антитело против крысиного антигена JTT-1) (JP-A Hei 11-29599 (примеры 1 и 2) и международная патентная заявка №WO98/38216 (примеры 1 и 2). Далее указанное антитело именуется просто «антителом против AILIM».

<1-3> Трансплантация печени

В соответствии с ранее опубликованным способом Kamada et al., печень доноров крыс DA трансплантировали реципиентам-крысам Lewis (Surgery, 93, р.64, 1983; Transplantation, 30, р.43, 10980; Transplantation, 28, р.47, 1979).

Конкретно, печень, полученную у крыс DA, промывали сильной струёй ледяной стерилизованной дистиллированной воды через воротную вену. Затем трансплантацию печени реципиентам-крысам Lewis начинали со сшивания надпеченочной полой вены. Затем, используя методику манжеты, сшивали воротную вену и подпеченочную полую вену (Transplant. Proc., 19, р.1158, 1987; Transplantation, 43, р.745, 1987).

Если крысы-реципиенты погибали в течение 3 дней после завершения трансплантации, это определяли как техническую несостоятельность трансплантации. В результате успех трансплантации составил 95%.

<1-4> Введение антитела против AILIM и/или иммуносупрессорного средства

После завершения трансплантации каждой из крыс Lewis (каждая группа включала в себя 5-9 животных) вводили антитело против AILIM и/или иммуносупрессорное средство FK-506 в описанных ниже дозах и в указанное время. День, в который завершали трансплантацию, считали нулевым днем (0).

Группу, которой не вводили ни антитело против AILIM, ни иммуносупрессорное средство FK-506, использовали в качестве контроля.

1. Антитело против AILIM (1 мг/кг; внутривенная инъекция; день 0)

2. Антитело против AILIM (1 мг/кг; внутривенная инъекция; день 0 и 6)

3. Антитело против AILIM (1 мг/кг; внутривенная инъекция; день 0, 3 и 6)

4. Антитело против AILIM (1 мг/кг; внутривенная инъекция; день 0, 3, 6, 9 и 12)

5. Антитело против AILIM (0,3 мг/кг; внутривенная инъекция; день 0, 3, 6, 9 и 12)

6. FK-506 (1 мг/кг; внутримышечная инъекция; день 0)

7. Антитело против AILIM (1 мг/кг; внутривенная инъекция; день 0 и FK-506 (1 мг/кг; внутримышечная инъекция; день 0)

Длительность выживания трансплантированной печени у реципиента оценивали и определяли в соответствии с критерием Kaplan-Maier.

<2> Результаты

Результаты показаны на фиг.1 и фиг.2. Части данных на фиг.2 представляют собой модернизированные данные фиг.1.

В результате в группе, которой вводили антитело против AILIM (1 мг/кг) 3 или 5 раз в течение периода времени после трансплантации, наблюдали значимое удлинение выживания трансплантата по сравнению с выживанием у контроля.

Кроме того, в группе, которой вводили низкую дозировку антитела против AILIM (0,3 мг/кг) 5 раз в течение периода времени после трансплантации, также наблюдали аналогичное, значимое удлинение выживания трансплантированной печени.

Кроме того, к удивлению, когда антитело против AILIM вводили даже лишь один раз в комбинации с FK-506, который является иммуносупрессорным средством, применяемым в клинических условиях по многим назначением, выживание трансплантата пересаженной печени значительно удлинялось, становясь значимо дольше, чем когда однократно вводили только FK-506 (1 мг/кг).

На основании этих результатов выявили следующее.

1) Антитело против AILIM значимо подавляет отторжение трансплантата (иммунологическое отторжение), которое сопровождает трансплантацию трансплантата, такого как орган.

2) Отторжение трансплантата, которое сопровождает трансплантацию трансплантата, такого как орган, можно дополнительно подавить путем применения антитела против AILIM в комбинации с иммуносупрессорным средством по сравнению с применением только одного из них.

[Пример 2] Подавление иммунологического отторжения веществом, модулирующим AILIM, при трансплантации сердца (часть 1)

<1> Реагенты, животные и способ тестирования

<1-1> Животные

В качестве соответственно реципиентов и доноров использовали взрослых мышей С3Н/Не (самцов в возрасте 6 недель) и мышей BALB/c (самцов в возрасте 6 недель).

<1-2> Получение моноклонального антитела против мышиной AILIM

Получение осуществляли следующим образом.

Используя кДНК, кодирующую полную длину аминокислотной последовательности ранее опубликованных данных по мышиной AILIM (Int. Immunol., Vol.12, №1, р.51-55, 2000), получали трансформированную клетку, экспрессирующую AILIM, в соответствии со стандартными способами с использованием генетической рекомбинантной технологии.

Трансформированную клетку гомогенизировали и центрифугировали на ультрацентрифуге (1000000×g) и подвергнутый центрифугированию остаток, содержащий фракцию клеточной мембраны, собирали и суспендировали в солевом растворе с фосфатным буфером. Полученную фракцию клеточной мембраны инъецировали вместе с полным адъювантом Фрейнда в подушечку лапы крысы Wistar для начальной иммунизации (день 0). Кроме того, фракцию клеточной мембраны вводили в качестве антигена в подушечку лапы с интервалами на 7-ой, 14-й и 28-ой дни. Через 2 дня после конечной иммунизации брали клетки лимфоузла.

Клетки лимфоузла и клетки мышиной миеломы PAI (JCR №В0113; Res. Dosclosure, Vol.217, p.155, 1982) смешивали в соотношении 5:1 и гибридому, продуцирующую моноклональное антитело, получали путем слияния клеток с использованием полиэтиленгликоля 4000 (Doehringer Mannheim) в качестве агента слияния. Отбор гибридомы проводили, культивируя в содержащей гипоксантин-аминоптерин-тимидин (ГАТ) среде ASF104 (Ajinomoto), содержащей 10% плодную бычью сыворотку и аминоптерин.

Интенсивность флуоресценции клеток, окрашенных в результате реакции надосадочных жидкостей культур каждой гибридомы с указанными выше трансфицированными клетками, экспрессирующими рекомбинантную мышиную AILIM, а затем обеспечения их реакции с меченным флуоресцеин-изотиоцианатом анти-мышиным IgG (Cappel), измеряли с помощью проточного цитометра для подтверждения реактивности моноклональных антител, продуцированных в надосадочной жидкости культуры каждой гибридомы против мышиной AILIM. В результате получили несколько гибридом, которые продуцировали моноклональные антитела, обладающие реактивностью в отношении мышиной AILIM.

Одну из указанных гибридом назвали "В10.5". Данную гибридому (10⁶-10⁷ клеток/0,5 мл/каждую мышь) инъецировали внутрибрюшинно мышам ICR nu/nu (самки в возрасте от 7 до 8 недель). Через 10-20 дней мышам под анестезией проводили лапаротомию и осуществляли крупномасштабное получение крысиного моноклонального антитела против мышиной AILIM (IgG2a) из асцита, полученного в соответствии со стандартными процедурами. Затем данное антитело просто именовали «антителом против AILIM».

<1-3> Трансплантация сердца

В соответствии с ранее опубликованным способом сердца доноров мышей BALB/c трансплантировали в брюшные полости мышей-реципиентов С3Н/Не. Исчезновение пульсации тресплантированного сердца расценивали как завершение отторжения трансплантата.

<2> Эксперимент 1 (введение антитела против AILIM)

Каждой мыши С3Н/Не (10 мышей), у которой была завершена трансплантация, антитело против AILIM (10 мг/кг) вводили непосредственно после трансплантации (день 0; 200 мкг), на 2-ой день (200 мкг), 4-й день (200 мкг), 7-ой день (200 мкг) и 10-й день (100 мкг). Группу, которой не вводили антитело против AILIM (25 мышей), использовали в качестве контроля.

Длительность выживания трансплантата пересаженного сердца у реципиента после трансплантации оценивали и определяли в соответствии с критерием Kaplan-Meier.

Средняя длительность выживания трансплантированного сердца у реципиента была следующей:

(группа, которой вводили антитело против AILIM)

длительность выживания трансплантата: 9 дней у 1 мыши, 10 дней у 3 мышей, 13 дней у 4 мышей, 16 дней у 2 мышей (контрольная группа)

длительность выживания трансплантата: 6 дней у 2 мышей, 7 дней у 9 мышей, 8 дней у 7 мышей, 9 дней у 3 мышей, 10 дней у 4 мышей.

Длительность выживания трансплантата в контрольной группе, которой не вводили антитело против AILIM, составила 7,9 дней, но в отличие от этого она составила 12,3 дней в группе, которой вводили антитело против AILIM, и значимое удлинение выживания трансплантата пересаженного сердца было продемонстрировано в группе, которой вводили антитело против AILIM.

<3> Эксперимент 2 (введение антитела против AILIM

Использованные животные (доноры и реципиенты) и антитело против AILIM были такими же, как указано выше.

Трансплантацию сердца проводили способом, аналогичным эксперименту 1.

Каждой мыши С3Н/Не, у которой была завершена трансплантация, антитело против AILIM (100 мкг/сут) вводили внутрибрюшинно непосредственно после трансплантации (день 0), на 2-ой день, 4-й день, 7-ой день и 10-й день. Группу, которой не вводили антитело против AILIM, использовали в качестве контроля.

Средняя продолжительность выживания трансплантата, пересаженного реципиенту, составила приблизительно 7,7 дней в контрольной группе, в то время как в группе, которой вводили антитело против AILIM, она составила приблизительно 40,9 дней (промежуточная величина: 29 дней/максимальная величина: 120 дней) (фиг.3). А именно в группе, которой вводили антитело против AILIM, было продемонстрировано значимое удлинение выживание трансплантата пересаженного сердца.

Кроме того, окрашивая гематоксилин/эозином (окрашивание НЕ) в соответствии со стандартными способами, степень инфильтрации клеток, экспрессирующих AILIM (ICOS), в трансплантированное сердце анализировали у каждой из контрольных мышей (без терапевтического лечения после трансплантации сердца) и у мышей, которым после трансплантации вводили антитело против AILIM.

В результате в нелеченой группе наблюдали значительную инфильтрацию клетками, экспрессирующими AILIM (ICOS), а также некроз сердечной мышцы (окрашенная часть). С другой стороны, в трансплантированном сердце мыши, которой вводили антитело против AILIM, некроза сердечной мышцы не наблюдали, и было подтверждено значимое уменьшение инфильтрации клетками, экспрессирующими AILIM (ICOS) (фиг.4).

[Пример 3] Подавление иммунологического отторжения веществами, модулирующими AILIM, при трансплантации сердца и кожи

<1> Реагенты, животные и способ тестирования

<1-1> Аденовирусный вектор

Рекомбинантный аденовирус, содержащий кассету экспрессии или кДНК, кодирующей hCTLA4-Ig (гибридный белок, включающий в себя внеклеточную область человеческого CTLA4 и человеческого Fc), или ген β-галоактозидазы (LacZ) E. coli, получали путем гомологичной рекомбинации между кассетой экспрессионной космиды pAdex/CAhCTLA4-Ig (Transplantation, Vol.68, №6, р.758, 1999) и геномом родительского штамма аденовируса (Proc. Acad. Sci. USA., Vol.90, №24, р.11498-11502, 1993).

Затем происходила пролиферация рекомбинантного вируса внутри 293-клеточной линии, полученной из почки человека. Полученный таким образом вирус собирали и хранили при -80°С. Рекомбинантный вирус, содержащий кДНК hCTLA4-Ig, и аденовирус, содержащий LacZ, были названы соответственно AdCTLA4-Ig и AdLacZ.

<1-2> Животные и антитело

Взрослых самцов (210-250 г) крыс Lewis (RT1¹) использовали в качестве реципиентов, а взрослых самцов (210-250 г) крыс DA (RT1^a) или BN (RT1ⁿ) использовали в качестве доноров.

Использовали мышиное моноклональное антитело против крысиной AILIM, полученное в примере 1.

<1-3> Трансплантация сердца и кожи и способ тестирования

В соответствии с ранее опубликованным способом (J. Thorac. Cardiovasc. Surg., Vol.57, №2, р.225-229, 1969) сердца, полученные у крыс DA, трансплантировали в брюшную полость крыс Lewis. Непосредственно после трансплантации сердца крысам-реципиентам внутривенно вводили антитело против крысиной AILIM (1 мг/кг) и/или AdCTLA4-Ig (10⁹ бляшкообразующих единиц; pfu) в одной дозе.

Группу животных с трансплантатом, которым не вводили ни антитело против крысиной AILIM, ни AdCTLA4-Ig, и группу животных с трансплантатом, которым вводили AdLacZ, использовали в качестве контролей. Способ лечения каждой группы животных представлял собой, как показано ниже, следующее:

Группа 1: Аллотрансплантация (Lewis/DA) без иммуносупрессорного лечения.

Группа 2: Изотрансплантация (Lewis/Lewis) без иммуносупрессорного лечения.

Группа 3: Аллотрансплантация (Lewis/DA) с введением AdLacZ.

Группа 4: Аллотрансплантация (Lewis/DA) с введением AdCTLA4-Ig.

Группа 5: Аллотрансплантация (Lewis/DA) с введением антитела против AILIM.

Группа 6: Аллотрансплантация (Lewis/DA) с введением AdCTLA4-Ig и антитела против AILIM.

Исчезновение пульсации трансплантированного сердца расценивали как завершение отторжения трансплантата. Отторжение трансплантата подтверждали гистологическим анализом мононуклеарных клеток, которые инфильтрировали ткань трансплантированного сердца, и некрозом мышечных клеток, подтвержденным окрашиванием НЕ в соответствии со стандартными способами.

Затем в боковую стенку грудной полости крыс-реципиентов из группы 4 и группы 6, в которых трансплантированные сердца выживали в течение длительного периода, на 140-й день после трансплантации сердца трансплантировали достаточно толстый трансплантат кожи крысы-донора линии DA. После трансплантации кожи иммуносупрессорное лечение антителом против AILIM, AdCTLA4-Ig или им подобным не проводили. Конец длительности выживания трансплантата кожи определяли, когда степень визуально наблюдаемого трансплантата кожи уменьшалась до 10% или менее исходного состояния.

Затем на 200-й день от исходной трансплантации сердца крыс DA с использованием методики манжеты (Acta Pathol. Microbiol. Scand. [A], Vol.79, р.366-272, 1971) сердце донора-крысы DA снова трансплантировали в область шеи 3 крыс-реципиентов из группы 6, у которых наблюдались признаки отторжения трансплантата после получения трансплантата кожи донора.

Далее, на 150-й день после исходной трансплантации сердца от доноров-крыс DA сердца доноров-крыс BN трансплантировали оставшимся крысам-реципиентам из группы 6, у которых трансплантированное сердце выживало в течение длительного периода.

Статистическую оценку степени выживания трансплантата у реципиентов выполняли в соответствии с критерием Kaplan-Meier.

<2> Результаты экспериментов

Как показано на фиг.5, значимое удлинение выживания трансплантата пересаженного сердца у реципиентов по сравнению с группой нелеченых животных, которым выполняли ксенотрансплантацию (группа 1), не наблюдали в группе животных, которым вводили AdLacZ (группа 3), и в группе животных, которым вводили однократную дозу антитела против AILIM (группа 5).

С другой стороны, в группе животных, которым вводили AdCTLA4-Ig (группа 4), выживание трансплантата пересаженного сердца (исходно трансплантированного сердца крыс DA) значимо продлилось (в среднем приблизительно 64 дня). Более того, у 3 крыс из группы 4 (10 крыс) наблюдали выживание трансплантата пересаженного сердца в течение длительного периода, составившего 100 дней и более (фиг.5).

Более того, в группе животных, у которых применяли AdCTLA4-Ig и антитело против AILIM в комбинации (группа 6), выживание трансплантата пересаженного сердца (исходное сердце крыс DA) неопределенно удлинялось (300 дней и более) у всех реципиентов (фиг.5).

У крыс-реципиентов группы 4 трансплантированное сердце (исходно трансплантированное сердце доноров-крыс DA) отторгалось наряду с отторжением трансплантированной кожи, тогда как у крыс-реципиентов группы 6 отторжение трансплантированного сердца не наблюдали.

Как показано на фиг.6, у всех крыс-реципиентов группы 4 и группы 6, которым была трансплантирована кожа от донора, трансплантированная кожа была отторгнута. Однако в отличие от группы 4 и контрольной группы, у которых отторжение трансплантированной кожи завершилось через 12 дней или менее после момента трансплантации кожи, завершение отторжения несколько отсрочилось и наблюдалось в пределах 16 дней или менее в группе 6. Такой результат показывает, что комбинированное применение AdCTLA4-Ig и антитела против AILIM может отсрочить отторжение пересаженной кожи по сравнению со случаем, когда AdCTLA4-Ig применяется отдельно.

Интересно, что у крыс-реципиентов из группы 6, у которых было подтверждено длительное выживание трансплантата пересаженного сердца (исходное сердце крыс DA), трансплантированная кожа полностью отторглась, как указано выше, но выживание трансплантата наблюдали в течение неопределенного периода у второго трансплантированного сердца (сердце крыс-доноров DA, трансплантированное второй раз). Кроме того, у крыс-реципиентов, которым исходно трансплантировали сердце, сердце выживало в течение всего периода исследования.

У реципиентов группы 6, которым трансплантировали сердца крыс-доноров DA, исходно трансплантированные сердца крыс DA продолжали пульсировать и выживали в течение всего периода исследования, но сердца крыс-доноров BN, трансплантированные второй раз, были отторгнуты в пределах периода, аналогичного результатам, полученным на животных группы 1.

Промышленная применимость

Фармацевтические композиции согласно изобретению крайне полезны при подавлении, профилактике и/или лечении иммунологического отторжения (отторжения трансплантата), серьезной проблемы, сопровождающей способы лечения путем трансплантации (аллотрансплантации или ксенотрансплантации) органов (печени, сердца, легких, почек, поджелудочных желез и т.д.), их частей или тканей (кожи, роговицы, кости и т.д.) от доноров реципиентам, пораженным тяжелыми сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Фармацевтические композиции согласно изобретению могут также сильнее подавлять отторжения трансплантата при применении в комбинации с существующими иммуносупрессорными средствами, которые вводят для подавления отторжения трансплантата (иммунологического отторжения) при таких трансплантационных видах лечения.

Кроме того, фармацевтическая композиция, включающая в себя человеческое антитело против AILIM, включенная в фармацевтические композиции согласно изобретению, является крайне полезным лекарственным препаратом, потому что она не вызывает никаких побочных эффектов, таких как аллергия, когда антитело, полученное от мышей, вводят человеку.

Изобретение относится к медицине, точнее к трансплантологии, и касается средства, подавляющего отторжение трансплантата. Изобретение раскрывает фармацевтические композиции, содержащие вещество, которое обладает активностью модуляции биологической активности, «индуцируемой активацией лимфоцитарной иммуномодулирующей молекулы» (AILIM) (известной также как «индуцируемый совместный стимулятор» (ICOS), в частности модуляции трансдукции сигнала, опосредованного AILIM. Изобретение обеспечивает подавление, лечение или профилактику отторжения трансплантата, сопровождающего трансплантацию органа, его части или ткани. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 6 ил.

1. Фармацевтическая композиция для подавления, лечения или профилактики отторжения трансплантата, сопровождающего трансплантацию органа, его части или ткани, причем указанная композиция включает в себя эффективное количество вещества, обладающего активностью модуляции трансдукции сигнала, опосредованного индуцируемой активацией лимфоцитарной иммуномодулирующей молекулой (AILIM), и фармацевтически приемлемый носитель.2. Фармацевтическая композиция для усиления эффекта одного или нескольких иммуносупрессорных средств для подавления, лечения или профилактики отторжения трансплантата, сопровождающего трансплантацию органа, его части или ткани, причем указанная композиция включает в себя эффективное количество вещества, обладающего активностью модуляции трансдукции сигнала, опосредованного индуцируемой активацией лимфоцитарной иммуномодулирующей молекулой (AILIM), и фармацевтически приемлемый носитель.3. Фармацевтическая композиция по п.2, в которой указанное иммуносупрессорное средство представляет собой одно или несколько терапевтических средств, выбранных из группы, состоящей из азатиоприна, адренокортикостероида, циклоспорина, мизорибина и такролимуса (FK-506), микофенолата мофетила, лефлуномида, сиролимуса, дезоксиспергулина, FTY720 и препарата CTLA4.4. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанная трансплантация представляет собой аллотрансплантацию.5. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанная трансплантация представляет собой ксенотрансплантацию.6. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанный орган представляет собой печень, сердце, почку, легкое или поджелудочную железу.7. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанная ткань представляет собой кожу, роговицу или костную ткань.8. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой указанное вещество представляет собой белковое вещество.9. Фармацевтическая композиция по п.8, где указанное белковое вещество выбрано из группы, состоящей из

a) антитела, которое связывается с AILIM, или части указанного антитела;

b) полипептида, включающего в себя, полностью или частично, внеклеточную область AILIM;

c) гибридного полипептида, включающего в себя, полностью или частично, внеклеточную область AILIM, и полностью или частично константную область тяжелой цепи иммуноглобулина; и

d) полипептида, который связывается с AILIM.

Приоритет по пунктам: