СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СКРЫТОЙ ЭСТРОГЕНОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ПРИ РЕЦЕПТОРНЕГАТИВНОМ РАКЕ ТЕЛА МАТКИ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/573 

Изобретение относится к медицине, в частности к онкоэндокринологии и онкогинекологии.

В последнее время отмечается отчетливая тенденция к увеличению частоты гормонозависимых опухолей. В первую очередь, это относится к раку эндометрия и молочной железы. Следует отметить, что в структуре онкологической заболеваемости женских половых органов рак тела матки (РТМ) в 2001 году вышел на первое место и составил в Российской Федерации 39,8%, а в Санкт-Петербурге более 40%. Данные статистики объективно иллюстрируют значительное увеличение заболеваемости раком эндометрия (РЭ) от 6,4 в 1970 году до 17,5 случаев на 100 тыс. женщин в 2001 году, причем ежегодный прирост заболеваемости составляет в среднем 12% (Чиссов В.И. и др., Состояние онкологической помощи населению России в 2001 году. - М.: МНИОИ им. П.А.Герцена, 2002, 176 с). Соответственно, представляется оправданным поиск дополнительных подходов к оценке гормонозависимости подобных новообразований, основанный, в том числе, на современных представлениях о гормональном канцерогенезе (Берштейн Л.М. Гормональный канцерогенез. - СПб.: Наука, 2000, 199 с.).

В настоящее время, помимо оценки клинико-морфологических особенностей опухоли, доказано прогностическое значение определения стероидных рецепторов у больных РТМ. Положительный уровень этих рецепторов, особенно рецепторов прогестерона (ПР), является основным критерием установления гормонозависимости новообразований эндометрия. В отношении ЭР дело обстоит несколько сложнее, так как многие низкодифференцированные аденокарциномы содержат рецепторы эстрогенов. К тому же, определение ПР положительно коррелирует с клинико-морфологическим вариантом заболевания и степенью морфологической дифференцировки рака эндометрия, а также со спонтанной секрецией в опухоли, в то время как уровень ЭР положительно коррелировал с метастазами в регионарные лимфоузлы (Вишневский А.С. и др. Влияние прогестинотерапии на уровень цитоплазматических рецепторов у больных раком тела матки. - Вопр. онкол., 1989, 35 (5), С.594-598; Цырлина Е.В. и др. Влияние неоадъювантной терапии неовиром на содержание рецепторов стероидных гормонов в ткани рака тела матки. - Вопр. онкол., 2001, 47 (2), с.214-217; Martin P.M. et al., Estradiol and progesterone receptors in normal and neoplastic endometrium: correlations between receptors, histopathological examinations and clinical responses under progestin therapy. - Int J Cancer, 1979, 23 (3), р.321-329; Gurpide E. Hormone receptors in endometrial cancer. - Cancer, 1981, 48 (2), р.63 8-641). Тем не менее, содержание не только ПР, но и рецепторов эстрадиола (ЭР) при более высокой степени дифференцировки (G₁ и G₂) было значительно выше, чем при G3 (Цырлина Е.В. и др. Влияние тамоксифена на содержание цитоплазматических рецепторов стероидных гормонов в опухоли у больных раком тела матки. - Вопр. онкол., 1989, 35 (6), с.675-680; Gurpide E., 1981 (см. выше); Lindahl В. et al. Correlation between estradiol-17 beta and progesterone cytosol receptor concentration, histologic differentiation and ³H-thymidine incorporation in endometrial carcinoma. - Anticancer Res., 1982, 2 (4), р.203-207).

Однако, даже у тех больных, в новообразованиях у которых определяются рецепторы стероидов, клинический эффект от гормонотерапии удается получить только в 70-90% случаев, и наоборот, у пациенток с отрицательными как прогестероновыми, так и эстрогенными рецепторами в 10-15% случаев удается получить хороший лечебный эффект (Vishnevsky A.S. et al. Criteria of endometrial carcinoma sensitivity to hormone therapy: pathogenetic type of the disease and the tumor reaction to tamoxifen. - Eur. J. Gynecol. Oncol., 1993, 14 (2), р.139-143; Bonte J. et al. Vaginal cytologic evaluation as a practical link between hormone blood levels and tumor hormone dependency in exclusive medroxyprogesterone treatment of recurrent or metastatic endometrial adenocarcinoma. - Acta Cytol., 1977, 21 (2), р.218-224; Kauppila A. and Vihko R. Estrogen and progestin receptors as prognosis markers in endometrial cancer. In: Schultz K.D. et al., Eds. - Endometrial cancer, 1987, p.104-111). Поэтому сохраняется необходимость в комплексной оценке факторов, помогающих предсказать эффект гормонотерапии. Одним из возможных показателей, позволяющих оценить гормоночувствительность ткани РТМ, является фермент пероксидаза и его реакция на эстрогенную стимуляцию.

В настоящее время считается доказанной эстрогенозависимость пероксидазы в матке грызунов, в то время как в отношении чувствительности данного фермента к эстрогенам в ткани эндометрия у человека представлены неоднозначные результаты (Lucas F.V. et al. Uterine peroxidase activity in human endometrium. - Am. J. Obst. Gynecol., 1964, 88, p.965-967; Press M.F. et al. Epithelial peroxidase and endometrial granulocytes in the normal cyclic human endometrium. - J Clin Endocrinol Metab., 1983, 57 (2), p.254-261; Iwasaku К. et al. Antimicrobial effect of human endometrial peroxidase on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. -Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi, 1987, 39 (1), р.99-105). Противоречивые сведения были получены и при оценке активности пероксидазы (АПО) в ткани малигнизированного эндометрия. По наблюдениям одних авторов, средние значения АПО были наименьшими в ткани аденокарциномы эндометрия, чуть выше - при аденоматозной и кистозной гиперплазии и самыми высокими - в ткани атрофического эндометрия (Townsend J.F. et al. Uterine peroxidase activity in malignant, hyperplastic, and atrophic endometrium. - Am J Obstet Gynecol., 1968, 100 (1), р.98-100). По другим сведениям, в том числе полученным нами, при раке тела матки активность данного фермента более высока, чем в нормальном эндометрии (Васильев Д.А. и соавт. Активность пероксидазы в ткани тела матки человека: связь с клинико-морфологическими особенностями рака эндометрия. Вопр.онкол., 2001, 47 (5), с.575 -579; Holinka C.F. and Gurpide E. Hormone-related enzymatic activities in normal and cancer cells of human endometrium. - J Steroid Biochem., 1981, 15, р.183-192; Morikawa S. et al. Endogenous peroxidase content in normal and neoplastic tissues derived from human female genital tract. - Acta Obstet. Gynaecol. Jpn., 1981, 33 (6), p.825-826; Iwasaku К. et al., 1987 (см. выше)).

В этом отношении заслуживает внимания работа Н. Okada и соавт. (1985), в которой авторы оценивали динамику активности пероксидазы путем инкубирования ткани эндометрия человека in vitro с эстрадиолом (Е₂), что может рассматриваться в качестве прототипа предлагаемого изобретения. Авторы обнаружили, что пик АПО (увеличение активности по сравнению с базальным уровнем в 2-3 раза) отмечался через 10-12 часов от начала инкубации нормального эндометрия с Е₂. Повышение концентрации Е₂ в среде приводило к дозозависимому увеличению АПО. После прохождения отмеченного пика АПО существенно уменьшалась, и через 24 часа инкубации с Е₂ активность фермента составляла лишь около трети от исходной. В то же время, в образцах малигнизированного эндометрия при инкубации с Е₂ в течение 10 часов стимуляции АПО выявлено не было (Nawa M. et al. Response of peroxidase activity to estrogen in normal and cancer human endometrial tissue. -Nippon Sanka Fujinka Gakkai ZasshL, 1985, 37 (10), p.2131-2132; Okada H. et al. In vitro effect ofestrogens on the peroxidase activity of human endometrium. - J. Clin. Endocrinol. Metab., 1985, 61 (3), р.404-407), что оставляло открытым вопрос об эстрогенозависимости данного фермента в ткани РТМ. Следует отметить, что в вышеназванных работах не имелось сведений о рецепторном статусе новообразований и этот фактор не был поставлен в связь с отсутствием или наличием прироста АЛО в малигнизированном эндометрии при инкубации с эстрадиолом.

В то же время проведенные нами недавно исследования позволили установить зависимость АПО в опухолевой ткани от клинико-морфологических особенностей новообразования и степени эстрогенизации организма, а также выявить реакцию АПО в части исследованных образцов малигнизированного эндометрия на инкубацию с Е₂ (Васильев Д.А. и соавт., 2001 (см. выше); Васильев Д.А. Активность пероксидазы в ткани рака тела матки: связь с эстрогенизацией и клинико-морфологическими особенностями опухоли. - Автореф. дис. на соиск. учен. ст.к.м.н. СПб, 2003, 23 с.). Как следствие, принимая во внимание сведения о том, что отсутствие стероидных рецепторов в ткани РТМ в ряде случаев сочетается с позитивной реакцией на гормонотерапию (см. выше) и наши наблюдения о способности эстрогенов индуцировать увеличение АПО в опухолевой ткани, мы пришли к выводу о целесообразности разработки способа выявления скрытой эстрогеночувствительности при рецепторнегативном РТМ. Предлагаемый подход имеет своей целью выявить в каком случае опухоль, несмотря на отсутствие в ней ЭР и ПР, все-таки обладает гормонозависимостью. Обнаружение на основе такого подхода стимуляции АПО в опухолевой ткани в ответ на изменение дозы эстрадиола в краткосрочных опытах in vitro будет дополнительным основанием для назначения гормонотерапии таким больным.

Техническим результатом заявляемого изобретения является установление условий для воздействия эстрогенов (Е₂) в краткосрочных опытах in vitro на активность пероксидазы в ткани малигнизированного эндометрия.

Это достигается путем определения стимуляции АПО в малигнизированном эндометрии в опытах in vitro под влиянием Е₂ и сопоставления рецепторного статуса пациенток с эстрогеночувствительностью опухолевой ткани, выявленной подобным образом.

Материал для исследования брали сразу после операции и его аликвоты хранили в жидком азоте. АПО в опухоли (в ЕД/мг белка) определяли спектрофотометрическим методом (C.R. Lyttle and E.R. DeSombre. Uterine peroxidase as a marker for estrogen action. - Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1977, 74 (8), р.3162-3166; Васильев Д.А. и соавт., 2001 (см. выше)). Рецепторы эстрогенов и прогестерона (в фМ/мг белка) определялись по S. Saez et al. (Estradiol and progesterone receptor levels in human breast adenocarcinoma in relation to plasma estrogen and progesterone levels. - Cancer Res., 1978, 38 (10), р.3468-3473). К рецепторнегативным новообразованиям относили опухоли, в которых содержание ПР и/или ЭР не превышало 10 фМ/ мг белка.

Для изучения эстрогенозависимости РТМ путем инкубации опухолевой ткани (16 случаев) с E₂ и оценке по степени стимуляции АПО in vitro ткани переносили в лабораторию в сбалансированном солевом растворе Эрла, содержащем 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина не позже 30 минут после гистерэктомии. Ткань рассекали на 2 мм фрагменты (кубики) бритвой на холоду. Перед основной инкубацией ткань помещали в среду Игла (охлажденная среда с раствором Эрла, содержащая 10% бычью сыворотку) и проинкубировали в ней материал в течение 30 минут. Затем по 2-3 фрагмента ткани клали на гемостатическую коллагеновую губку 10×10 мм (OAO Лужский завод "Бел козин"), которую помещали в чашку Петри (10×20 мм), содержащую 10 мл среды Игла с растворенным в диметилсульфоксиде эстрадиолом (к инкубационной среде добавлялось 20 мкл раствора гормона или - в контроле - только диметилсульфоксид). Е₂ использовали в конечной концентрации 10^-7 и 10^-6 М. Чашки инкубировали в атмосфере 95% воздуха и 5% CO₂ при 37°С в течение 4-8 часов.

После завершения инкубации материал извлекали из чашек Петри, просушивали на фильтровальной бумаге и помещали в жидкий азот до определения АПО в исследуемых тканях по вышеуказанному методу.

При рецепторнегативном статусе опухоли и стимуляции эстрадиолом АПО в малигнизированном материале можно говорить о наличии скрытой эстрогеночувствительности ткани эндометрия. В качестве иллюстрации приводим примеры конкретных наблюдений за индивидуальными значениями полученных показателей.

Пример 1. Опухоль у больной А (Ч-ва Э.К., 66 лет, T_1cN₁M₀G₃) имела рецепторнегативный статус (ЕР=4, ПР=4), однако при проведении пробы со стимуляцией АПО различными дозами эстрадиола in vitro обнаружена стимуляция активности этого фермента. АПО без инкубации и при инкубации без добавления Е₂ равнялась соответственно 210 и 192 ЕД/мг белка, а при добавлении Е₂ в концентрации 10^-7 и 10^-6 М - 294 и 351 ЕД/мг белка соответственно.

Пример 2. Больная Б (Щ-на Л.А., 50 лет, T_1cN₀M₀G₃), у которой тоже несмотря на отсутствие в опухоли стероидных рецепторов (ЕР=6, ПР=4) обнаружена зависимая от концентрации эстрадиола стимуляция АПО. Без инкубации и при инкубации без добавления Е₂ АПО в опухоли равнялась 306 и 307 ЕД/мг белка, а при добавлении E₂ в концентрации 10^-7 и 10^-6 М - 340 и 1077 ЕД/мг белка соответственно. С другой стороны, у нескольких пациенток при рецепторнегативном РТМ не выявлялась стимуляция АПО в опухоли при инкубации ткани с эстрадиолом в опыте in vitro.

Пример 3. Больная С (К-ва Е.П., 64 года, T_1bN₀M₀G₂), уровень ЕР=4, а ПР=4. АПО в опухоли до инкубации и после инкубации без Е₂ равнялась 318 и 196 ЕД/мг белка, а при добавлении Е₂ в концентрации 10^-7 и 10-6М 143 и 239 ЕД/мг белка соответственно.

Таким образом, у пациенток А и Б, несмотря на наличие рецепторнегативного РТМ, выявлялась стимуляция АПО в опухоли под воздействием эстрадиола, что может свидетельствовать о скрытой эстрогенозависимости опухолевой ткани у данных больных. Надо отметить, что у пациентки А выявлен андроидный тип жироотложения (соотношение объема талии к объему бедер равнялось 0,87) и позднее начало месячных (с 17 лет), а у больной Б отмечена гиперплазия яичников, что может свидетельствовать о скрытой гормонозависимости новообразования у этих больных и соответствует результатам представленных наблюдений.

В итоге, определение АПО в малигнизированном эндометрии в in vitro тесте со стимуляцией эстрадиолом (в концентрации 10^-7 и 10^-6 M) следует расценивать как метод оценки скрытой гормонозависимости РТМ, прежде всего, в случае рецепторнегативного новообразования. При использовании предлагаемого способа выявления скрытой эстрогеночувствительности рака тела матки создаются условия для оценки применительно к каждому отдельному больному вероятности позитивного ответа на гормонотерапию, несмотря на отрицательный уровень стероидных рецепторов.

Изобретение относится к лабораторным методам диагностики и может быть использовано в области онкоэндокринологии и онкогинекологии для выявления скрытой эстрогеночувствительности при рецепторнегативном раке тела матки. Сущность изобретения состоит в том, что в опухолевой ткани определяют активность пероксидазы, до и после инкубации с эстрадиолом в концентрации 10^-7 и 10^-6 М, и при приросте активности пероксидазы выявляют скрытую эстрогеночувствительность опухоли. Техническим результатом является разработка способа, позволяющего выявить скрытую эстрогеночувствительность при рецепторнегативном раке тела матки и оценить вероятность позитивного ответа на гормонотерапию.

Способ выявления скрытой эстрогеночувствительности при рецепторнегативном раке тела матки, отличающийся тем, что в опухолевой ткани определяют активность пероксидазы до и после инкубации с эстрадиолом в концентрации 10^-7 и 10^-6 М и при приросте активности пероксидазы выявляют скрытую эстрогеночувствительность опухоли.