СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТРОЙ ФАЗЫ СТАФИЛОКОККОВОГО СРЕДНЕГО ОТИТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/48 G01N33/49 G01N33/52 G01N33/68 

Изобретение относится к экспериментальному разделу медицины, к способам прижизненного определения объективных показателей остроты воспалительного процесса в среднем ухе у кроликов с экспериментальным стафилококковым средним отитом при проведении исследований.

У больных острым средним отитом остроту воспалительного процесса в среднем ухе можно установить по анамнезу, жалобам, проявлению клинических симптомов заболевания и состоянию отоскопической картины [4]. Клинические проявления острого экспериментального стафилококкового среднего отита (ЭСОСО) у подопытных животных не ярко выражены и не позволяют достоверно определить острую фазу воспалительного процесса в среднем ухе.

В.А. Долгов проводил работу с кроликами, у которых был вызван острый экспериментальный стафилококковый средний отит, и отметил, что острую фазу заболевания можно установить путем проведения патоморфологического исследования слизистой оболочки барабанной полости (СОБП) [3].

Изучение патоморфологических изменений в СОБП в динамике отита (на 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 сутки) показало, что в начале заболевания (1-2 сутки) воспалительные изменения проявлялись только в соединительной ткани и выражались в расширении просвета кровеносных сосудов, отечности стромы и инфильтрации ее лейкоцитами. Наибольшей остроты воспалительный процесс достигал на 3 и 4 сутки ЭСОСО и проявлялся значительными деструктивными изменениями не только в соединительной ткани, но и в эпителии СОБП. На 5-6-7 день отита, наряду с продолжающимися альтеративными изменениями в соединительной ткани отмечались пролиферативные процессы в эпителии слизистой оболочки.

Однако для проведения подобного рода исследований необходимо выводить животного из опыта, что не всегда совпадает с задачей проводимого эксперимента.

Новизной настоящего изобретения является определение острой фазы воспалительного процесса в среднем ухе подопытных животных по уровню лактоферрина в носовой слизи и активности бета-лизинов в сыворотке крови.

Существенным отличием изобретения является то, что острую фазу воспалительного процесса в среднем ухе кроликов при остром экспериментальном стафилококковом среднем отите, которая приходится на 3-4 день заболевания, определяют прижизненно, по уровню лактоферрина в носовой слизи и степени активности бета-лизинов в сыворотке крови: при концентрации лактоферрина, 119,8±1,6 нг/мл (при норме - 86,2±1,4 нг/мл, Р<0,01) и активности бета-лизинов 69,4±0,4% (норма у здоровых - 54,8±1,7%, Р<0,01) судят об острой фазе воспалительного процесса в среднем ухе.

Для сравнения динамики патоморфологических изменений в СОБП с уровнем иммунологических показателей (лактоферрина в носовой слизи и бета-лизинов в сыворотке крови) проведено комплексное их исследование на модели острого экспериментального стафилококкового среднего отита у кроликов.

Способ включал 4 этапа исследования:

1. Создание модели острого стафилококкового среднего отита у кроликов.

2. Изучение патоморфологических изменений в СОБП в динамике ЭСОСО.

3. Определение концентрации лактоферрина в носовой слизи до воспроизведения отита и на разных сроках его развития.

4. Определение активности бета-лизинов в сыворотке крови здоровых животных и в динамике экспериментального отита.

Острый средний отит был вызван у 37 взрослых кроликов породы шиншилла весом от 2 до 3 кг. При воспроизведении острого среднего отита у животных за основу была взята методика Я.Л.Готлиба (1966), но вместо собак мы использовали для опыта кроликов [2]. Кроме того, был упрощен процесс воспроизведения отита у животных. Перед введением инфекционного агента в барабанную полость мы не производили ампутации ушной раковины и ограничивались одноразовым введением 1,0 мл 5 млрд. взвеси суточной культуры золотистого стафилококка, что являлось вполне достаточным для развития острого воспалительного процесса в среднем ухе. В качестве возбудителя заболевания использовали стафилококк, учитывая значительный удельный вес данного микроорганизма в этиологии острых средних отитов [5]. Причем использовали не лабораторный штамм стафилококка, а выделенный от больного острым гнойным средним отитом. Контрольную группу составили 9 здоровых животных.

Патоморфологические изменения в слизистой оболочке барабанной полости изучены у 27 кроликов с ЭСОСО и 9 здоровых животных. В первые 7 суток ЭСОСО эти исследования проводились ежедневно, затем на 18 и 30 день. Для получения СОБП подопытные животные выводились из опыта путем введения 5 см³ воздуха в ушную вену, после чего производились операции на среднем ухе с отсепаровкой и удалением СОБП. Полученную ткань фиксировали в 10% нейтральном формалине и через 24 часа заливали парафином. Гистосрезы толщиной 6-8 мкм, изготовленные на ротационном микротоме, после депарафинирования окрашивались гематоксилином Майера и эозином. Исследования проводились на светооптическом уровне при увеличении ×280, ×630.

Иммунологические показатели: уровень лактоферрина в носовой слизи и активность бета-лизинов в сыворотке крови были изучены у 9 здоровых животных перед проведением патоморфологаческих исследований СОБП и у 37 - с эксперимеятальным средним отитом в динамике (1 день, 3-4 день, 6-7 день, 18 и 30 сутки). Причем у 27 кроликов иммунологические показатели изучались в указанные сроки перед проведением патоморфологических исследований СОБП и у 10 - прижизненно в процессе развития и течения ЭСОСО.

Определение содержания в носовой слизи уровня лактоферрина, являющегося важным маркером воспалительного процесса, выбрано неслучайно. Среднее ухо и носовая полость - два сообщающихся между собой (через слуховую трубу) пограничных анатомических отдела. Имеются сведения, указывающие на значение состояния верхних дыхательных путей и, в частности, носовой полости и носоглотки в этиологии средних отитов [7, 9]. Естественно предположить и обратное: влияние динамики воспалительного процесса в среднем ухе на характер изменений показателей неспецифической защиты (лактоферрина) в слизистом содержимом носовой полости.

Достаточно информативным тестом, отражающим характер течения воспалительного процесса в организме, является показатель активности бета-лизинов в сыворотке крови [8].

Концентрация лактоферрина в носовой слизи определялась иммуноферментным анализом с использованием тест-систем "Вектор-Бест" (Россия) и обозначалась в нг/мл [6]. Слизь из носа получали путем вымывания ее из левой и правой ноздри кроликов 4 мл стерильного физиологического раствора. Активность бета-лизинов в сыворотке крови определялась фотонефелометрическим методом (О.В.Бухарин, Б.А.Фролов, А.П.Луда, 1972) и выражалась в процентах [1]. Кровь для исследования получали из сердца в количестве 3-4 мл перед заражением и на разных сроках развития экспериментального отита.

У здоровых кроликов слизистая оболочка барабанной полости тонкая и представлена соединительной тканью. Концентрация лактоферрина в носовой слизи составляла 86,2±1,4 нг/мл, активность бета-лизинов в сыворотке крови -54,8±1,7% (таблица №1).

У всех инфицированных кроликов на ачедующий день развивалась клиника острого среднего отита, которая проявлялась беспокойным поведением животного, почесыванием лапой больного уха, гаперемией и инфильтрацией слизистой оболочки барабанной полости и оставшейся части перепонки. Структура эпителия не изменялась, но в соединительной ткани появлялись расширенные кровеносные сосуды. Уровень лактоферрина в носовой слизи был равен 87,8±1,8 нг/мл, активность бета-лизинов в сыворотке крови составляла 60,3±1,9%.

Наибольшего развития воспалительный процесс в среднем ухе достигал на 3-4 сутки. Слизистая оболочка барабанной полости была резко отечна с выраженными явлениями деструкции эпителия и соединительной ткани. Инфильтрация соединительной ткани большим количеством клеток вызывала расслоение волокон и их гибель. Концентрация лактоферрина в носовой слизи и активность бета-лизинов в сыворотке крови составляли соответственно: 119,8±1,6 нг/мл (Р<0,01) и 69,4±0,4% (Р<0,01).

На 6-7 день заболевания острота воспалительного процесса в среднем ухе подопытных животных снижалась. В эпицентре воспаления эпителий погибал, по периферии пролиферировал, в силу чего приобретал строение многорядного. Концентрация лактоферрина была равна 92,2±3,6 нг/мл, активность бета-лизинов - 59,0±1,8%.

На 18 и 30 день отита воспалительный процесс в среднем ухе приобретал характер подострого течения: эпителий становился многослойным, в соединительной ткани вместе с фибробластами отмечалось большое количество лимфоидных элементов и плазматических клеток. Показатели активности лактоферрина в носовой слизи на эти сроки были соответственно равны 93,5±2,8 нг/мл и 94,4±1,9 нг/мл - бета-лизинов: 58,4±3,4% и 59,3±2,9%.

Результаты проведенного исследования показали, что острая фаза воспалительного процесса в среднем ухе, проявляющаяся выраженной деструкцией эпителия и соединительной ткани слизистой оболочки барабанной полости на 3-4 день заболевания, достоверно характеризуется высокой концентрацией лактоферрина в носовой слизи и позволяет использовать данные иммунологические показатели в определении острой фазы отита в эксперименте.

Положительным эффектом настоящего способа является то, что острая фаза воспалительного процесса в среднем ухе при экспериментальном стафилококковом отите устанавливается прижизненно. по наибольшему уровню лактоферрина в носовой слизи и активности бета-лизинов в сыворотке крови.

Литература

1. Бухарин О.В., Фролов Б.А., Луда А.П. Ускоренный метод определения бета-лизинов в сыворотке крови //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1972, №9. - С.42-44.

2. Готлиб Я.Л. Эксапериментальная модель хронического гнойного воспаления среднего уха у собак //Сб. трудов Ленинградского НИИ уха, горла, носа и речи. Л., 1966, т.14 - С.151-157.

3. Долгов В.А. Патоморфологические изменения слизистой оболочки барабанной полости при экспериментальном среднем отите //Сборник научных трудов. Оренбург. 2000 - С.53-55.

4. Мишенькин Н.В. Острое воспаление среднего уха //Руководство по оториноларингологии. М., Москва. 1994 - С.92-101.

5. Миронов А.Ю., Савицкая К.И., Воробьев А.А., Нестеров M.B. Микрофлора при заболеваниях лор-органов и нервной системы у больных региона Московской области //Вестник оториноларингологии. 2001. - №4 - С.31-35.

6. Офицеров В.И., Юркина Э.А., Ткаченко Т.Н. Лактоферрин - стрип //Инструкция по применению. Новосибирск - 2002, 23с.

7. Розенфельд И.М. Острое воспаление среднего уха у взрослых и детей. Мастоидит. Антрит. Петрозит. // Руководство по оториноларингологии. М., Москва, 1960 - т.2 - С.137-211.

8. Сударева Т.И. Характеристика факторов естественной резистентности организма при стафилококковой пневмонии. Автореф. дис.... канд. мед. наук. - Челябинск, - 1977 - 13 с.

9. Тарасов Д.И., Федорова О.К., Быкова В.П. Заболевания среднего уха. - М., Москва. 1988. - 286 с.

Изобретение относится к экспериментальному разделу медицины, к способу прижизненного определения острой фазы стафилококкового среднего отита в эксперименте при проведении исследований. Способ заключается в том, что на 3-4 день экспериментального стафилококкового острого среднего отита исследуют концентрацию лактоферрина в носовой слизи и активность бета-лизинов в сыворотке крови подопытных кроликов и при концентрации лактоферрина 119,8±1,6 нг/мл (норма 86,2±1,4 нг/мл) и активности бета-лизинов 69,4±0,4% (норма 54,8±1,7%) судят об острой фазе воспалительного процесса в среднем ухе. Способ обеспечивает прижизненное установление экспериментального стафилококкового отита. 1 табл.

Способ определения острой фазы стафилококкового среднего отита в эксперименте, включающий исследования животных в динамике, отличающийся тем, что в 3-4 день отита прижизненно исследуют концентрацию лактоферрина носовой слизи и активность бета-лизинов в сыворотке крови и при концентрации лактоферина 119,8±1,6 нг/мл, норма 86,2±1,4 нг/мл, и активности бета-лизинов 69,4±0,4%, норма 54,8±1,7%, судят об острой фазе воспалительного процесса в среднем ухе.