СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТАФИЛОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к медицине и микробиологии и может быть использовано во всех областях, касающихся медицины при установлении диагноза и идентификации возбудителя.

В течение последних десятилетий диагностика и лечение заболеваний, сопровождающихся стафилококковой инфекцией, остается нерешенной проблемой практического здравоохранения. Обусловлено это значительным распространением возбудителя в окружающей среде (94,4 - 97,3% детей при выписке из роддома являются носителями патогенных стафилококков), выраженной устойчивостью стафилококков к воздействию неблагоприятных факторов, трудностью диагностики, широким диапазоном клинических проявлений - от стертых бессимптомных до тяжелых генерализованных форм, склонностью к затяжному и хроническому течению, снижением чувствительности к антибиотикам в связи с появлением антибиотикоустойчивых штаммов стафилококков, изменением биологических свойств, усилением их патогенности и вирулентности. Стафилококковая инфекция занимает первое место в этиологии и острых и хронических форм таких заболеваний, как гайморит, отит, пневмония, тонзиллит, бронхит, инфекционно-аллергическая бронхиальная астма, менингит, сепсис, пиелонефрит, остеомиелит, гнойные поражения кожи и подкожной клетчатки. Более того, обладая выраженной антигенной активностью, стафилококк сенсибилизирует организм, являясь "пусковым фактором" для возникновения экземы, нейродермита, псориаза. Так, в патогенезе истинной экземы роль сенсибилизации к стафилококковым аллергенам, поступающим из очагов фокальной инфекции, не вызывает сомнения. Для выявления аллергии к пиококкам применяют многочисленные аллергологические и иммунологические способы диагностики как in vitro, так и in vivo. Обилие способов диагностики свидетельствует о том, что ни один из них не имеет самостоятельного значения и должен использоваться в сочетании с другими способами и с учетом клинической картины и анамнеза болезни.

Известен способ диагностики стафилококковой инфекции с использованием реакции пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА). (Долматов В.В. Диагностика стафилококковых заболеваний у детей и взрослых: Метод рекомендации. - М., 1989, - 3-10 с.). В основу ее положен способ непрямой гемагглютинации по Бойдену. Суть реакции заключается в том, что на эритроцитах адсорбируют стандартный стафилококковый L-токсин и в присутствии соответствующей сыворотки происходит агглютинация эритроцитов. Антигеном в РПГА могут служить антигены стафилококка, полученные путем ультразвуковой дезинтеграции, нативный стафилококковый анатоксин.

Способ обладает невысокой чувствительностью (реакция положительна в 6-40% случаев у больных стафилодермиями; в 50% - при гастроэнтероколите, в 82,5% - при сепсисе); малоинформативен при выявлении остроты и тяжести заболевания, не дает представления о сенсибилизации организма стафилококками.

За прототип нами принят способ диагностики стафилококковой инфекции (Силич В. А. Затяжное, рецидивирующее и хроническое течение стафилококковой инфекции и ее диагностика. - Киев.: Здоровья, 1991. - 35-39 с.), включающий выявление в сыворотке крови антител к токсинам стафилококка. Для постановки реакции берут 0,5 мл сыворотки крови больного и стандартный L-токсин стафилококка (СААТ) в количестве 0,1 мл. Отбирают 0,3 мл взвеси в другую пробирку. Инкубируют первую пробирку 1 час при 37^oC в термостате, а вторую при 4^oC в холодильнике. В качестве контроля используют стандартную сыворотку. Затем все пробирки фотометрируют; бактериостатическую активность сыворотки крови (БАСК) вычисляют по формуле. БАСК характеризует способность организма сопротивляться стафилококковой инфекции.

К недостаткам способа, кроме отмеченных в аналоге, можно отнести
- необходимость неоднократного исследования крови у одного и того же больного для установления диагноза ввиду чрезвычайно широкого предела индивидуальных норм;
- невозможность применения у детей: даже при наличии стафилококковой инфекции содержание СААТ остается в пределах нормы, т.к. организм детей обладает малой способностью к выработке этих антител;
- отчетливая зависимость от формы заболевания: при тонзиллите и риносунусите уровень СААТ повышен, а при гнойном отите титры СААТ остаются в пределах нормы, несмотря на неоднократное выделение золотистого стафилококка из отделяемого среднего уха (при отите стафилококки в меньшей степени образуют L-токсин, продуцируя больше другие токсины (лейкоцидин);
- отсутствие корреляции с периодом заболевания. При остром процессе выявляется низкое содержание СААТ (не диагностически значимое), которое повышается к моменту выздоровления. При хронических болезнях из-за истощения иммунного ответа СААТ также мал. Таким образом, способ характеризуется достоверностью и является ненадежным в диагностике.

Задачи изобретения: разработка щадящего экспресс способа диагностики стафилококковой инфекции у детей и взрослых, обладающего чувствительностью, достоверностью, способностью коррелировать с тяжестью заболевания, информативного в отношении сенсибилизации организма больного.

Сущностью изобретения является исследование крови in vitro, предварительное выделение лимфоцитов, введение в пробу живой суточной культуры стафилококка, инкубирование в течение 3-х часов и после окрашивания по проценту клеток, присоединившихся к своей мембране 5 и более клеток микроорганизмов, определение наличия стафилококковой инфекции и степень сенсибилизации.

Способ выполняют следующим образом.

Берут кровь из локтевой вены пациента в пробирку in vitro с трилоном Б (5 мкг Na 2 ЭДТА на 5 мл крови. Тщательно перемешивают кровь с сухим порошком Na 2 ЭДТА путем осторожного покачивания пробирки из стороны в сторону в течение 30-60 сек для того, чтобы получить однородную (гомогенную) суспензию. Наслаивают эту кровь на 1,5-2 мл смеси фиколл-верографин (d - 1,077 г/мл). Центрифугируют эту смесь 35-40 мин при 1500 об/мин. Выделяют кольцо лимфоцитов и переносят его в пробирку Флоринского. Дважды отмывают лимфоциты средой 199 или забуференным физраствором. Осадок лимфоцитов ресуспендируют в 1 мл среды 199 или забуференного физраствора, готовят рабочую концентрацию основных ингредиентов реакции (0,5 млрд. микробных тел стафилококка и 2•10⁶ лимфоцитов в 1 мл). К 0,1 мл лимфоцитов приливают 0,1 мл живой культуры стафилококка в рабочей концентрации. Инкубируют смесь в термостате при 37^oC в течение 150 мин. Продолжают инкубацию при комнатной температуре еще в течение 30 мин. Осаждают образовавшиеся комплексы центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин. Розетки фиксируют добавлением 0,05 мл 0,6% раствора глютаральдегида на 15 мин. Фиксацию прекращают после добавления 0,5 мл дистиллированной воды. Центрифугируют суспензию в течение 5 мин при 1000 об/мин. Сливают надосадочную жидкость, к осадку приливают 0,1 мл физраствора и тщательно пипетируют. Переносят содержимое пробирки на обезжиренное стекло, делают мазок, высушивают его при комнатной температуре, фиксируют метиловым спиртом и окрашивают 0,5% раствором сафранина в 0,25% растворе буры, а ядро докрашивают 1% раствором бриллиантовой зелени. Учет результатов реакции розеткообразования производят под иммерсией, отсчитывают 200 клеток (лимфоцитов), вычисляют % клеток, присоединивших к своей мембране 5 и более клеток микроорганизма, которые считают розеткообразующими.

Эмпирическим способом выявлено, что степень сенсибилизации определяют под микроскопом путем подсчета % клеток, присоединивших к своей мембране 5 и более клеток микроорганизмов, при этом в случае, если % присоединивших клеток составлял для S. aureus 15,28±1,01%, для S. epidermidis 26,56±1,06, определяли нормальное состояние. При увеличении этого уровня для S. aureus и S. epidermidis выявляют патологию. Причем чем выше этот уровень, тем выше сенсибилизация, и инфекция более устойчива.

Вся процедура выполнения данной диагностики занимает по времени 3,5 часа (табл. 1, 2).

Вывод: из таблицы 1 видно, что предлагаемый способ имеет преимущество по всем вышеперечисленным параметрам и лишен недостатков прототипа.

Вывод: из таблицы 2 видно, что у больных, страдающих стафилококковыми заболеваниями, повышается уровень сенсибилизации к стафилококкам, причем клинически отмечается корреляция степени сенсибилизации и тяжести заболевания.

Способ апробирован в стационарных условиях в краевом кожно-венерологическом диспансере г. Краснодара.

Пример 1. Больной Т., 22 года, госпитализирован в феврале 1997 года в Краснодарский краевой кожно-венерологический диспансер с диагнозом истинная экзема в стадии обострения. Сопутствующее заболевание: хронический тонзиллит. При поступлении больной предъявлял жалобы на мокнутие и зуд в области верхних конечностей в течение 2-х лет. Впервые экзема проявилась после сильных переживаний на службе в Армии. Ангинами болеет с детства 2-3 раза в год. Неоднократно лечился у дерматолога по месту жительства, однако рецидивы продолжались по 2-3 раза в год. Состоит на диспансерном учете у ЛОР-врача. В день поступления взята кровь in vitro на реакцию специфического розеткообразования: суспензию лимфоцитов, выделенную на выделенную на градиенте фиколл-верографин (0,1 мл), соединили с равным объемом суточной культуры стафилококков. Инкубировали 2 ч 30 мин при температуре 37^oC и 30 мин при комнатной температуре, осадили центрифугированием в течение 5 мин при 200 g. Образовавшиеся розетки зафиксировали 0,05 мл 0,6% раствора глутарового альдегида в течение 15 минут при комнатной температуре. Фиксацию прекратили добавлением в пробирку 0,5 мл дистиллированной воды, центрифугировали 5 минут, супернатант слили. В осадок добавили 0,1 мл 0,85 раствора NaCl и осторожно ресуспендировали пастеровской пипеткой. На обезжиренном предметном стекле подготовили препарат, который после подсушивания окрасили 0,5% раствором сафранина с последующим докрашиванием 1% спиртовым раствором бриллиантовой зелени. Определили процент лимфоцитов, присоединивших к себе стафилококки: средняя степень сенсибилизации составила для S. aureus - 38,28 + 1,01% (644,9 + 32,21), для S. epidermidis - 40,59 + 1,06 (1200,19 + 49,87). На двенадцатый день лечения с учетом воздействия на очаг фокальной инфекции и стафилококковую сенсибилизацию (абакталом и стафилопротектином) кожный процесс полностью регрессировал. Результаты повторных обследований демонстрировали нормализацию большинства иммунологических показателей. Реакция специфического розеткообразования со S. aureus - 15,29 + 1,02 (344,9 + 32,21), со S. epidermidis - 26,58 + 1,06 (600,19 + 49,87).

Вывод: т. о. выздоровление больного сопровождалось снижением количества розеткообразующих клеток и нормализацией сенсибилизации.

Пример 2. Больной А., 34 лет госпитализирован в ноябре 1997 года в КККВД с диагнозом истинная экзема в стадии обострения. Из сопутствующих заболеваний: рецидивирующий гнойный отит справа. При поступлении больной жаловался на мокнутие и зуд в области верхних и нижних конечностей. Более 7 лет рецидивы 1-2 раза в год. Начало заболевания ни с чем не связывает. Отит обостряется 3-4 раза в год в течение 4 лет. Не раз обращался к отоларингологу, который назначал традиционное лечение. В день поступления у больного in vitro взята венозная кровь на количество антигензависимых розеткообразующих клеток. Живую суточную культуру стафилококков соединили с равным количеством (0,1 мл) лимфоцитов. Инкубировали при 37^oC 2 ч 30 мин и 30 мин при комнатной температуре, розетки осадили центрифугированием и фиксировали 0,6% раствором глутарового альдегида. Препарат перенесли на стекло и окрасили 0,5% раствором сафранина и 1% раствором бриллиантовой зелени. Подсчет розеток произвели под иммерсией. Выявлен высокий уровень сенсибилизации со S. aureus - 45,61 + 7,15%, со S. epidermidis - 51,77 + 9,13. Назначено лечение, включающее коррекцию микробной аллергии. На восемнадцатый день госпитализации имелись только гиперпигментированные пятна на месте бывших очагов Произведены контрольные исследования крови: реакция специфического розеткообразования с золотистым стафилококком - 20,17 + 1,04%, с эпидермальным стафилококком-31,22+ 1,07%.

Вывод: нормализация количества розеткообразующих клеток сопровождалась клиническим выздоровлением.

Таким образом, предлагаемый способ диагностики обеспечивает сокращение времени постановки диагноза на 87,7%, позволяя раньше начать лечение, и экономит трудочасы медперсонала. Способ обладает высокой чувствительностью, предотвращает диагностические ошибки; дает возможность осуществлять клинико-иммунологический контроль за качеством проведенных манипуляций, предупреждает возникновение возможных рецидивов, а следовательно, значительно повышает терапевтический и экономический эффект.

Разработанный способ диагностики прост и доступен для широкого применения в условиях стационара и амбулатории.

Изобретение относится к медицине и микробиологии и может быть использовано при установлении диагноза и идентификации возбудителя стафилококковой инфекции. Способ основан на исследовании крови. В предварительно выделенные лимфоциты вводят живую суточную культуру стафилококка. Инкубирование осуществляют в течение 3 ч. После окрашивания по проценту клеток, присоединивших к своей мембране 5 и более клеток микроорганизмов, определяют наличие стафилококковой инфекции и степени сенсибилизации. Способ диагностики обеспечивает сокращение времени постановки диагноза на 87,7%, позволяя раньше начать лечение, и экономит трудочасы медперсонала, обладает высокой чувствительностью, предотвращает диагностические ошибки, дает возможность осуществлять клинико-иммунологический контроль за качеством медицинских манипуляций, предупреждает возникновение возможных рецидивов. 2 табл.

Способ диагностики стафилококковой инфекции, включающий исследование крови in vitro, отличающийся тем, что из крови предварительно выделяют лимфоциты, вводят в пробу живую суточную культуру стафилококка, в течение 3 ч инкубируют и после окрашивания по проценту клеток, присоединивших к своей мембране 5 и более клеток микроорганизмов, определяют наличие стафилококковой инфекции и степень сенсибилизации.