СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ ПРИ КОЛИБАКТЕРИОЗЕ ПТИЦ Российский патент 2006 года по МПК A61K39/108 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к приготовлению диагностических препаратов, и может быть использовано для определения наличия группового иммунитета при вакцинации птиц против колибактериоза.

Известен способ изготовления антигена для реакции агглютинации (РА) при диагностике данного заболевания (См. Радчук Н.А. "Колибактериоз птиц" - Л., Агропромиздат. Ленинградское отделение, 1990).

Недостатком его является то, что антиген, получаемый указанным способом, вследствие недостаточного содержания микробного белка и полисахарида обладает слабой чувствительностью.

В то же время в сыворотке крови птиц содержание общего белка составляет 7,3-9,0%, а сахаров - до 80 мг%.

Такое несоответствие приводит к тому, что при исследовании сыворотки крови при колибактериозе птиц путем постановки РА читка и оценка ее даже у явно больных становится затруднительной из-за нечетко выраженной реакции, поскольку при этом образуется мелкозернистый агглютинат.

Известно, что наличие белка в антигене обуславливает иммуногенность, а полисахарид является компонентом, определяющим его специфичность.

Целью данного изобретения является разработка способа приготовления антигена, при котором повышается его чувствительность и специфичность с одновременным упрощением технологии изготовления.

Для приготовления антигена выделенную нами 20-часовую культуру E.coli (в данном случае серовар О₂, один из представителей возбудителя, имеющий преимущественное распространение в регионе) смывают стерильным изотоническим раствором хлорида натрия в сухую стерильную колбу, доводят до концентрации 4 млрд/мл, пользуясь стандартом мутности, затем бакмассу кипятят в водяной бане в течение часа.

Во время прогревания взвеси в колбе не должны образовываться хлопья, что подтверждает использование для приготовления антигена молодых микробных клеток, находящихся в S-форме. После охлаждения до температуры 35-40°С к полученному объему антигена добавляют детергент "Ласка" (средство моющее синтетическое "Ласка магия бальзама" - ТУ 2381-009-04831040-96) и выдерживают в термостате при вышеуказанной температуре в течение одного часа, периодически перемешивая.

Выбор детергента "Ласка" обусловлен тем, что он отечественного производства и содержит в своем составе анион и нейтрально-поверхностно-активные вещества, мягчитель, антиресорбент, силикат натрия, соду, сульфат натрия и т.д. Данные ингредиенты придают значительную буферную емкость приготовляемому антигену, в результате чего рН при этом остается в благоприятных условиях, способствуют лучшему и более полному извлечению белка и полисахарида из микробной клетки.

Наличие в нем антиресорбента позволяет при постановке РА поддерживать антиген в равномерно взвешенном состоянии.

Полученные данные по определению содержания белка, полисахарида, рН по прописи прототипа и предлагаемого антигена из серовара О₂ E.Coli представлены в таблице 1.

Таблица 1Результаты определения химического состава антигенов для РА, полученных разными способамиНаименованиеОбщий белок %Полисахарид (мг%)рН(ед.)Антиген, приготовленный по прописи прототипа3,4851,06,0Антиген, приготовленный с добавлением 0,5% детергента "Ласка"9,0354,07,0Антиген, приготовленный с добавлением 1% детергента "Ласка"9,8980,08,0

Из приведенных результатов видно, что добавление 1% детергента к антигену приводит к лучшему извлечению белка, полисахарида и повышению рН.

Для выяснения реакции взаимодействия между предлагаемым антигеном и агглютинирующими E.coli коли сыворотками, приготовленными в биофабричных условиях, поставили пробирочную РА в соответствии с наставлением по их применению, утвержденным Департаментом ветеринарии от 19.05.1998 г.

Серологические реакции ставились с использованием О₁, О₂ и О₇₈ агглютинирующих сывороток, из которых О₂ являлся гомологичным к данному антигену, а О₁ и О₇₈ - гетерологичными.

Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2Результаты проверки активности нового (предлагаемого нами) антигена для РАНаименование сероваров E.coliРазведения агглют. сыворотокПредельный титр, указ. на биофабр. флак.1:501:1001:2001:4001:8001:16001:32001:64001:12800О₁++++++++++++++++++++++1:6400О₂+++++++++++++++++++++++++++-1:3200О₇₈+++++++++++++++++++++++++++++1:6400

Интенсивность реакции учитывалась в крестах. Из вышеприведенных данных видно, что чувствительность приготовленного нами антигена на порядок выше. При взаимодействии с гомологичной агглютинирующей сывороткой он дает положительную реакцию во всех разведениях с оценкой "четыре" и "три" креста в титре вплоть до 1:6400, хотя предельный титр сыворотки, указанный на флаконе, составляет 1:3200. С гетерологичными сыворотками он также дает положительные реакции различной интенсивности - от "четырех" до "одного" креста. Последние отмечались в разведении 1:12800 при предельном титре 1:6400.

Приготовленный антиген из серовара О₂ Е.coli по прописи прототипа давал положительную РА с гомологичной сывороткой в титре 1:1600 с оценкой "один" крест и гетерологичными сыворотками - в разведении 1:400-1:800 при интенсивности в "два" и "один" креста (табл.3).

Таблица 3Результаты проверки антигена для РА по прописи прототипаНаименование сероваров Е.coliРазведения агглютинирующих сыворотокПредельн. титр, указ. на био-фабр. флак.1:501:1001:2001:4001:8001:16001:32001:64001:12800О₁++++++++++----1:6400О₂+++++++++++++++---1:3200О₇₈+++++++++++-----1:6400

Специфичность предлагаемого нами антигена (№1), приготовленного из серовара О₂ Е.coli, проверена путем исследования сывороток крови, взятых от здорового поголовья цыплят-бройлеров и от больных колибактериозом, в сравнении с антигеном (№2),описанным в прототипе (табл.4).

Таблица 4Результаты проверки специфичности антигеновВозраст птицепоголовья в дняхКол-во пробАнтигенРеагировало в РАВсего положит.1:501:1001:2001:40037 (больные)10№1+++++++++++++++10№2++++--237 (здоровые)5№1-----№2-----

Кроме того, для уточнения специфичности предлагаемого и описанного в прототипе антигенов в РА на стекле использовалась и О-комплексная агглютинирующая сальмонеллезная сыворотка с рецепторами 4, 7, 8, 9, 10, 15, 19, выпускаемая Краснодарской биофабрикой.

В данном случае оба антигена с указанной сывороткой при смешивании на стекле образовывали гомогенную взвесь, т.е. давали отрицательные реакции.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии. Проводят выращивание микробной культуры возбудителя колибактериоза на питательной среде. Затем смывают бактериальную массу изотоническим раствором хлорида натрия и инактивируют. Затем к бактериальной массе добавляют средство моющее синтетическое "Ласка магия бальзама" в количестве 1% и выдерживают полученную смесь при температуре 35 - 40°С в течение одного часа. Способ позволяет повысить чувствительность и специфичность антигена с одновременным упрощением технологических операций, связанных с его изготовлением. 4 табл.

Способ получения антигена для реакции агглютинации при колибактериозе птиц, включающий выращивание микробной культуры возбудителя колибактериоза, смыв бактериальной массы изотоническим раствором хлорида натрия и инактивацию, отличающийся тем, что после инактивации к бактериальной массе добавляют средство моющее синтетическое "Ласка магия бальзама" в количестве 1% и выдерживают полученную смесь при температуре +35 - +40°С в течение одного часа.