ЖИВАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ КОЛИБАКТЕРИОЗА СВИНЕЙ Российский патент 2005 года по МПК A61K39/108 C12N1/20 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для получения живых вакцин против колибактериоза сельскохозяйственных животных.

Колибактериоз (эшерихиоз) - инфекционная болезнь, вызываемая энтеропатогенными эшерихиями, широко распространен во многих странах мира и наносит значительный экономический ущерб животноводству за счет высокой смертности телят и поросят.

Известна вакцина против колибактериоза сельскохозяйственных животных (см. патент РФ №1149466 по кл. А 61 К 39/108, опуб. 10.12.95), содержащая антигены эшерихий, консервант на основе формалина, адъювант, бульон Хоттингера и физиологический раствор. Вакцина изготовлена на основе штаммов, продуцирующих термолабильные и термостабильные токсины, обладает выраженными антигенными свойствами, широким спектром иммуногенности.

Однако эффективность данной вакцины невысока, поскольку она, являясь инактивированной, теряет свою иммуногенность при инактивации. Кроме этого, изготовление данной вакцины требует значительных трудозатрат, и она является дорогостоящей, так как предусматривает использование нескольких штаммов.

Известна также живая вакцина против колибактериоза сельскохозяйственных животных для внутримышечного введения (см. Wilson R.A., Jotila J.W. Experimental neonatal colibacillosis caws. Serological studies // J. Infection and Jmmunity. - 1976. - V.13. - №1 - Р.92), содержащая бульонную культуру штамма “В-44” (E.coli 0,9:K:H) с содержанием 3×10¹⁰ микробных клеток в см³ и адъювант. Вакцину вводят один раз подкожно, а второй - внутримышечно.

Однако вирулентность данной вакцины достаточно высока. Кроме этого, вакцина является многокомпонентной системой, поскольку включает адъювант, а необходимость двукратного введения увеличивает трудозатраты.

Наиболее близкой к заявляемой является живая вакцина против колибактериоза поросят (см. Nagy L.K., Phogal B.S. The effect of colostrums on the adhesion of Escherihia coli to the small intenstine of the pig.// Research in Veterinery sience. - 1976 - v.21. - p.303-308), содержащая суспензию штамма 0149:К91:К88, при этом суспензия содержит 1×10¹⁰ колониеобразующих микробных клеток в см³. Штамм ресуспензирован в кислотном гидролизате казеина. Вакцина предназначена для пероральной иммунизации новорожденных поросят.

Однако данная вакцина обладает остаточной вирулентностью. Кроме того, использование гидролизата казеина может приводить к появлению аллергических реакций, отвлечению иммунной системы на дополнительный раздражитель, а также появлению воспалительного процесса на месте введения вакцины.

Изобретение направлено на решение задачи создания безопасной живой вакцины против колибактериоза свиней для внутримышечного введения, обладающей высокоиммуногенными свойствами.

Для решения поставленной задачи живая вакцина против колибактериоза свиней, представляющая собой суспензию, содержащую растворитель и антиген из штамма Е.coli в виде бактериальной массы колониеобразующих микробных клеток, согласно изобретению содержит в качестве растворителя - физиологический раствор, а в качестве антигена - антиген из штамма Е.coli “Б-5” с содержанием 2,4×10⁸-2,4×10⁹ микробных клеток в 1 см³ физиологического раствора.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической литературы не описано авирулентных живых вакцин против колибактериоза свиней, обладающих высокоиммуногенными свойствами за счет использования антигена из штамма Е.coli “Б-5”, представляющего собой бактериальную массу с содержанием 2,4×10⁸-2,4×10⁹ микробных клеток в см³.

Сказанное позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом изобретении критерия “изобретательский уровень”.

Штамм, предназначенный для изготовления вакцины, характеризуется следующими свойствами.

Культуральные и морфологические признаки.

Культивирование осуществляют вначале на мясопептонном бульоне (МПБ), затем на мясопептонном агаре (МПА) при температуре 37°С в течение от 18 до 48 часов при аэробных условиях. При этом на МПБ колонии растут диффузно, образуя интенсивную муть и легко разбивающийся осадок, на МПА вначале образуются гладкие, выпуклые, блестящие с ровными краями колонии S-формы. В последующем возможно образование переходных от S- к R-форме колоний и суховатых с неровными краями R-форм колоний (до 50%). На агаре Эндо формируются темно-красные с металлическим блеском колонии.

Ферментативные свойства.

Микроорганизм обладает подвижностью, проявляет каталазную активность, дает положительную реакцию с метилротом, продуцирует индол, ферментирует глюкозу с газообразованием, а также лактозу, арабинозу, маннит, мальтозу, ксилозу, сорбит, дульцит.

Условия и состав сред для токсинообразования: бульон Хоттингера.

Антигенные свойства.

Продукт, синтезируемый штаммом Escherichia coli Б-5 - термолабильный экзотоксин, не подверженный нейтрализации поливалентной антитоксической сывороткой против колибактериоза (эшерихиоза) сельскохозяйственных животных.

Молекулярно-генетическая особенность штамма - треки штамма как в S-, так и в R-формах имеют репликон размером около 0,3 кв, в данном репликоне имеется ген, кодирующий В-субъединицу термолабильного токсина (ЛТ), обуславливающий иммуногенную активность штамма. Структурные гены ЛТ дополнительно интегрированы и в хромосому микробной клетки. В клетках штамма имеется репликон, несущий генетическую информацию регуляторного свойства, необходимую для синтеза ЛТ-продукции. У штамма имеется в наличии иммуногенный эпитоп, но отсутствует репликон, ответственный за реактогенность эшерихий.

Чувствительность к антибиотикам (зона задержки роста в мм): полимиксин - 11, стрептомицин - 25, левомицетин - 25, рифампицин -9, карбенициллин - 15; не чувствителен к: оксациллину, доксициклину, линкомицину, тетрациклину, олеандомицину, ампициллину, пенициллину.

Вирулентные свойства.

Внутрибрюшинное введение культуры штамма в концентрации 5·10⁸ м.к./см³ и объеме 0,5 мл гибели белых мышей не вызывает. LД₅₀ - 1,2·10¹⁰ м.к./см³. Гибель белых мышей наступает в течение суток.

Определение энтеротоксигенных свойств штамма.

Для определения токсинообразования культивирование штамма проводили в питательном составе Mundeli в течение 20 часов. Полученную бульонную культуру разделяли на токсиносодержащий материал и бакмассу методом стерилизующей фильтрации. Культуральная жидкость, лишенная бактериального компонента, служила материалом, содержащим экзотоксин Е.coli.

Устойчивость к температуре определяли прогреванием токсиносодержащего материала в течение 10-минутного кипячения при 100°С и последующим его введением белым мышам.

Определение ТЛ-токсина проводили с использованием: прогретого токсиносодержащего материала, не прогретого и питательной среды Mundeli - в качестве отрицательного контроля.

Культивирование штамма можно осуществлять, например, на разработанной и запатентованной Саратовской НИВС (патент №2142505) питательной среде следующего состава, мас.%: аминокровин 5-20; пептон 0,6-1,5; хлористый аммоний 0,08-0,18; хлористый натрий 0,09-0,11; гидролизат казеина 9-20; питательная среда “ИГЛА” 52-61; дистиллированная вода - остальное. На данной среде культивирование осуществляют в течение 7 суток при температуре 37°С, затем суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 минут. Надосадочная жидкость являлась энтеротоксигенным материалом.

Пример 1.

Способ изготовления живой вакцины против колибактериоза свиней заключается в следующем.

Осуществляют культивирование штамма. Для этого штамм Е.coli “Б-5” засевают в пробирки вначале на мясопептонном бульоне (МПБ), затем на мясопептонном агаре (МПА) при температуре 37°С в течение 18 часов при аэробных условиях.

Полученную бактериальную массу смывают физиологическим раствором и получают суспензию с содержанием микробных клеток 1,2×10¹⁰ в 1 см³ раствора. Затем добавлением к полученной суспензии физиологического раствора доводят содержание микробных клеток до 2,4×10⁸-2,4×10⁹ в 1 см³ физиологического раствора.

При этом суспензию с содержанием микробных клеток 2,4×10⁸ в 1 см³ используют для вакцинации поросят, а с содержанием микробных клеток 2,4×10⁹ в 1 см³ - для вакцинации свиноматок.

Пример 2. Оценку иммуногенных свойств вакцины проводили путем определения титра специфических антител в сыворотке крови кроликов, иммунизированных заявляемой вакциной.

Для этого ставили реакцию агглютинации (РА) с сыворотками крови иммунизированных и интактных кроликов. В серологических пробирках осуществляли разведение сывороток, начиная с 1:25 до 1:6400 в объеме 1 мл. В каждое разведение сывороток вносили по 2 капли антигена, в качестве которого использовали 10 млрд. взвеси микробных тел Е.coli (живой и инактивированной). Сыворотки перемешивали с антигеном, встряхивая пробирки, после чего их помещали в термостат и выдерживали вначале в течение 4 часов при 37°С, а затем 18-24 часа при комнатной температуре. Учет реакции осуществляли по степени просветления сывороток и образованию конгломерата (осадка в виде “зонтика”) на дне каждой пробирки. Результат определения титра специфических антител в сыворотках крови иммунизированных и интактных кроликов представлен в таблице 1, где характер агглютинации представлен следующим образом:

++++ - полная агглютинация,

+++ - почти полная агглютинация,

++ - неполная агглютинация,

+ - незначительная агглютинация,

- отсутствие агглютинации.

Таблица 1СывороткиТитр антител 1:251:501:1001:2001:4001:8001:16001:32001:6400С ЖИВОЙ КУЛЬТУРОЙОпытная++++++++++++++++++++++++Контрольная++++++++++++++-С ИНАКТИВИРОВАННОЙ КУЛЬТУРОЙОпытная++++++++++++++++++++++++Контрольная++++++++++++++-

Таким образом, однократное введение живой вакцины обеспечивает повышение уровня иммунитета как в отношении Н- (жгутикового), так и O- (соматического) антигенов по сравнению с контролем в 8 раз.

Пример 3. Для оценки напряженности иммунитета использовали две группы белых мышей. Первую группу мышей (10 голов) подвергли однократной иммунизации культурой штамма E.coli Б-5, вторая группа мышей (10 голов), которым вводили физиологический раствор в тех же дозах, была контрольной. Через 14 дней обе группы животных заразили внутрибрюшинно вирулентной культурой эшерихий с концентрацией 5×10⁸ микробных клеток в 1 см³ физиологического раствора в дозе 0,5 мл. Результаты исследований представлены в таблице 2, из которой следует, что сохранность иммунизированных животных составляет 100%, в контрольной группе все животные погибли.

Таблица 2Группы белых мышейКол-во головПало, головВыжило, головИммунизированные10010Контрольные10100

Пример 4.

Для доказательства авирулентности вакцины ее вводили мышам в концентрации 5×10⁸ микробных тел. Гибели мышей не наступало.

Пример 5.

Производилась отработка дозы вакцины как для свиноматок, так и для поросят. Свиноматкам вводили вакцину с концентрацией 2,4×10⁹ микробных клеток в 1 см³, а поросятам - с концентрацией 2,4×10⁸ в 1 см³ физиологического раствора.

Для этого одной группе свиноматок в количестве 7 голов вакцину вводили внутримышечно в дозе 2 мл, а другой группе в количестве 6 голов - в дозе 3 мл. В результате проведенных экспериментов была подобрана доза 2 мл, которая обеспечивала наиболее эффективную защиту животных и их сохранность - 98,5%, при этом родившиеся поросята колибактериозом не болели. На месте введения вакцины у животных воспалительных реакций не регистрировалось. Введение вакцины свиноматкам в дозе 3 мл не оказывало особого влияния на эффективность вакцинации.

Аналогичным образом была испытана вакцина в концентрации 2,4×10⁸ на поросятах. Результат исследований представлен в таблице 3, из которой следует, что сохранность поросят в опытной группе на 6,9% больше, чем в контрольной. При этом наилучшая эффективность достигалась при введении вакцины в дозе 2 мл.

Таблица 3Наименование групп животныхКол-во поросятВыжило, голов% сохранностиОпытная25425098,4Контрольная24922891,5

Проведены широкие производственные испытания вакцины на свиноматках и отдельно - на поросятах.

Вакцину вводили 4783 свиноматкам внутримышечно в дозе 2 мл однократно на 104-105 день супоросности. В контрольной группе животных (в количестве 852 головы) использовали общепринятые методы профилактики колибактериоза. Сохранность поросят-сосунов от вакцинированных свиноматок в опытной группе была на 8,7% выше, чем в контрольной.

Введение вакцины 5194 поросятам в возрасте 2-7 дней внутримышечно однократно в дозе 2 мл показало повышение сохранности на 10,8% по сравнению с контрольной группой (в количестве 7148 поросят), которым осуществляли профилактику принятыми в хозяйствах методами.

Таким образом, заявляемая вакцина высокоиммуногенна, не обладает реактогенностью, аллергогенностью, не вызывает воспалительных реакций на месте введения и обеспечивает защиту поросят от колибактериоза.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии. Живая вакцина представляет собой суспензию, содержащую растворитель и антиген из штамма E.coli в виде бактериальной массы колониеобразующих микробных клеток. Вакцина содержит в качестве растворителя - физиологический раствор, а в качестве антигена - антиген из штамма E.coli "Б-5" с содержанием 2,4×10⁸-2,4×10⁹ микробных клеток в 1 см³ физиологического раствора. Живая вакцина обладает высокоиммуногенными свойствами, безопасна. 3 табл.

Живая вакцина против колибактериоза свиней, представляющая собой суспензию, содержащую растворитель и антиген из штамма E.coli в виде бактериальной массы колониеобразующих микробных клеток, отличающаяся тем, что она содержит в качестве растворителя физиологический раствор, а в качестве антигена - антиген из штамма Е.coli "Б-5" с содержанием 2,4×10⁸-2,4×10⁹ микробных клеток в 1 см³ физиологического раствора.