СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к приготовлению диагностических препаратов, и может быть использовано для серологической диагностики бруцеллеза животных.

Известен «Способ получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума» путем дезинтеграции бруцелл ультразвуком с последующим выделением антигена и сенсибилизацией формалинизированных эритроцитов, при этом с целью повышения активности диагностикума дезинтеграцию ведут при рН 8,0-9,0 и сенсибилизацию эритроцитов проводят при 70-72°С в течение 5-10 мин (а.с. №784879, 1980 г. Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт; Карагандинская научно-исследовательская ветеринарная станция Министерства сельского хозяйства Казахской ССР; авторы Иванов Н.П., Бельченко В.Б.).

Недостатком данного способа является то, что при серологическом исследовании в РНГА с применением диагностикума, изготовленного по указанному способу, животных из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств или искусственно зараженных бруцеллезом, у части больных бруцеллезом животных не удается установить диагноз на это заболевание, несмотря на то, что у них в сыворотке крови циркулируют специфические гемагглютинины, обнаруживаемые в РНГА при использовании более активного эритроцитарного антигена (см.таб.3).

Целью настоящего изобретения является разработка способа получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), который обладает высокой активностью и дает возможность обнаружить инфицированных бруцеллезом животных наиболее полно и в более ранние сроки после заражения.

Поставленная цель достигается тем, что:

1. Формалинизированные эритроциты для повышения адсорбционных свойств их рецепторов предварительно до сенсибилизации обрабатываются новым детергентом - додецилсульфатом натрия при оптимальном режиме - в 1%-ной концентрации при 50-60°С в течение 30 мин.

2. С целью определения оптимальной дозы сенситина, требуемого для сенсибилизации эритроцитов и получения стандартного антигена для РНГА, используется национальный биологический стандарт - стандартный образец сыворотки антибруцелла абортус.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Трехсуточную агаровую культуру бруцелл штамма 19 смывают 12%-ным раствором хлорида натрия, фильтруют через четыре слоя марли, доводят концентрацию бруцелл до 80-100 млрд. микробных клеток в 1 мл. Устанавливают рН 8,0-9,0 и подвергают автоклавированию при 1 атмосфере (120°С) в течение 20-30 мин. Взвесь бруцелл остужают до температуры 18-25°С и подвергают центрифугированию при 8-10 тыс. оборотов в минуту. Полученный экстракт, который представляет собой липополисахаридобелковый комплекс бруцелл (сенситан), используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов. Предварительно до сенсибилизации формалинизированные эритроциты обрабатываются детергентом - додецилсульфатом натрия в 1%-ной концентрации при температуре 50-60°С в течение 30 мин.

Сенсибилизация формалинизированных эритроцитов после обработки додецилсульфатом натрия проводится оптимальной дозой сенситина, которая определяется путем титрации его с использованием стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус.

Специфичность и активность готового эритроцитарного антигена проверяются путем исследования в РНГА отрицательной сыворотки и стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус.

Пример определения оптимальных условий обработки формалинизированных эритроцитов додецилсульфатом натрия и сенсибилизации их сенситином (липополисахаридобелковый комплекс).

Определение оптимальной концентрации додецилсульфата натрия, требуемой для повышения адсорбционных свойств эритроцитов и получения специфичного и активного эритроцитарного антигена для РНГА, проводится путем обработки 10% взвеси формалинизированных эритроцитов разными концентрациями (1,0%; 1,5,%) додецилсульфата натрия и проверки активности и специфичности в РНГА антигена, полученного путем сенсибилизации эритроцитов, обработанных разными концентрациями указанного детергента.

Оптимальную сенсибилизирующую дозу сенситина, необходимую для получения стандартного антигена для РНГА с оптимальной активностью, определяют путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов (предварительно обработанных додецилсульфатом натрия) возрастающими дозами сенситина и проверки серологической активности сенсибилизированных эритроцитов (антигена) в РНГА с использованием стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус. Для сенсибилизации эритроцитов к 1 мл 5%-ной их взвеси добавляют по 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 мл сенситина. Результаты проверки активности и специфичности антигена, полученного при обработке эритроцитов разными концентрациями додецилсульфата натрия и сенсибилизированных разными дозами сенситина, даны в таблице 1.

Таблица 1
Результаты титрации сенситина и проверки активности эритроцитарного антигена в РНГАК-во сенситина на 1 мл 5-% взвеси эритроцитовТитры РНГАсо стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортусс негативной сывороткойс физраствором1:2001:4001:8001:16001:32001:64001:501:1001:2001:400123456789101112а. с антигеном, изготовленным без обработки эритроцитов додецилсульфатом натрия1,0+----------1,5+++---------2,0+++++--------2,5++++++--------3,0++++++++-------б. с антигеном, изготовленным путем обработки эритроцитов 1%-ной концентрацией додецилсульфата натрия1,0+++++++++++++++++------1,5++++++++++++++++++++------2,0+++++++++++++++++++++-----2,5++++++++++++++++++++++-----3,0+++++++++++++++++++++++-----в. с антигеном, изготовленным путем обработки эритроцитов 1,5%-ной концентрацией додецилсульфата натрия1,0+++++++++++++++++------1,5+++++++++++++++++++------2,0+++++++++++++++++++++-----2,5++++++++++++++++++++++++++-3,0+++++++++++++++++++++++++++++++++-Примечание: знак - отрицательный результат

Из приведенных в таблице 1 данных видно, что антиген, изготовленный путем сенсибилизации эритроцитов, не обработанных додецилсульфатом натрия, обладает низкой активностью. Обработка эритроцитов додецилсульфатом натрия повышает активность эритроцитарного антигена. Наиболее оптимальной для обработки эритроцитов является 1%-ная концентрация додецилсульфата натрия, позволяющая получить эритроцитарный антиген, обладающий достаточно высокой активностью и не дающий неспецифические реакции с негативной сывороткой и физраствором. Наименьшей дозой сенситина, позволяющей получить антиген с достаточно высокой активностью, является 1,0-1,5 мл его на 1 мл 5%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов, предварительно обработанных детергентом.

Следовательно, обработка эритроцитов 1,0%-ной концентрацией додецилсульфата натрия и сенсибилизация их, из расчета 1-1,5 мл сенситина на 1 мл 5%-ной взвеси эритроцитов, позволяет получить специфичный и более активный (по сравнению с аналогом) бруцеллезный эритроцитарный антиген для РНГА (табл.2 и 3).

Таблица 2Результаты испытания специфичности эритроцитарных антигенов (диагностикумов), изготовленных различными способами, в РНГА№№ п/пСыворотки, крови, подвергнутые исследованиюИсследовано в РНГА сывороток кровиРезультат исследованияс антигеном Прикасп. зонального НИВИс диагностикумом Казахского НИВИ (аналог)1.здорового по бруцеллезу крупного рогатого скота50--2.здоровых по бруцеллезу овец60--3.здоровых по бруцеллезу свиней3--4.больного туберкулезом крупного рогатого скота7--5.больного лейкозом крупного рогатого скота10--6.больного лептоспирозом крупного рогатого скота8--7.больных кампилобактериозом овец5--8.туляремийные2--9.больного паратуберкулезом кр. рог. скота1--10.больных В.ovis баранов3--Всего исследовано:149--Примечание: (-) - отрицательный результат.

Таблица 3Результаты сравнительного испытания активности бруцеллезных эритроцитарных антигенов (диагностикумов) для РНГА, изготовленных различными способамиВид животныхИсследовано сывороток кровиПоказателиРезультат исследованияс антигеном Прикаспийского зонального НИВИс диарностикумом Казахского НИВИ (аналог)Круп. рог. скот неблагополучных по бруцеллезу хозяйств54Получена положительная РНГА3226%59,248,1Средний титр РНГА1:4091:390Мелкий рог. скот неблагополучных по бруцеллезу хозяйств10Получена положительная РНГА6-%60-Средний титр РНГА1:158-Свиньи, искусственно зараженные бруцеллезом10Получена положительная РНГА109%10090Средний титр РНГА1:4251:200

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к способу получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе, включающий приготовление формалинизированных эритроцитов, с их последующей сенсибилизацией сенситином, отличающийся тем, что перед обработкой сенситином формализированные эритроциты предварительно обрабатывают додецилсульфатом натрия в 1%-ной концентрации при 50-60°С в течение 30 мин, сенсибилизацию проводят сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы бруцелл, смыв ее гипертоническим раствором хлорида натрия, инактивацию, экстрагирование и отделение сенситина центрифугированием. Изобретение позволяет получить диагностический препарат высокой эффективности для диагностики бруцеллеза животных. 3 табл.

Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе, включающий приготовление формалинизированных эритроцитов с их последующей сенсибилизацией сенситином, отличающийся тем, что перед обработкой сенситином формализированные эритроциты предварительно обрабатывают додецилсульфатом натрия в 1%-ной концентрации при 50-60°С в течение 30 мин, сенсибилизацию проводят сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы бруцелл, смыв ее гипертоническим раствором хлорида натрия, инактивацию, экстрагирование и отделение сенситина центрифугированием.