УДАЛЕНИЕ КЛЕТОК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВИРУСОВ Российский патент 2006 года по МПК A61K35/76 A61K35/28 A61K39/17 A61P35/00 

Область изобретения

Данное изобретение относится к вирусам, которые способны удалять (снижать количество или элиминировать) нежелательные клетки в смеси клеток. Нежелательные клетки могут включать в себя опухолевые клетки, клетки, опосредующие реакции "трансплантат против хозяина" и аутоиммунные клетки. Данное изобретение относится также к удалению нежелательных клеток из сбора клеток костного мозга или периферической крови при лечении млекопитающих, в том числе больных злокачественными опухолями, реципиентов трансплантатов и пациентов с аутоиммунным заболеванием.

Предпосылки изобретения

Способы удаления нежелательных клеток ex vivo показали ограниченный успех для трансплантации аутологичного костного мозга или стволовых клеток больным лейкозом или другими злокачественными заболеваниями. Одной из задач очистки (т.е. удаления нежелательных клеток) костного мозга или клеток-предшественников периферической крови (PBPC) является удаление опухолевых клеток при незначительном действии на нормальные стволовые клетки и гемопоэтические клетки-предшественники. Трансплантация очищенного (подвергнутого удалению нежелательных клеток) костного мозга имеет место после миелоаблятивной терапии, такой как химиотерапия в высоких дозах или облучение (см., например, Stuart R.K., 1993, Semin. Oncol. 20(5 Suppl. 6):40-54); Hammert L.C. and Ball, E.D., 1997, Curr. Opin. Hematol. 4:423-428; Schneidkraut M.J., et al., 1996, J. Hematother. 5:631-646). Трансплантация любых опухолевых клеток с костным мозгом подвергает пациента риску рецидива злокачественной опухоли (см., например, Rummel S.A. and Van Zant G., 1994, J. Hematother. 3:213-218; Kvalheim G. et al., 1996, J. Hematother., 5:427-436). Способы, испытываемые в текущих исследованиях для селективной элиминации опухолевых клеток, включают в себя применение химиотерапевтических агентов (таких как 4-гидропероксициклофосфамид; см., например, Bird J.M., 1996, Bone Marrow Transplant, 18:309-313), моноклональных антител (см., например, Hammert, L.C. and Ball E.D., 1997, Blood Rev., 11:80-90), фотодинамической терапии (см., например, Villeneuve L., 1999, Biotechnol. Appl. Biochem. 30:1-17) и вирусных векторов, таких как аденовирус (см., например, Hirai M. et al., 1999, Acta Haematol., 101:97-105; Marini F.C., et al., 1999, Clin. Cancer Res., 5:1557-1568). Однако недавние эксперименты показали, что жизнеспособные злокачественные клетки оставались в костном мозгу или РВРС после терапевтического удаления нежелательных клеток, что приводило к рецидиву злокачественной опухоли. Другим основным недостатком текущих способов удаления нежелательных клеток ex vivo является замедленное приживление трансплантата вследствие повреждения нормальных стволовых клеток и/или ранних гемопоэтических клеток-предшественников (Rummel S.A. and Van Zant G, 1994, J. Hematother. 3:213-218; Damon et al., 1996, Bone Marrow Transplant, 17:93-99). Клетки-предшественники, которые активно пролиферируют, являются поэтому очень чувствительными к элиминации большинством химиотерапевтических агентов, в том числе 4-гидропероксициклофосфамидом. Получаемая потеря ранних клеток-предшественников вызывает продолжительную нейтропению и/или тромбоцитопению, которая ставит пациента в условия увеличенного риска в отношении угрожающей жизни инфекции и/или кровотечения. Цитотоксичный или цитолитический агент, убивающий опухолевые клетки, который сохраняет нормальные гемопоэтические клетки, является важным достижением в терапии злокачественных опухолей.

Кроме опухолевых клеток, сборы клеток-предшественников костного мозга или периферической крови могут содержать другие нежелательные клетки, такие как аутоиммунные клетки, например, в людях с артритом или рассеянным склерозом. Другие нежелательные клетки включают в себя клетки, которые опосредуют реакцию ″трансплантат против хозяина″ (например, некоторые Т-лимфоциты) в аллогенных трансплантатах. Уменьшение количества или элиминация таких нежелательных клеток была бы важной в лечении злокачественных опухолей и аутоиммунных заболеваний.

Заявки РСТ Roberts et al. (WO 99/18799 и PCT US 99/21230) относятся к лечению новообразований вирусами.

Цели изобретения

Объектом данного изобретения являются вирусы для уменьшения количества или элиминации нежелательных клеток в смесях желательных и нежелательных клеток.

Следующим объектом данного изобретения является обеспечение вирусов для уменьшения количества или элиминации опухолевых клеток в смесях нормальных и опухолевых клеток.

Следующим объектом является обеспечение вирусов для удаления ex vivo опухолевых клеток из нормальных гемопоэтических клеток, таких как клетки-предшественники костного мозга или периферической крови.

Следующим объектом является обеспечение вирусов для удаления ex vivo аутоиммунных клеток из нормальных клеток, таких как клетки-предшественники костного мозга или периферической крови.

Еще одним объектом является обеспечение вирусов для удаления ex vivo клеток, которые опосредуют реакцию ″трансплантат против хозяина″, из нормальных гемопоэтических клеток, таких как клетки-предшественники костного мозга или периферической крови.

Следующим объектом данного изобретения является обеспечение способа лечения заболевания у млекопитающего взаимодействием смесей желательных гемопоэтических клеток и нежелательных клеток с вирусом и трансплантацией таких клеток в млекопитающее.

Следующим объектом данного изобретения является обеспечение способа лечения злокачественной опухоли у млекопитающего взаимодействием собранных клеток с вирусом и трансплантацией таких очищенных гемопоэтических клеток в млекопитающее после миелоаблятивной терапии.

Следующим объектом данного изобретения является обеспечение способа предупреждения реакций ″трансплантат против хозяина″ у млекопитающего взаимодействием собранных клеток с вирусом и трансплантацией таких очищенных гемопоэтических клеток в млекопитающее после миелоаблятивной терапии.

Следующим объектом данного изобретения является обеспечение способа лечения аутоиммунного заболевания у млекопитающего взаимодействием собранных клеток с вирусом и трансплантацией таких очищенных гемопоэтических клеток в млекопитающее после миелоаблятивной терапии.

Следующим объектом данного изобретения является обеспечение способа лечения злокачественной опухоли у млекопитающего, получающего трансплантат стволовых клеток костного мозга или периферической крови, предусматривающего обработку этого трансплантата вирусом.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к способу уменьшения количества или элиминации нежелательных клеток в смеси желательных и нежелательных клеток взаимодействием этой смеси с вирусом.

Данное изобретение относится также к способу уменьшения количества или элиминации нежелательных клеток в смеси желательных и нежелательных клеток взаимодействием этой смеси с РНК-вирусом.

Данное изобретение относится также к способу уменьшения количества или элиминации опухолевых клеток в смеси ex vivo нормальных гемопоэтических клеток и опухолевых клеток взаимодействием этой смеси с вирусом, таким как РНК-вирус.

Данное изобретение относится также к способу удаления ex vivo опухолевых клеток из сбора стволовых клеток костного мозга или периферической крови взаимодействием собранных клеток с вирусом, таким как РНК-вирус.

Данное изобретение относится также к способу удаления ex vivo аутоиммунных клеток из сбора стволовых клеток костного мозга или периферической крови взаимодействием собранных клеток с вирусом, таким как РНК-вирус.

Данное изобретение относится также к способу удаления ex vivo клеток, которые опосредуют реакцию ″трансплантат против хозяина″, из популяции стволовых клеток костного мозга или периферической крови взаимодействием этой популяции клеток с вирусом, таким как РНК-вирус.

Данное изобретение относится также к способу лечения или профилактики заболевания, такого как злокачественная опухоль, у млекопитающего, предусматривающему: а) взятие клеток костного мозга или периферической крови у указанного млекопитающего, b) взаимодействие указанных клеток костного мозга или периферической крови ex vivo с вирусом, таким как РНК-вирус, с) выполнение миелоаблятивной терапии у указанного млекопитающего и d) трансплантацию указанному млекопитающему очищенных гемопоэтических клеток стадии b).

Данное изобретение относится также к способу лечения злокачественной опухоли у млекопитающего, получающего трансплантат клеток-предшественников костного мозга или периферической крови, предусматривающему взаимодействие собранных клеток трансплантата с вирусом, таким как РНК-вирус, и введение этих очищенных клеток указанному млекопитающему.

Данное изобретение относится также к способу лечения аутоиммунного заболевания у млекопитающего, получающего трансплантат клеток-предшественников костного мозга или периферической крови, предусматривающему взаимодействие собранных клеток трансплантата с вирусом, таким как РНК-вирус, и введение этих очищенных клеток указанному млекопитающему.

Данное изобретение относится также к способу предупреждения реакции ″трансплантат против хозяина″ у млекопитающего, получающего трансплантат клеток-предшественников костного мозга или периферической крови, предусматривающему взаимодействие собранных клеток трансплантата с вирусом, таким как РНК-вирус, и введение этих очищенных клеток указанному млекопитающему.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение относится к обнаружению вирусов и применению вирусов для уменьшения количества или элиминации нежелательных клеток, таких как опухолевые клетки, из смеси желательных и нежелательных клеток. Данное изобретение обеспечивает вирусы и способы удаления (уменьшения количества или элиминации) нежелательных клеток из нормальных клеток с использованием вирусов. Нежелательные клетки в трансплантатах гемопоэтических клеток, которые удаляются вирусами в данном изобретении, включают в себя опухолевые клетки, аутоиммунные клетки (например, в случае ревматоидного артрита или рассеянного склероза)) и клетки, которые опосредуют реакцию "трансплантат против хозяина". Лечение млекопитающего состоит из а) взятия клеток костного мозга или периферической крови у указанного млекопитающего, b) взаимодействия указанных клеток костного мозга или периферической крови ex vivo с вирусом, с) проведения миелоаблятивной терапии у указанного млекопитающего и d) трансплантации указанному млекопитающему очищенных гемопоэтических клеток стадии b).

Способы изобретения

Удаление опухолевых клеток

Инкубирование смесей нормальных клеток и опухолевых клеток с вирусами приводит к избирательной элиминации опухолевых клеток, но не нормальных клеток. Эффективный способ удаления опухолевых клеток из гемопоэтических клеток может быть использован в лечении злокачественных опухолей у млекопитающих с трансплантацией аутологичных стволовых клеток костного мозга или периферической крови. Например, стволовые клетки костного мозга или периферической крови из млекопитающего с опухолью подвергают взаимодействию с вирусом перед трансплантацией для предупреждения рецидива этой опухоли. Опухолевые клетки, которые могут быть удалены способами данного изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, (1) лейкоз, (2) лимфому, (3) карциномы, такие как рак молочной железы, рак легкого, рак ободочной кишки, рак предстательной железы и рак поджелудочной железы, (4) саркомы и (5) злокачественная опухоли нейроэпителиального происхождения, такие как меланома и нейробластома.

Разнообразные вирусы, такие как РНК-вирусы [например, но не только, вирус везикулярного стоматита (VSV), вирус Ньюкаслской болезни (NDV) и реовирус] могут быть использованы для удаления опухолевых клеток из нормальных гемопоэтических клеток. Нормальные гемопоэтические клетки являются устойчивыми к инфицированию многими вирусами, в том числе РНК-вирусами. В качестве примера, нормальные клетки костного мозга человека являются устойчивыми к инфекции VSV, рабдовирусом, как определено по продуцированию и по жизнеспособности инфекционного вируса. Нормальные клетки костного мозга из двух доноров не продуцировали инфекционного вируса даже при инфицировании при высокой множественности заражения (например, 10 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на клетку; см. пример 1). Культуры костного мозга были неотличимы от ложноинфицированных культур в их способности образовывать нормальный спектр типов гемопоэтических клеток после культивирования in vitro в метилцеллюлозе. В качестве другого примера, CD34+ обогащенные клетки нормального костного мозга человека были устойчивыми к инфицированию NDV, вирусом из другого семейства (парамиксовирусом); см. Roberts et al., WO 99/18799.

Многие типы опухолевых клеток являются высокочувствительными к элиминации клеток многочисленными вирусами, в том числе РНК-вирусами. Например, с использованием VSV, клеточные линии острого миелогенного лейкоза OCI/AML3, OCI/AML4 и OCI/AML5 были высокочувствительными к инфекции VSV, причем 0,05 БОЕ на клетку убивали 50% этих клеток за 24 часа и всего лишь 0,003 БОЕ на клетку убивали 50% клеток за 48 часов (пример 1). Серотип Indiana VSV, использованный в этом эксперименте, размножали и собирали из мышиных клеток L929. В качестве другого примера, было показано, что разнообразные типы опухолевых клеток были чувствительными к VSV, в том числе клетки карциномы яичников, фибросаркомы, рака легкого, меланомы, рака предстательной железы и лейкоза (см. пример 3). NDV также убивает большинство опухолевых клеток (см. Roberts et al., WO 99/18799). Реовирус типа 3 убивал опухолевые клетки фибросаркомы человека, но не нормальные фибробласты (пример 4).

Избирательная элиминация опухолевых клеток из совместной культуры с нормальными гемопоэтическими клетками может быть достигнута при помощи различных вирусов. Например, в сокультурах клеток лейкоза OCI/AML3 с нормальными клетками костного мозга (при соотношении 1:9 и при соотношении 1:3) VSV убивал все лейкозные клетки, в то время как он оказывал незначительное действие или вообще не оказывал действия на нормальные гемопоэтические клетки (пример 2). Серотип Indiana VSV, используемый в данном эксперименте, размножали и собирали из мышиных клеток L929. Эти данные показывают избирательную деструкцию лейкозных клеток в смешанной популяции нормального костного мозга и применимость вирусов, таких как VSV, в очистке костного мозга от нежелательных клеток. В качестве другого примера, была показана избирательная элиминация опухолевых клеток в смешанной культуре нормальных клеток с использованием NDV. Штамм РРМК107 NDV, трижды очищенный из бляшек изолят мезогенного штамма МК107 NDV, избирательно убивал клетки рака полости рта человека в смешанной культуре с нормальными фибробластами (см. Roberts et al., WO 99/18799).

Удаление клеток, опосредующих реакцию "трансплантат против хозяина".

Инкубирование смесей нежелательных клеток, таких как Т-лимфоциты, вызывающие реакцию "трансплантат против хозяина", и желательных клеток с вирусами приводит к избирательной элиминации нежелательных клеток. Этот эффективный способ очистки таких клеток костного мозга или периферической крови может быть использован в предупреждении реакции "трансплантат против хозяина" у млекопитающих.

Удаление клеток, опосредующих аутоиммунное заболевание.

Инкубирование смесей аутоиммунных клеток, вызывающих аутоиммунное заболевание, и желательных клеток с вирусами приводит к избирательной элиминации аутоиммунных клеток. Этот эффективный способ удаления таких нежелательных клеток может быть использован в лечении аутоиммунного заболевания, такого как ревматоидный артрит и рассеянный склероз.

Скрининг нежелательных клеток.

Нежелательные клетки данного изобретения могут включать в себя опухолевые клетки с хромосомными делециями или реаранжировкой гена или генов, кодирующих белки или модуляторы реакции на клеточный интерферон, или нести иным образом дефектную реакцию на интерферон (Colamonici O.R. et al., 1992, Blood, 80:744-749; Heyman M. et al., 1994, Leukemia, 8:425-434; Billard C. et al., 1986, Blood, 67:821-826). Суспендированный характер костного мозга или популяций РВРС позволяет легко использовать анализ с сортингом клеток с возбуждением флуоресценции (FACS-анализ) в определении состояния реактивности клетки на интерферон. Зонды для реактивности на интерферон включают в себя хромосомные гибридизационные зонды для делеций или реаранжировок генов и зонды, такие как антитела, для анализа клеточных рецепторов и компонентов путей трансдукции сигналов, участвующих в клеточной реакции на интерферон.

Соединения изобретения

Вирусы данного изобретения способны отличать нежелательные клетки, такие как опухолевые клетки, от желательных клеток, таких как нормальные гемопоэтические клетки. РНК-вирусы данного изобретения включают в себя, но не ограничиваются ими, (1) одноцепочечные вирусы, в том числе негативно-смысловые РНК-вирусы и позитивно-смысловые РНК-вирусы, и (2) двухцепочечные РНК-вирусы. Одноцепочечные, негативно-смысловые РНК-вирусы данного изобретения включают в себя, но не ограничиваются ими, семейства несегментированных вирусов, таких как рабдовирусы [(например, вирус везикулярного стоматита (VSV)] и парамиксовирусы [например, вирус Ньюкаслской болезни (NDV) и вирус парагриппа типа 3 человека]. Одноцепочечные позитивно-смысловые РНК-вирусы данного изобретения включают в себя, но не ограничиваются ими, пикорнавирусы (например, риновирус) и тогавирусы (например, вирус лихорадки Синдбис). Семейства двухцепочечных РНК-вирусов данного изобретения включают в себя реовирусы. В данное изобретение включены компетентные по репликации и некомпетентные по репликации РНК-вирусы.

В данное изобретение включены ″интерферон-чувствительные вирусы″, описанные Roberts et al., WO 99/18799, который включен здесь в качестве ссылки в его полном виде. Эти вирусы избирательно реплицируются в опухолевых клетках и элиминируют опухолевые клетки на основе селективной недостаточности в этих клетках IFN-опосредованной антивирусной реакции. Кроме РНК-вирусов, в "интерферон-чувствительные вирусы" включены VA1-мутанты аденовируса, ДНК-вируса.

Семейство рабдовирусов состоит из близкородственных, имеющих оболочку, несегментированных РНК-вирусов, и они включают в себя следующие роды, которые инфицируют животных: (1) род Vesiculovirus (например, вирус везикулярного стоматита, VSV); (2) род Lyssavirus (например, вирус бешенства) и (3) род Ephemerovirus [Dietzschold B. et al., 1996. Rhabdoviruses. In: Fields Virology, 3^rd Edition (eds. Fields B.N. et al.), pp 1137-1159].

В особенно предпочтительном варианте данного изобретения рабдовирусом является вирус везикулярного стоматита (VSV). Были идентифицированы несколько серологически отличающихся штаммов VSV вместе с множеством охарактеризованных штаммов. Природные хозяева VSV включают в себя насекомых, грызунов и домашних сельскохозяйственных животных. Обычно очень небольшая часть населения Северной Америки вступает в контакт с этим вирусом, причем большинство инфекций человека встречается у персонала лабораторий и фермеров. У человека инфекции являются либо бессимптомными, либо проявляются в виде подобных гриппу симптомов. Штаммы VSV включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы Indiana, New Jersey, Priy, Coccal и Chandipura. Хотя описанные здесь примеры относятся к VSV Indiana, должно быть понятно, что специалист с квалификацией в данной области, на основании способов, описанных в данном документе, сможет с легкостью подвергнуть скринингу другие штаммы и производные VSV, в том числе мутанты VSV, которые селективно убивают опухолевые клетки.

Семейство парамиксовирусов, содержащее несегментированные негативно-смысловые РНК-вирусы, включает в себя три рода: (1) парамиксовирусы, в том числе вирус Ньюкаслской болезни (NDV); (2) вирусы, подобные вирусу кори (Morbillivirus, род, включающий возбудителей кори, чумы собак и крупного рогатого скота), и (3) респираторно-синцитиальные вирусы (пневмовирусы). NDV является предпочтительным вирусом в соответствии с данным изобретением. NDV разделяют на три различающихся класса в соответствии с действием на кур и куриные эмбрионы. Штаммы "низкой вирулентности" называют лентогенными (с медленным действием) и они требуют 90-150 часов для элиминации куриных эмбрионов при минимальной летальной дозе (MLD); штаммы "умеренной вирулентности" называют мезогенными и они требуют 60-90 часов для элиминации куриных эмбрионов при MLD; штаммы "высокой вирулентности" называют велогенными (с быстрым действием) и они требуют 40-60 часов для элиминации куриных эмбрионов при MLD. См., например, Hanson and Bradley, 1955 (Science, 122:156-157) и Diardiri et al., 1961 (Am. J. Vet. Res. 8:918-920). Все три класса являются применимыми, в том числе, предпочтительно, мезогенные штаммы NDV, такие как МК107.

В особенно предпочтительном варианте данного изобретения двухцепочечным РНК-вирусом является реовирус. В следующем предпочтительном варианте данного изобретения реовирус является реовирусом типа 3.

В другом предпочтительном варианте данного изобретения используют РНК-вирусы, способные реплицироваться в опухоли, недостаточной по экспрессии субтилизин-родственных протеаз. Вирус парагриппа типа 3 является вирусом этого типа.

Для некоторых целей желательным является получение клонального вируса для гарантии или увеличения генетической гомогенности конкретного вирусного штамма и для удаления дефектных мешающих частиц. Удаление дефектных мешающих частиц делает возможной увеличенную чистоту в конечном продукте, оцениваемую по числу всех вирусных частиц на инфекционную частицу. Клональный вирус может быть получен очисткой из бляшек или другими способами, как описано в Roberts et al., WO 99/18799.

В другом варианте данного изобретения вирус является генетически модифицированным, например, для увеличения его селективности в отношении опухолевых клеток. Способы генетической манипуляции рабдовирусов, таких как VSV, являются хорошо установленными (Roberts A. and J.K. Rose, Virology, 1998, 247:1-6), что делает возможным изменение генетических свойств этого вируса.

Кроме того, стандартные способы, хорошо известные специалисту с квалификацией в данной области, могут быть использованы для генетической модификации VSV и введения желаемых генов в геном VSV для получения рекомбинантных VSV (например, Sambrook et al., 1989, A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Press). В одном варианте данного изобретения G-белок VSV может быть модифицирован для получения слияний, которые нацелены на специфические сайты на опухолевых клетках. В другом варианте данного изобретения VSV генетически изменен для экспрессии одного или нескольких суицидных генов, способных метаболизировать пролекарство в токсичный метаболит, что позволяет элиминировать инфицированные VSV опухолевые клетки введением пролекарства. VSV, сконструированный для экспрессии гена тимидинкиназы или гена цитозиндезаминазы вируса герпеса, может быть использован для превращения ганцикловира или 5-FC, соответственно, в токсичное соединение. Однако должно быть понятно, что могут быть также использованы и другие суицидные гены.

Приготовление композиций и введение

Предпочтительный вариант данного изобретения относится к набору для применения в удалении ex vivo нежелательных клеток из смеси желательных и нежелательных клеток. Этот набор включает в себя предварительно измеренные количества вируса или вирусов композиции, подходящие для обработки смеси, содержащей определенное число желательных и нежелательных клеток. Предпочтительные композиции включают в себя наполнители, которые стабилизируют вирус против потери инфекционности или повышают жизнеспособность или выживание желательных клеток. Более предпочтительный набор позволяет проводить взаимодействие вирусной композиции со смесью-мишенью клеток в асептической стадии без необходимости специального оборудования для помещения биологических компонентов. Примером такого устройства является компартментализованный контейнер для сбора, предназначенный для смеси-мишени клеток, который содержит в отдельном компартменте предварительно измеренное количество вируса. Создание оригинального пути между компартментами делает возможным контакт между вирусом, клеточной популяцией-мишенью и одним или несколькими наполнителями. Контакт с вирусом и наполнителями, если они разделены, может происходить одновременно или последовательно. Дополнительным предпочтительным вариантом данного изобретения является тип компартментализованного контейнера, который поддерживает оптимальную температуру для взаимодействия вируса и клеток во время контакта между вирусом или вирусами и смесью-мишенью желательных и нежелательных клеток. Другой предпочтительный вариант данного изобретения относится к набору, который позволяет отделять контактированную смесь клеток от вируса, наполнителей или от того и другого после подходящего периода времени. Подходящий период времени контакта может быть известным или может быть определен специалистом с квалификацией в данной области.

Подходящие композиции для вирусов данного изобретения включают в себя композиции, находящиеся в списке вирусов, используемых в лечении новообразований (Roberts et al., 1999, PCT WO 99/18799). Кроме того, предпочтительные композиции включают в себя соединения или биологические агенты, которые имеют одну или несколько из следующих активностей в отношении желательных клеток в смеси желательных и нежелательных клеток: дифференцирующую, пролиферирующую, сберегающую, стимулирующую, защитную и индуцирующую состояние покоя. Например, соединения и биологические агенты этих типов включают в себя цитокины, пептидные регуляторы жизненного цикла клеток, интерлейкины, факторы роста, источники энергии, витамины и электролиты. Дополнительные желательные наполнители включают в себя криозащитные соединения.

Для уменьшения количества или элиминации нежелательных клеток с сохранением желательных клеток следует использовать эффективное количество вируса данного изобретения. Специалистам в данной области понятно, что количество применяемого вируса для уменьшения количества или элиминации нежелательных клеток будет варьироваться в зависимости от выбранного вируса, типа и количества нежелательных клеток и типа и количества желательных клеток, которые должны быть сохранены. Например, VSV используют при 0,00001-10 бляшкообразующих единицах (БОЕ) на клетку и более предпочтительно при 0,0003-10 БОЕ на клетку.

В другом предпочтительном варианте данного изобретения вирус используют для взаимодействия со смесью опухолевых клеток и нормальных клеток, которые обрабатывают до, во время или после взаимодействия интерфероном. Интерферон делает возможной усиленную защиту нормальных клеток (см. пример 3 и Roberts et al., WO 99/18799). Интерферон (IFN) выбирают из группы класса I (альфа, бета и омега) и класса II (гамма) и их рекомбинантных версий и аналогов, как обсуждается, например, в Sreevalsoun, T., 1995 (In: Biologic Therapy of Cancer, second edition, edited by V.T.DeVita, Jr., et al., J.B.Lippincott Company, Philadelphia, pp.347-364).

В другом предпочтительном варианте данного изобретения вирус используют для взаимодействия смеси опухолевых клеток и нормальных клеток, которые обрабатывают химиотерапевтическим агентом до, во время или после контакта с указанным вирусом. Химиотерапевтический агент используют для дополнительного снижения жизнеспособности опухолевых клеток.

Следующие далее примеры являются иллюстративными, а не ограничивающими способы и композиции данного изобретения. Другие подходящие модификации и адаптации различных условий и параметров, обычно встречающихся в клинической терапии, которые являются очевидными для специалистов с квалификацией в данной области, находятся в пределах идеи и объема данного изобретения.

Пример 1. Избирательная элиминация лейкозных клеток с сохранением нормальных клеток костного мозга с использованием вируса везикулярного стоматита, определяемая в раздельных клеточных культурах

Серотип Indiana VSV выделяли из бляшек на мышиных клетках L929. Индивидуальную бляшку использовали для инфицирования монослоя клеток L929 и спустя 18 часов собирали супернатант и подвергали его центрифугированию при 6000хg в течение десяти минут. Затем осветленный супернатант фильтровали через фильтр 0,2 микрон (Millipore) и затем титровали на L-клетках и хранили при 80°С в виде аликвот. Отдельные аликвоты вируса использовали только один раз.

Культуры нормального костного мозга из двух отдельных здоровых доноров были устойчивыми к инфицированию этим серотипом Indiana вируса везикулярного стоматита (VSV). Нормальные клетки костного мозга не продуцировали инфекционные частицы VSV, даже при инфицировании при множественности заражения 10 БОЕ на клетку. Кроме того, инфицированные культуры клеток костного мозга были неотличимы от ложноинфицированных культур по их способности образовывать нормальный спектр типов гемопоэтических клеток после культивирования in vitro на метилцеллюлозе. В противоположность этому, линии клеток AML OCI/AML3, OCI/AML4 и OCI/AML5 были высокочувствительными к инфекции VSV, причем 0,05 БОЕ на клетку убивали 50% этих клеток за 24 часа и всего лишь 0,0003 БОЕ на клетку убивали 50% клеток за 48 часов.

Пример 2. Избирательная элиминация лейкозных клеток вирусом везикулярного стоматита в смешанных культурах, содержащих нормальные клетки костного мозга

Серотип Indiana VSV, используемый в этом примере, готовили, как описано в примере 1. В сокультурах лейкозных клеток OCI/AML3, смешанных с нормальными клетками костного мозга (в соотношении 1:9), VSV имел онколитические свойства. В этом эксперименте (таблица 1) сокультуры инфицировали VSV при множественности заражения 1 бляшкообразующей единицей (БОЕ) на клетку или 5 БОЕ на клетку в течение 24 часов и затем высевали в метилцеллюлозу с факторами роста или без факторов роста. В присутствии факторов роста росли как клетки нормального костного мозга, так и опухолевые клетки, тогда как в отсутствие факторов роста только клетки OCI/AML3 образовывали колонии. Подсчет колоний проводили спустя 14 дней (таблица 1), и он показал полное устранение независимых от факторов роста лейкозных клеток и сохранение клеток-предшественников нормального костного мозга. Идентичные результаты наблюдали при применении смеси 1:3 клеток OCI/AML3 и нормального костного мозга. Эти данные показывают избирательную деструкцию лейкозных клеток в смешанной популяции нормального костного мозга и применимость VSV в очистке ex vivo от нежелательных клеток.

Таблица 1.
Избирательная элиминация клеток острого миелолейкоза (ОМЛ), сокультивируемых с нормальным костным мозгом. Числа колоний на чашку (получающую 10⁴ клеток), наблюдаемые спустя две недели после инфицирования VSV, приведены в таблице ниже для опухолевых клеток (лейкозных) и нормальных гемопоэтических клеток (нейтрофилов, смешанных и моноцитов).Множественность зараженияТип колоний0,01,05,0Лейкозные клетки17200*Нейтрофилы1275Смешанные клетки634Моноциты1075* Колонии лейкозных клеток не обнаруживали на чашках без факторов роста даже при посеве 10⁵ клеток на чашку.

Пример 3. VSV избирательно растет в опухолевых клетках и убивает опухолевые клетки в сравнении с нормальными клетками, как определено в раздельных клеточных культурах

Различные нормальные и трансформированные клеточные линии либо не обрабатывали, либо предобрабатывали 100 единицами IFN-α, инфицировали VSV Indiana при множественности заражения (MOI) 0,1 БОЕ/мл и инкубировали в течение 18 часов при 37^оС (таблица 2). Культуральную среду из каждой пробы титровали на продуцирование VSV. Предобработка культур нормальных клеток интерфероном снижала продуцирование вируса до <1000 инфекционных вирусных частиц на мл, тогда как линии опухолевых клеток продолжали продуцировать обильные количества вирусных частиц (10⁵-10⁸ бляшкообразующих частиц на мл). В опухолевых клетках наблюдали более быстрый и скоротечный рост VSV, чем в первичных культурах нормальных клеток фибробластного или эпителиального происхождения. Различия между разными типами клеток отражались не только в продуцировании вирусных частиц, но также в цитопатическом эффекте (сре), наблюдаемом на микроскопическом уровне.

Таблица 2.
Выход вируса VSV после ночного инфицирования различных клеточных линий, либо не обработанных, либо обработанных IFNКлеточная линияТитр вируса (БОЕ/мл) НеобработанныеIFN-αOSF7 (первичные нормальные фибробласты человека)1×10⁶<10OSF12 (первичные нормальные фибробласты человека)2×10⁵<10OSF16 (первичные нормальные фибробласты человека)1×10⁵<10PrEC (первичный нормальный эпителий простаты человека)8×10⁶<10HOSE (первичный нормальный поверхностный эпителий яичников человека)1×10⁷<1000A2780 (рак яичников человека)2×10⁸1×10⁷OVCA 420 (рак яичников человека)1×10⁸3×10⁶С13 (рак яичников человека)1×10⁸1×10⁵LC80 (рак легкого человека)2х10⁹6×10⁷SK-MEL3 (меланома человека)1×10⁹1×10⁹LNCAP (рак простаты человека)4×10⁹5×10⁹HCT116 (рак ободочной кишки человека)1×10⁹2×10⁹293Т (НЕК-клетки, трансформированные Т-антигеном и Е1А Ad-вируса)1х10⁸8×10⁷

Пример 4. Избирательная элиминация опухолевых клеток с сохранением нормальных фибробластных клеток реовирусом типа 3 в раздельных клеточных культурах

Опухолевые клетки человека (НТ1080, фибросаркома) и нормальные клетки (CCD922sk, нормальные фибробласты кожи человека) выращивали до приблизительно 80%-ной конфлюентности в 24-луночных планшетах для культуры ткани. Культуральную среду удаляли и добавляли PPVR-824, очищенный из бляшек клон реовируса типа III человека, штамм Dearing, при 1Е+6 бляшкообразующих единицах (БОЕ) на лунку - 10 БОЕ на лунку в 10-кратных разведениях (эксперимент I) или при 7,2Е+7 БОЕ на лунку и 10-кратных разведениях от 10⁷ до 100 БОЕ на лунку (эксперимент II). Контрольные лунки без добавления вируса были на каждом планшете. Вирус адсорбировали в течение 90 минут на качающейся платформе при 37°С. В конце этого инкубационного периода вирусные разведения извлекали и заменяли 1 мл культуральной среды. Затем планшеты инкубировали в течение 5 дней при 37°С в 5% СО₂. Цитотоксичность определяли количественно с использованием колориметрического анализа с использованием МТТ (бромида 2-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия) (Cell Titer 96, catalog#G4000, Promega Corporation, Madison WI 53711), с мониторингом при 570 нм, который детектирует активность митохондриального фермента (Mosman, T., 1983, J. Immunol. Methods 65:55). Жизнеспособность в обработанных вирусом лунках выражали в виде процента активности в необработанных контрольных лунках. Данные изображали графически как функцию жизнеспособности в процентах от контроля от БОЕ на лунку. IC₅₀ рассчитывали в виде количества вируса в БОЕ на лунку, вызывающего 50%-ное уменьшение количества жизнеспособного вируса. Опухолевые клетки были на порядок величин более чувствительными к элиминации PPVR-824 (таблица 3).

Таблица 3.
Избирательная элиминация опухолевых клеток, но не нормальных фибробластных клеток реовирусом типа 3 в раздельных клеточных культурах Нормальный фибробласт (CCD922sk), IC₅₀Опухолевая клетка (НТ1080), IC₅₀Эксперимент I>1,0 Е+06125Эксперимент II>7,2 Е+07417

Предыдущие примеры предназначены для иллюстрации данного изобретения, а не для его ограничения. Многочисленные вариации и модификации могут быть выполнены без отклонения от истинного объема данного изобретения.

Изобретение относится к медицине, к использованию вирусов, способных снижать количество нежелательных клеток в смеси ex vivo нормальных клеток костного мозга или периферической крови и опухолевых клеток, таких как лейкозные или клетки лимфомы, путем взаимодействия указанной смеси клеток с вирусом везикулярного стоматита. Изобретение также включает способ лечения злокачественной опухоли у млекопитающего, предусматривающий взятие клеток костного мозга или периферической крови млекопитающего, взаимодействие указанных клеток ех vivo с вирусом везикулярного стоматита, проведение миелоаблятивной терапии млекопитающему и трансплантацию ему очищенных гемопоэтических клеток. Изобретение также предусматривает способ лечения злокачественной опухоли у млекопитающего, получающего трансплантат стволовых клеток костного мозга или периферической крови, путем взаимодействия собранных клеток трансплантата ех vivo с вирусом везикулярного стоматита и введение этих очищенных клеток млекопитающему. Изобретение расширяет арсенал средств селективной элиминации опухолевых клеток из костного мозга или периферической крови, для чего впервые предложен вирус везикулярного стоматита, и позволяет уменьшить риск рецидива злокачественной опухоли при трансплантации гемопоэтических клеток у млекопитающих. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ уменьшения количества или элиминации опухолевых клеток в смеси ex vivo нормальных гемопоэтических клеток и опухолевых клеток взаимодействием указанной смеси с вирусом везикулярного стоматита.2. Способ по п.1, где указанные опухолевые клетки являются лейкозными клетками.3. Способ по п.1, где указанные гемопоэтические клетки являются клетками костного мозга.4. Способ по п.1, где указанные гемопоэтические клетки являются клетками периферической крови.5. Способ по п.1, где указанный РНК-вирус везикулярного стоматита является компетентным по репликации РНК-вирусом.6. Способ по п.1, где указанный РНК-вирус везикулярного стоматита является некомпетентным по репликации РНК-вирусом.7. Способ по п.1, где указанные опухолевые клетки являются клетками лимфомы.8. Способ по п.1, дополнительно предусматривающий введение химиотерапевтического агента до, во время или после взаимодействия с указанным вирусом.9. Способ по п.1, дополнительно предусматривающий введение интерферона до, во время или после взаимодействия с указанным вирусом.10. Способ лечения злокачественной опухоли у млекопитающего, предусматривающий а) взятие клеток костного мозга или периферической крови у указанного млекопитающего, b) взаимодействие указанных клеток костного мозга или периферической крови ex vivo с вирусом везикулярного стоматита, c) проведение миелоаблятивной терапии у указанного млекопитающего и d) трансплантацию указанному млекопитающему очищенных гемопоэтических клеток стадии b).11. Способ по п.10, где указанная миелоаблятивная терапия является химиотерапией в высоких дозах.12. Способ лечения злокачественной опухоли у млекопитающего, получающего трансплантат стволовых клеток костного мозга или периферической крови, предусматривающий взаимодействие собранных клеток трансплантата ех vivo с вирусом везикулярного стоматита и введение этих очищенных клеток указанному млекопитающему.