Различные ссылки, проходящие по всему этому описанию, заключены в круглые скобки. Раскрытия этих публикаций в их полноте включено в настоящее описание в виде ссылок для более подробного описания того положения в данной технологии, к которому относится настоящее изобретение.
Предпосылки настоящего изобретения
Настоящее изобретение касается генома вируса гепатита В, выделенного из гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) и имеющего мутацию (метионина в треонин) у 133 аминокислотного остатка в пределах основного поверхностного антигена, его нуклеотидной последовательности, а также логически установленных четырех основных последовательностей белков, антигена, антитела, систем их обнаружения, разработки эффективных вакцин и антивирусных средств.
Гепатоцеллюлярная карцинома представляет собой один из наиболее распространенных видов рака печени человека, в особенности в Азии, где ежегодно выявляется 70% новых случаев этого заболевания. Обычно оно возникает при циррозе печени как осложнение хронического заболевания печени. Клинические проявления ГЦК неспецифичны, причем его признаки и симптомы появляются лишь на более поздних стадиях этого ракового заболевания.
Одним из основных случаев хронических заболеваний печени является инфекция гепатита В. Впервые открытый в 1963 году как человеческий вирус, который передается парентерально, вирусная инфекция хронического гепатита В обычно наиболее вовлечена в невыявляемый серологически патогенез ГЦК. Несмотря на тот факт, что вирус гепатита В не демонстрирует черты полного вирусного онкогена, его вовлеченность в развитие ГЦК можно отнести к различным аспектам его взаимодействия с гепатоцитными клетками хозяина. К этим аспектам относится неодинаковая транскрипционная активность белка вируса, имеющего наименьшие размеры, а именно - Х-белка, которая способствует экспрессии многих клеточных генов-мишеней, включая протоонкогены. С другой стороны, у пациентов с ГЦК в хромосомах клеток хозяина регулярно обнаруживается ДНК вируса, составляющая с ними единое целое. Существуют также доказательства того, что в развитии ГЦК активную роль играет основной поверхностный антиген. Этот белок служит основным маркером выявления носителей вируса гепатита В. Наибольшая антигенная детерминанта вируса гепатита В представляет собой хорошо сохранившуюся область, охватывающую 23 аминокислотных остатка, она располагается на основном поверхностном антигене на позициях аминокислот с номерами с 124 по 147. Эта небольшая зона, обозначенная как группа специфической детерминанты «а», была обнаружена во всех подтипах и была выделена из геномов вируса гепатита В. Предполагается, что антигенные свойства вызваны ее вероятной структурой с двойной петлей, с которой связывается поствакцинальное нейтрализующее антитело.
Наши эпидемиологические данные показывают, что основной поверхностный антиген вируса натурального типа был обнаружен у большинства пациентов с ГЦК. Более того, наблюдения показывают, что некоторые варианты этого основного поверхностного антигена от пациентов с ГЦК могут быть вовлечены в патогенез ГЦК. Непосредственное секвенирование показало, что у 24 из 63 пациентов с ГЦК (около 38%) имеются различные мутации в антигенной детерминанте «а» основного поверхностного антигена. При сочетании вируса натурального типа с другими разновидностями доля разновидностей вируса с мутацией (метибнина в треонин) у 133 аминокислотного остатка, расположенного на первой петле детерминанты «а» основного поверхностного антигена, у 63 пациентов с ГЦК (регион юго-восточная Азия) составляет 12,7%, и эта разновидность была обнаружена в 5 случаях локальной ГЦК. Однако та же самая мутация выявляется только у 2% носителей вируса гепатита В из случайной выборки населения (более 100 случаев). Важность указанной разновидности с мутацией у 133 аминокислотного остатка усиливает тот факт, что доля разновидностей вируса с мутацией у 145 аминокислотного остатка (глицина в аргинин), лучше известная как поствакцинальный мутант и расположенная на второй петле указанной антигенной детерминанты «а», остается постоянной у 8% носителей вируса гепатита В из случайной выборки населения.
Хотя этот вариант штамма вируса гепатита В, несущий мутацию у 133 аминокислотного остатка (метионина в треонин) основного поверхностного антигена, может возникнуть у пациентов с ГЦК по-иному, чем в поствакцинальных вариантах (т.е. с мутацией у 145 аминокислотного остатка основного поверхностного антигена), эти штаммы имеют сходные характеристики. Они заключаются в том, что оба штамма стабильны, имеются сведения об их вертикальной трансмиссии, несмотря на то что эффективно используется профилактика вируса гепатита В и иммуноглобулин гепатита В (HBIG).
Рассматривается появление варианта вируса гепатита В, несущего мутации в антигенной детерминанте «а» основного поверхностного антигена в случае ГЦК. Большая доля указанных мутантных вирусов с замещением у 133 аминокислотного остатка основного поверхностного антигена представляет собой особый интерес, поскольку это может указать на непосредственную связь с патогенезом ГЦК. Эта взаимосвязь потребует неотложную разработку специфических систем выявления наряду с разработкой эффективных профилактических вакцин и противовирусных средств. Определение нуклеотидной последовательности в этом мутантном вирусе представляет собой первый шаг в достижении этих целей и будет определенно полезным для разработки указанных выше диагностических схем и схем лечения.
Краткое содержание настоящего изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает изолированный штамм вируса гепатита В, обозначенный как поверхностный антиген вируса гепатита В человека-'S'-133 штамм ООН (метионин заменен на треонин), составная часть которого - геном вируса - был депонирован Европейской коллекцией клеточных культур 15 декабря 1997 года под инвентарными номерами Р97121501, Р97121502 и Р97121503.
Настоящим изобретением обеспечивается также изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В; причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота, занимающая позицию под номером 133 этого полипептида, представляет собой скорее треонин, чем метионин.
Это изобретение обеспечивает также способ продуцирования полипептида и способ получения указанного полипептида в очищенной форме, для того чтобы выявить очищенный полипептид, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота, занимающая позицию под номером 133 этого полипептида, представляет собой скорее треонин, чем метионин.
Настоящее изобретение обеспечивает также олигонуклеотид, включающий по меньшей мере 15 нуклеотидов, способных к специфической гибридизации только с последовательностями указанного штамма мутантного вируса гепатита В.
Это изобретение обеспечивает также способ получения антител к указанному полипептиду и продуцируемых им антител.
Настоящее изобретение обеспечивает применение описанной выше нуклеиновой кислоты, полипептида, пептида или антител, для того чтобы определить, инфицирован ли субъект описанным выше штаммом вируса.
Настоящее изобретение обеспечивает использование описанной выше нуклеиновой кислоты, полипептида, пептида или антител, для того чтобы определить, имеет ли субъект предрасположенность к гепатоцеллюлярной карциноме.
Это изобретение обеспечивает также вакцину, способную предотвратить или лечить гепатоцеллюлярную карциному, а также вакцину для лечения или предотвращения инфекции, вызванной описанным выше штаммом мутантного вируса гепатита В.
Кроме того, это изобретение обеспечивает способ идентификации химического соединения, способного лечить или предотвращать гепатоцеллюлярную карциному, а также составы, содержащие это соединение.
Настоящее изобретение обеспечивает также способ идентификации химического соединения, способного лечить или предотвратить инфекцию, вызванную определенным выше мутантным штаммом, а также составы, содержащие это соединение.
Краткое описание чертежей
Фиг.1. Структура четырех открытых рамок считывания генома вируса гепатита В человека, выделенного из ГЦК (имеющаяся мутация метионина в треонин у 133 аминокислотного остатка основного поверхностного антигена помечена звездочкой). Основные белки вируса, которые представляют собой: ДНК-полимеразу, большой/средний/основной поверхностный антиген, прекапсиду, капсиду и трансактивирующий Х-белок, обозначены соответственно как Р, PreS1/Pres S2/S, PreC, С.
Фиг.2. Стратегия клонирования и секвенирование того же генома вируса гепатита В.
Подробное описание настоящего изобретения
По всему настоящему описанию делаются ссылки на специфические нуклеотиды, эти ссылки относятся к нуклеотидам, присутствующим в кодирующей цепи нуклеиновой кислоты. Для обозначений специфических нуклеотидов в описании используется следующая стандартная аббревиатура:
Настоящее изобретение обеспечивает нуклеотидную последовательность генома вируса гепатита В, выделенного из гепатоцеллялярной карциномы (ГЦК) и имеющего мутацию (метионина в треонин) у 133 аминокислотного остатка основного поверхностного антигена, содержащего 3215 нуклеотидов (рис.4), которая кодирует 4 перекрывающиеся последовательности белка вируса, изображенные на рис.4-7.
Изобретение обеспечивает последовательности аминокислот четырех основных белков вируса, которые включают: ДНК-полимеразу, большой/средний/основной поверхностный антиген, капсиду и трансактивирующий Х-белок. Эти белки могут быть продуцированы по рекомбинантной технологии и использованы при разработке поликлональных или моноклональных антител.
Настоящее изобретение обеспечивает также систему диагностики вируса гепатита В, специфическую для мутации (метионина в треонин) у 133 аминокислотного остатка основного поверхностного антигена, в которой используются описанные выше последовательности нуклеотидов или последовательности белков, или антитела.
Настоящее изобретение обеспечивает изолированный штамм вируса гепатита В, обозначенный как поверхностный антиген вируса гепатита В человека-'S'-133 штамм ООН (метионин заменен на треонин), составная часть которого - геном вируса - был депонирован под инвентарными номерами Р97121501, Р97121502 и Р97121503.
Настоящим изобретением обеспечивается также изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В; причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин. В специфическом воплощении настоящего изобретения указанный полипептид кодируется нуклеотидами с номерами с 155 по 835 из последовательности нуклеиновых кислот (обозначенной как последовательность I.D. No.1); на 587-589 позициях этой последовательности вместо нуклеотидов «АЦГ» находятся нуклеотиды «АТГ».
Указанная нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК или РНК, в частности кДНК или ДНК генома.
В другом воплощении настоящего изобретения указанный полипептид имеет последовательность аминокислот, в значительной степени такую же, как аминокислотные остатки с номерами с 174 по 400 из последовательности аминокислот, обозначенной как I.D. No.3.
Это изобретение обеспечивает, кроме того, изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, причем этот пептид кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотиды с номерами с 527 по 595 из последовательности I.D. No.1.
Это изобретение обеспечивает также изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, причем в последовательность аминокислот этого пептида входят аминокислотные остатки с номерами с 298 по 320 из последовательности аминокислот, обозначенной как I.D. No.3.
Настоящее изобретение обеспечивает также вектор, включающий изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота, занимающая позицию под номером 133 этого полипептида, представляет собой скорее треонин, чем метионин, и функционально связана с промотором транскрипции РНК.
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает вектор, включающий изолированную нуклеиновую кислоту, которая кодирует пептид, причем этот пептид кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды с номерами с 527 по 595 из последовательности I.D. No.1.
В частности, оба упомянутые выше вектора включают вирус-специфическую ДНК.
Настоящее изобретение обеспечивает также систему «хозяин - вектор», предназначенную для продуцирования полипептида или пептида, в которую входят описанные выше вектора в подходящей клетке-хозяине.
Это изобретение обеспечивает также способ продуцирования полипептида, включающий культивирование описанной выше системы «хозяин - вектор» в подходящих для этого условиях, позволяющих продуцирование указанного полипептида или пептида и их обнаружение.
Это изобретение, кроме того, обеспечивает способ получения полипептида или пептида в очищенной форме, который включает: (а) введение любого из описанных выше векторов в подходящую клетку-хозяин; (б) культивирование полученной в результате клетки-хозяина в целях продуцирования ей указанного полипептида; (в) обнаружение полипептида, продуцированного на стадии (б); и (г) очистку обнаруженного полипептида или пептида.
Настоящее изобретение обеспечивает также очищенный полипептид, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота, занимающая позицию под номером 133 этого полипептида, представляет собой скорее треонин, чем метионин. В частности, можно получить очищенный полипептид или пептид при использовании описанных выше способов.
Это изобретение обеспечивает также очищенный пептид, причем последовательность аминокислот этого пептида включает аминокислотные остатки с номерами с 298 по 320 из последовательности аминокислот, обозначенной как I.D. No.3.
Это изобретение обеспечивает, кроме того, олигонуклеотид, содержащий по крайней мере 15 нуклеотидов, способных к специфической гибридизации с однозначно определяемой последовательностью нуклеотидов в пределах нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионинин, при условии, что отсутствует гибридизация с любой последовательностью нуклеотидов в пределах нуклеиновой кислоты, которая кодирует основный поверхностный антиген вируса натурального гепатита В. В одном из воплощений указанный олигонуклеотид содержит нуклеотиды с номерами с 527 по 595 из последовательности I.D. No.1.
Настоящее изобретение обеспечивает также состав, способный стимулировать продуцирование антител к указанному полипептиду или способствовать их продуцированию.
Это изобретение обеспечивает также способ получения антител к полипептиду, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; а не к основному поверхностному антигену вируса натурального гепатита В. Этот способ включает: (а) получение указанного полипептида в очищенной форме; (б) иммунизацию организма, способного продуцировать антитела к указанному очищенному полипептиду; (в) сбор продуцированных антител; (г) соединение продуцированных антител и указанного очищенного полипептида в условиях, приводящих к образованию комплекса; и (д) определение, какие из продуцированных антител образуют комплекс с указанным очищенным полипептидом, для того чтобы получить антитела к указанному полипептиду. В одном частном воплощении настоящего изобретения этот полипептид кодируется нуклеотидами с номерами с 155 по 835 из последовательности нуклеиновых кислот, обозначенной как I.D. No.1. В другом воплощении настоящего изобретения указанный полипептид имеет последовательность аминокислот, в значительной степени идентичную аминокислотным остаткам с номерами с 174 по 400 из последовательности аминокислот, обозначенной как I.D. No.3.
Возможно получение этих антител из такого организма, как кролик или мышь.
Изобретение обеспечивает также способ получения антител к пептиду, причем указанный пептид имеет последовательность аминокислот, включающую аминокислотные остатки с номерами с 298 по 320 из последовательности аминокислот, обозначенной как I.D. No.3, который включает: (а) получение указанного пептида в очищенной форме; (б) иммунизацию организма, способного продуцировать антитела к указанному очищенному пептиду; (в) сбор продуцированных антител; (г) соединение продуцированных антител и указанного очищенного пептида в условиях, приводящих к образованию комплекса; и (д) определение, какие из полученных антител образуют комплекс с указанным очищенным пептидом, для того чтобы получить антитела к указанному пептиду.
Это изобретение обеспечивает также антитела, полученные описанными выше способами, более конкретно, - моноклональные антитела.
Кроме того, это изобретение обеспечивает антитела, способные выявлять полипептид, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 такого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин, и не способны выявлять основный поверхностный антиген вируса натурального гепатита В.
Это изобретение обеспечивает и антитела, способные выявлять пептид, причем указанный пептид имеет последовательность аминокислот, содержащую аминокислотные остатки с номерами с 298 по 320 из последовательности аминокислот, обозначенной как I.D. No.3.
Это изобретение обеспечивает также применение нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 такого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин, для того чтобы установить, инфицирован ли субъект вирусом штамма гепатита В, обозначенным как поверхностный антиген вируса гепатита В человека-'S'-133 штамм ООН (метионий заменен на треонин). Причем такое определение включает: (а) получение от этого субъекта пробы соответствующей нуклеиновой кислоты; и (б) определение, является ли эта проба нуклеиновой кислоты со стадии (а) той нуклеиновой кислотой, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; или же производным этой кислоты.
В одном воплощении настоящего изобретения проба нуклеиновой кислоты со стадии (а) содержится мРНК, соответствующую транскрипту ДНК, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; причем определение на стадии (б) включает: (i) контактирование указанной мРНК с описанным выше олигонуклеотидом в условиях, допускающих сцепление этой мРНК с указанным олигонуклеотидом с образованием комплекса; (ii) выделение образовавшегося при этом комплекса; и (iii) идентификацию в выделенном комплексе указанной мРНК, для того чтобы определить, является ли эта мРНК той нуклеиновой кислотой, которая кодирует данный полипептид, или является ее производным.
В другом воплощении настоящего изобретения указанная проба нуклеиновой кислоты со стадии (а) содержит мРНК, соответствующую транскрипту ДНК, кодирующей полипептид, который является мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 такого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; причем определение на стадии (б) включает: (i) трансляцию указанной мРНК в условиях, подходящих для получения последовательности аминокислот; и (ii) сравнение последовательности аминокислот со стадии (i) с последовательностью аминокислот, кодируемой описанной выше изолированной нуклеиновой кислоты, для того чтобы определить, представляет ли эта проба нуклеиновой кислоты ту нуклеиновую кислоту, которая кодирует данный полипептид, или является ее производным.
Далее, стадию (б) можно определить как: (i) амплификацию нуклеиновой кислоты, присутствующей в пробе со стадии (а); и (ii) выявление присутствия полипептида в полученной в результате амплификации нуклеиновой кислоте.
Это изобретение обеспечивает применение антител, которые распознают полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 такого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; для того чтобы определить, инфицирован ли данный субъект штаммом вируса гепатита В, обозначенным как поверхностный антиген вируса гепатита В человека-'S'-133 штамм ООН (метионин заменен на треонин); причем такое определение включает: (а) получение от указанного субъекта соответствующей пробы; и (б) определение, представляет ли эта проба со стадии (а) ту нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 такого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин, или же ее производным. Это определение проводят путем контактирования указанной пробы при условиях, соответствующих ее связыванию с антителами, распознающими указанный полипептид, для того чтобы выявить, инфицирован ли данный субъект.
В описанных выше применениях эта изолированная нуклеиновая кислота, олигонуклеотид или антитело могут иметь метку, нанесенную выявляемым маркером. Примеры выявляемых маркером включают радиоактивные изотопы, флуорофоры и ферменты.
В разных воплощениях настоящего изобретения указанная проба может включать кровь, ткани организма или сыворотки.
Это изобретение обеспечивает также применение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; для того чтобы определить, имеет ли субъект предрасположенность к гепатоцеллюлярной карциноме. Причем такое определение включает: (а) получение от указанного субъекта пробы соответствующей нуклеиновой кислоты; и (б) определение, является ли эта проба нуклеиновой кислоты со стадии (а) той нуклеиновой кислотой, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; или же производным этой кислоты.
В одном воплощении настоящего изобретения эта проба нуклеиновой кислоты со стадии (а) содержит мРНК, соответствующую транскрипту ДНК, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; а определение на стадии (б) включает: (i) контактирование указанной мРНК с олигонуклеотидом в условиях, допускающих сцепление этой мРНК с указанным олигонуклеотидом с образованием комплекса; (ii) выделение образовавшегося при этом комплекса; и (iii) идентификацию в выделенном комплексе указанной мРНК, для того чтобы определить, является ли эта мРНК той нуклеиновой кислотой, которая кодирует данный полипептид, или является ее производным.
В другом воплощении настоящего изобретения указанная проба нуклеиновой кислоты со стадии (а) содержит мРНК, соответствующую транскрипту ДНК, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на 133 позиции этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; а определение на стадии (б) включает: (i) трансляцию указанной мРНК в условиях, подходящих для получения последовательности аминокислот; и (ii) сравнение указанной последовательности аминокислот со стадии (i) с последовательностью аминокислоты указанной изолированной нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, причем последовательность аминокислот указанного полипептида в существенной степени идентична аминокислотам с номерами с 174 по 400 из последовательности аминокислот, обозначенной как последовательность I.D.No.3; для того чтобы определить, является ли эта проба нуклеиновой кислоты той нуклеиновой кислотой, которая кодирует данный полипептид, или она представляет собой производное этой кислоты.
В другом воплощении настоящего изобретения определение на стадии (б) включает: (i) амплификацию нуклеиновой кислоты, присутствующей в пробе со стадии (а); и (ii) выявление присутствия полипептида в полученной в результате амплификации нуклеиновой кислоте.
Это изобретение обеспечивает, кроме того, применение антител, распознающих полипептид, который является мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин, для того чтобы определить, предрасположен ли субъект к гепатоцеллюлярной карциноме, причем такое определение включает в себя: (а) получение от этого субъекта соответствующей пробы; и (б) определение, является ли проба со стадии (а) той нуклеиновой кислотой, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин, или же производным этой кислоты; это определение проводят при контактировании с указанной пробой в условиях, соответствующих связыванию с антителами, выявляющими указанный полипептид, для того чтобы выявить, инфицирован ли субъект.
В описанных выше применениях эта изолированная нуклеиновая кислота, олигонуклеотид или антитело могут иметь метку, нанесенную выявляемым маркером. Примеры выявляемых маркером включают радиоактивные изотопы, флуорофоры и ферменты.
В разных воплощениях настоящего изобретения указанная проба может включать кровь, ткани организма или сыворотки.
Настоящее изобретение обеспечивает способ идентификации химического соединения для получения лекарственного средства, способного лечить инфекцию штамма вируса гепатита В, обозначенного как поверхностный антиген вируса гепатита В человека-'S'-133 штамм ООН (метионин заменен на треонин), который включает: (а) контактирование полипептида, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 такого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; с указанным химическим соединением в условиях, допускающих связывание указанного пептида с химическим соединением; (б) выявление специфического связывания указанного химического соединения с этим полипептидом; и (в) определение, ингибирует ли это химическое соединение указанный полипептид, для того чтобы идентифицировать химическое соединение, способное лечить инфекцию указанного штамма вируса.
Настоящее изобретение обеспечивает также способ идентификации химического соединения для получения лекарственного средства, способного предотвратить инфекцию штамма вируса гепатита В, обозначенного как поверхностный антиген вируса гепатита В человека-'S'-133 штамм ООН (метионин заменен на треонин), который включает: (а) контактирование полипептида, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 такого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; с указанным химическим соединением в условиях, допускающих связывание указанного пептида с химическим соединением; (б) выявление специфического связывания указанного химического соединения с этим полипептидом; и (в) определение, ингибирует ли это химическое соединение указанный полипептид, для того чтобы идентифицировать химическое соединение, способное предотвратить инфекцию этого штамма вируса.
Настоящее изобретение обеспечивает также способ идентификации химического соединения для получения лекарственного средства, способного лечить гепатоцеллюлярную карциному, который включает: (а) контактирование полипептида, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 такого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; с указанным химическим соединением в условиях, допускающих связывание указанного полипептида с химическим соединением; (б) выявление специфического связывания указанного химического соединения с этим полипептидом; и (в) определение, ингибирует ли это химическое соединение указанный полипептид, для того чтобы идентифицировать химическое соединение, способное лечить инфекцию этого штамма вируса.
Настоящее изобретение обеспечивает также способ идентификации химического соединения для получения лекарственного средства, способного предотвратить гепатоцеллюлярную карциному, который включает: (а) контактирование полипептида, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 такого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; с указанным химическим соединением в условиях, допускающих связывание указанного полипептида с химическим соединением; (б) выявление специфического связывания указанного химического соединения с этим полипептидом; и (в) определение, ингибирует ли это химическое соединение указанный полипептид, для того чтобы идентифицировать химическое соединение, способное предотвратить инфекцию этого штамма вируса.
Настоящее изобретение обеспечивает, кроме того, состав, содержащий химическое соединение, идентифицируемое приведенными выше способами, в таких количествах, которые эффективны для лечения или предотвращения инфекции этого штамма; а также фармацевтически эффективный носитель.
Настоящее изобретение обеспечивает, кроме того, состав, содержащий полипептид, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин, или его производное; причем количество такого полипептида эффективно для того, чтобы стимулировать продуцирование антител у субъекта или усилить их продуцирование; а также фармацевтически приемлемый носитель.
Указанное реальное эффективное количество полипептида будет зависеть от размера конкретного полипептида, его способности к биологической деструкции, биологической активности этого полипептида и его биологической доступности. Если конкретный полипептид не характеризуется быстрой деструкцией, биологически доступен и имеет высокую активность, то для обеспечения эффективности будет необходимо меньшее количество этого полипептида. Это эффективное количество будет известно квалифицированным в этой области людям; оно также будет зависеть от формы указанного полипептида, его размера и биологической активности. Например, требуемое количество полипептида снизит применение адъювантов. Квалифицированный в этой области человек сможет обычным способом провести эмпирические тесты на активность, чтобы в биологической пробе определить биологическую активность полипептида и таким образом установить это эффективное количество полипептида.
Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны людям, квалифицированным в этой области, и к ним относятся (но ими не ограничены): 0,01-0,1 М фосфатный буфер (а предпочтительно - 0,05 М) или 0,8% физиологический раствор. Кроме того, такие фармацевтически приемлемые носители могут представлять собой водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей могут быть: пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла (типа оливкового масла) и пригодные для инъекции органические сложные эфиры (типа этилолеата). Водные носители включают: воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая среду физиологического раствора или буфера. Парентеральные носители включают: раствор хлорида натрия, Рингер-декстрозу, декстрозу и хлорид натрия, Рингер-лактат или жирные (нелетучие) масла. Внутривенные носители включают жидкие и питательные наполнители, наполнители-электролиты (такие как наполнители на основе Рингер-декстрозы) и им подобные. Возможно также присутствие консервантов и других добавок, таких, как, например, антимикробные средства, антиоксиданты, хелатные агенты, инертные газы и т.п.
Настоящее изобретение обеспечивает также состав, содержащий пептид, причем последовательность аминокислот указанного пептида включает аминокислотные остатки с номерами с 298 по 320 из последовательности аминокислот, обозначенной как I.D. No. 3, или его производное в таком количестве, которое эффективно, чтобы стимулировать продуцирование антител у субъекта, или усилить их продуцирование; а также фармацевтически приемлемый носитель.
Это изобретение обеспечивает также составы, в которые входят химическое соединение, идентифицированное описанными выше способами, в количестве, эффективном для лечения или предотвращения гепатоцеллюлярной карциномы, а также фармацевтически эффективный носитель.
Настоящее изобретение обеспечивает также состав, в который входит химическое соединение, идентифицированное описанными выше способами, в количестве, эффективном для лечения или предотвращения инфекции штамма вируса гепатита В, обозначенного как поверхностный антиген вируса гепатита В человека-'S'-133 штамм ООН (метионин заменен на треонин), а также фармацевтически эффективный носитель.
Настоящее изобретение обеспечивает также применение описанных выше составов для лечения субъекта, инфицированного штаммом вируса гепатита В, обозначенного как поверхностный антиген вируса гепатита В человека-'S'-133 штамм ООН (метионин заменен на треонин).
Настоящее изобретение обеспечивает также применение описанных выше составов для предотвращения инфицирования субъекта штаммом вируса гепатита В, обозначенного как поверхностный антиген вируса гепатита В человека-'S'-133 штамм ООН (метионин заменен на треонин).
Это изобретение обеспечивает также применение описанных выше составов для лечения или предотвращения гепатоцеллюлярной карциномы.
Это изобретение обеспечивает также способ скрининга жидкостей организма субъекта в отношении штамма вируса гепатита В, обозначенного как поверхностный антиген вируса гепатита В человека-'S'-133 штамм ООН (метионин заменен на треонин), который включает:
(а) получение соответствующего образца жидкости организма от указанного субъекта; (б) выявление в образце со стадии (а) присутствия полипептида, представляющего собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин, для того чтобы осуществить скрининг этого образца в отношении указанного штамма. В частности, в указанные жидкости организма включают: кровь, сыворотку или пробу нуклеиновой кислоты крови или сыворотки.
Это изобретение, кроме того, обеспечивает способ лечения субъекта, инфицированного указанным штаммом вируса.
Настоящее изобретение обеспечивает также способ скрининга тканей и жидкостей организма в отношении указанного штамма вируса.
Настоящее изобретение обеспечивает также вакцину против гепатита, которая включает мутантную форму поверхностного антигена вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин.
Это изобретение обеспечивает также описанную выше вакцину, содержащую также и адъювант.
Настоящее изобретение проиллюстрировано в приведенном далее разделе, в котором описаны экспериментальные подробности. Приведенные ниже разделы предназначены для помощи в понимании настоящего изобретения, а не для ограничения его каким-либо образом (и их не следует так рассматривать); суть настоящего изобретения изложена в следующей за этим разделом формуле изобретения.
Подробности эксперимента
В описанном ниже способе был выделен вирус гепатита В, несущий мутацию у 133 аминокислотного остатка основного поверхностного антигена, и была определена его нуклеотидная последовательность.
Проба сыворотки (5194) была получена от 63-летней китаянки, являвшейся носителем поверхностного антигена. При последующей биопсии у нее было установлено наличие ГЦК. Вирус гепатита В из образца ее сыворотки имел мутацию у 133 аминокислотного остатка (метионина в треонин) в основном поверхностном антигене, что было показано предварительным секвенированием антигенной детерминанты «а». ДНК вируса экстрагировали до определения ее последовательности в настоящем изобретении.
Как описано ниже в примерах, геном этого мутантного вируса гепатита В, выделенный из ГЦК и имеющий мутацию в основном поверхностном антигене у 133 аминокислотного остатка, содержит 3215 нуклеотидов, идентичных нуклеотидам вируса натурального типа того же подтипа (adr). При сравнении с вирусом натурального типа открытые рамки считывания (ОРС), кодирующие основные белки вируса, были обнаружены на соответствующих местах. Положение 1 в геноме мутантного вируса гепатита В определяется по положению в вирусе натурального типа.
Структуры разных ОРС в геноме мутантного вируса суммированы на фиг.1, их расположение определяют следующим образом:
- Ген ДНК-полимеразы берет начало у 2307 позиции и заканчивается у 1623 позиции; таким образом, он содержит 2532 нуклеотида и кодирует 843 аминокислотных остатка.
- Ген большого поверхностного антигена берет начало у 2848 позиции и заканчивается у 835 позиции; таким образом, он содержит 1203 нуклеотида и кодирует 400 аминокислотных остатка. Этот большой поверхностный антиген перекрывает среднюю часть антигена, начинающуюся у 3205 позиции, и основную поверхность антигена, которая начинается у 155 позиции. И средний поверхностный антиген (содержащий 281 аминокислотный остаток), и основный поверхностный антиген (содержащий 226 аминокислотных остатков) заканчиваются у той же позиции, что и большой поверхностный антиген.
- Ген капсиды берет начало у 1814 позиции и заканчивается у 2452 позиции; таким образом, он содержит 639 нуклеотида и кодирует 212 аминокислотных остатков.
- Трансактивирующий Х-ген берет начало у 1374 позиции и заканчивается у 1838 позиции; таким образом он содержит 465 нуклеотида и кодирует 154 аминокислотных остатка.
Далее, секвенирование показало, что данный мутантный вирус гепатита В принадлежит к подтипу abr, на что указывает как наличие лизинового остатка у 122 позиции, так и остаток аргинина у 160 позиции основного поверхностного антигена. С приведенным выше исследованием антигенной детерминанты «а», которое было осуществлено методом непосредственного секвенирования, совпадает тот факт, что мутация (метионина в треонин) была обнаружена у 133 аминокислотного остатка основного поверхностного антигена.
По сравнению с вирусом натурального гепатита В, депонированным в генетической базе данных (инвентарный номер D 16665), идентичность указанного вируса штамма гепатита В для нуклеотидной последовательности составляет 90,3%. Идентичность различных белков настоящего мутантного вируса гепатита В по сравнению с их копиями в вирусе натурального типа составляет 88,3%, 95,8%, 97,5%, 95,1% и 94,7% соответственно для белков ДНК-полимеразы (инвентарный номер по идентификации белковых ресурсов PIR S43491), большого поверхностного антигена (инвентарный номер JQ2107 по PIR), капсидного белка (инвентарный номер S43490 по PIR) и трансактивирующего Х-белка (инвентарный номер S35529 по PIR). Напротив, в каждом из этих белков вируса имеются многочисленные замены аминокислот по сравнению с их дубликатами в вирусе натурального типа. Эти замещения включают: 5 мутаций в ДНК-полимеразе, 5 мутаций в большом поверхностном антигене (включая мутацию метионина в треонин в инициирующем кодоне основного поверхностного антигена), 5 мутаций в капсиде и 4 -в трансактивирующем Х-белке.
Геном вируса гепатита В по настоящему изобретению, выделенный из ГЦК и несущий мутацию основного поверхностного антигена у 133 аминокислотного остатка (метионина в треонин), можно применять как исходный материал для конструирования олигонуклеотидов, специфичных к этому мутантному геному вируса. Эти олигонуклеотиды могут быть применены как материал для высокоспецифичных диагностических агентов, выявляющих вирус, полученный из ГЦК и обладающий мутацией основного поверхностного антигена у 133 аминокислотного остатка.
Геном вируса гепатита В по настоящему изобретению, несущий мутацию основного поверхностного антигена у 133 аминокислотного остатка (метионина в треонин), можно использовать как исходный материал для продуцирования белков по настоящему изобретению. Это осуществляется при использовании стандартной рекомбинантной технологии ДНК путем экспрессии вектора, который несет релевантный участок кодирования, и репликация которого возможна в клетке-хозяине (типа Escherichia coli).
Белки по настоящему изобретению пригодны в качестве материала для высокоспецифичных диагностических агентов, способных выявить вирус гепатита В, выделенный из ГЦК и несущий мутацию основного поверхностного антигена у 133 аминокислотного остатка. Используя известные методы, эти же белки можно использовать для продуцирования поликлональных и моноклональных антител.
Поликлональные и моноклональные антитела можно использовать в качестве материала для диагностических агентов для проведения с целью высокоспецифичного выявления антигенов вируса гепатита В, выделенных из ГЦК и обладающих мутацией основного поверхностного антигена у 133 аминокислотного остатка (метионина в треонин).
Система обнаружения, использующая каждый из белков по настоящему изобретению или белки с частично замещенными аминокислотами, а также система обнаружения, использующая моноклональные или поликлональные для таких белков антитела, пригодны как высокоспецифичные диагностические агенты, способные выявить вирус гепатита В, выделенный из ГЦК, для того чтобы обнаружить указанный вирус у пациентов, которые являются носителями поверхностного антигена гепатита В и которые впсоледствие могут иметь риск развития ГЦК. Такие белки или антитела к этим белкам можно использовать как исходный материал при проведении разработки профилактической или лечебной вакцины против указанного штамма вируса.
Хорошо известно, что для продуцирования одного и того же белка один или более нуклеотидов из последовательности ДНК могут быть замещены другими нуклеотидами. Настоящее изобретение касается также таких замен нуклеотидов, которые кодируют белки, о которых говорится в настоящем изобретении. Также хорошо известно, что для получения аналога данной последовательности аминокислот одну или более аминокислоту последовательности белка можно заменить другими аналогичными аминокислотами, исходя из определения их гидрофильных свойств или зарядов. Могут быть использованы любые аналоги белков по настоящему изобретению, включающие замену аминокислот, делецию (вырезание или выброс внутреннего участка ДНК), или изостеры (модифицированные аминокислоты, обладающие близким структурным и пространственным сходством с белками аминокислот), добавку аминокислот или добавку изостеров; при условии, что полученная в результате этого последовательность активирует антитела, которые распознают вирус гепатита В, выделенный из ГЦК и имеющий мутацию основного поверхностного антигена у 133 аминокислотного остатка (метионина в треонин).
ПРИМЕРЫ
Последовательность нуклеотидов и логически установленная последовательность аминокислот вируса гепатита В, выделенного из ГЦК, обладающего мутацией основного поверхностного антигена у 133 аминокислотного остатка (метионина в треонин), были определены приведенным ниже способом.
1. Выделение ДНК вируса
ДНК вируса выделяли из пробы сыворотки (5194), полученной от 63-летней китаянки, являвшейся носителем поверхностного антигена. При последующей биопсии у нее было установлено наличие ГЦК. Вирус гепатита В из образца ее сыворотки имел мутацию у 133 аминокислотного остатка (метионина в треонин) в основном поверхностном антигене, что было показано предварительным секвенированием антигенной детерминанты «а».
Выделение ДНК проводили следующим образом.
200 мкл образца сыворотки добавили к 400 мкл лизисного буфера (Трис хлорид 10 мМ, рН 7,4; ЭДТА 1 мМ и 2% сульфат додецила натрия) и 25 мкл протеиназы К (20 мг/мл) и инкубировали при 65 °С в течение 3 ч. Затем ДНК вируса экстрагировали фенолом/хлороформом и осаждали этанолом.
2. Амплификация ДНК вируса с помощью цепной реакции полимеразы (ПЦР)
Геном вируса был амплифицирован с использованием цепной реакции полимеразы (ПЦР) при применение трех перекрывающихся последовательностей олигонуклеотидов, сконструированных согласно последовательности вируса натурального гепатита В. Для облегчения клонирования продуктов ПЦР были включены различные сайты рестрикции ферментов. Положение этих олигонуклеотидов показано на фиг. 2 и его определяют так:
- Flag 1 (АТААГЦТТАТГЦЦЦЦТАТЦТТАТЦААЦАЦТТЦЦГГА) (Последовательность I.D. No.6) начинается у места инициирования кодирующего участка ДНК-полимеразы, у 2307 позиции нуклеотидной последовательности вируса и соответствует кодирующей цепи (считывающий олигонуклеотид). Дополнительный сайг рестрикции фермента HindIII подчеркнут;
- Хbа3 (ГАГТЦТАГАЦТЦТГЦГГТАТТГТГА) (Последовательность I.D. No.7) начинается у внутреннего сайта рестрикции фермента XbaI, у 250 позиции нуклеотидной последовательности вируса и соответствует комплементарной цепи (олигонуклеотид, имеющий направление, противоположное считывающему). Дополнительный сайт рестрикции фермента XbaI подчеркнут;
- Хbа5 (ГАГТЦТАГАЦТЦГТГГТГГАЦТТЦТ) (Последовательность I.D. No. 8) начинается у внутреннего сайта XbaI в той же позиции, что и Хbа3 олигонуклеотид, но соответствует кодирующей цепи (считывающий олигонуклеотид). Дополнительный сайт рестрикции фермента XbaI подчеркнут;
- Common 3 (ТГАГААТТЦТЦАЦГГТГГТЦТЦЦАТГЦГАЦГТ) (Последовательность I.D. No.9) начинается у терминирующего кодона ДНК-полимеразы, у 1623 позиции нуклеотидной последовательности вируса и соответствует комплементарной цепи (олигонуклеотид, имеющий направление, противоположное считывающему). Дополнительный сайт рестрикции фермента EcoRI подчеркнут;
- V11 (ТТТГТТТАЦГТЦЦЦГТ) (Последовательность I.D. No.10) начинается около места инициирования Х-гена, у 1420 позиции нуклеотидной последовательности вируса и соответствует кодирующей цепи (считывающий олигонуклеотид);
- HmdIIIADW3 (ЦТААГЦТТАГТТТЦЦГГААГТГТТГАТ) (Последовательность I.D. No. 11) начинается около места инициирования ДНК-полимеразы, у 2340 позиции и соответствует комплементарной цепи (олигонуклеотид, имеющий направление, противоположное считывающему). Дополнительный сайт рестрикции фермента Hind III подчеркнут.
Затем, используя в качестве эталона ДНК вируса, цепную реакцию полимеразы (ПЦР) провели в термическом датчике циклов ДНК (Perkin-Elmer. Cetus). Реакцию осуществляли в течение 35 циклов, используя готовую к употреблению полимеразу (Stratagene, U.S.A.), причем в каждом из циклов 1,5 мин проводили при температуре денатурации, составляющей 94°С, 2 мин при температуре отжига, составляющей 53°С, и 4 мин при температуре удлинения, составляющей 72°С. Использовались следующие комбинации олигонуклеотидов: Flag1/Хbа3, Xba5/Common3 и V11/HindIIIADW3, а также полученные продукты амплификации, несущие 1,2 кбит, 1,4 кбит и 1,1 кбит соответственно.
3. Клонирование фрагментов амплифицированной ДНК вируса
Перед клонированием амплифицированный фрагмент ДНК вируса из сочетания олигонуклеотидов Flag1/Хbа3 (1,2 кбит) подвергли ферментативному гидролизу рестрикционными ферментами HindII и XbaI. Клонирование осуществляли в BlueScript плазмиде, предварительно обработанной теми же рестрикционными ферментами. Аналогичному ферментативному гидролизу с помощью XbaI and EcoRI перед клонированием был подвергнут продукт ПЦР из комбинации олигонуклеотидов Xba5/Common3 (1,4 кбит). Клонирование проводили в BlueScript плазмиде, предварительно обработанной XbaI and EcoRI. Напротив, фрагмент ДНК, амплифицированный V11 и HindIIIADW3 (1,1 кбит), клонировали непосредственно в ZeroBlunt плазмиду, которую разработали в InvitroGen (U.S.A.) для клонирования «тупых» (дефосфорилированных) фрагментов ДНК.
4. Определение последовательности нуклеотидов
Последовательность нуклеотидов вируса гепатита В, выделенного из ГЦК и обсуждаемого в настоящем изобретении, определяли на плазмиде матричной ДНК с помощью ингибиторов обрыва цепи, при этом использовали набор для секвенирования ДНК (Sequenase DNA Sequencing Kit, United States Biochemical Corp.). Для облегчения процедуры секвенирования в соответствии с натуральным типом вируса гепатита В были сконструированы разные внутренние олигонуклеотиды (от V1 до V13); их расположение показано на фиг.2.
Исходя из описанного выше анализа, была установлена по всей своей длине последовательность нуклеотидов вируса гепатита В, выделенного из ГЦК и обладающего мутацией основного поверхностного антигена у 133 аминокислотного остатка (метионина в треонин); она приведена на рис. 3. Логически установленные последовательности аминокислот, кодирующие главные белки вируса, показаны на рис. 4-7: ДНК-полимераза вируса гепатита В (рис.4), большой поверхностный антиген (рис.5), капсидный белок (рис.6) и трансактивирующий Х-белок (рис.7).
Подгонка последовательности вируса по настоящему изобретению под последовательности других, доступных из базы данных генетического банка (Genbank database) вирусов гепатита В, должно указать на специфическую разницу последовательностей; это, в свою очередь, можно использовать для конструирования ДНК-зондов. После этого может быть разработана система обнаружения, использующая цепные реакции полимеразы (ПЦР). Поскольку эти реакции ПЦР будут включать комбинации олигонуклеотидов, специфичных для вируса гепатита В с мутацией основного поверхностного антигена у 133 аминокислотного остатка (метионина в треонин), то это позволит проводить высокоспецифичное выявление ДНК мутантного вируса. Короче говоря, ДНК вируса можно выделить таким образом, как это описано в настоящем изобретении. Цепные реакции полимеразы могут быть осуществлены при использовании специфических олигонуклеотидов в условиях, аналогичных описанным выше. После растворения продуктов ПЦР на 1% геле агарозы можно проанализировать полученные результаты.
Согласно известной иммунологической методике, из последовательностей белка (типа приведенных на рис.4-7) можно определить антигенные детерминанты. Определение этих антигенных детерминант, специфичных для вируса гепатита В, выделенного из ГЦК и имеющего мутацию основного поверхностного антигена у 133 аминокислотного остатка (метионина в треонин), должно позволить, используя методы генной инженерии, осуществить синтез пептидов, синтез белков, получение антител, разработать специфические диагностические реагенты, создать профилактические и лечебные вакцины, а также противовирусные средства.
Систему обнаружения антител для вируса гепатита В, выделенного из ГЦК и имеющего мутацию основного поверхностного антигена у 133 аминокислотного остатка (метионина в треонин), можно разработать, используя поливиниловые микротитровальные пластинки и метод сэндвича. Коротко говоря, 50 мкл пептида вируса гепатита В, выделенного из ГЦК и имеющего мутацию основного поверхностного антигена у 133 аминокислотного остатка (метионина в треонин), в концентрации 5 мкг/мл можно распределить в каждую из ячеек поливиниловых микротитровальных пластин и для консолидации инкубировать их при комнатной температуре в течение ночи. Аналогичную методику можно применить в отношении белка, очищенного из клеток-хозяина (типа Escherichia coli). Эти ячейки микропластин можно 5 раз промыть физиологическим раствором, содержащим 0,05% Твин 20. В качестве покрытия в каждую из этих ячеек можно распределить по 100 мкл буферного хлорида натрия, содержащего 30% (объем/объем) телячьей сыворотки и 0,05% Твин 20 (CS буфер). После инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре эти покрытия можно удалить.
Для того чтобы в сыворотке определить антитела, специфичные для этого мутантного вируса гепатита В (с мутацией метионина в треонин у 133 аминокислотного остатка основного поверхностного антигена), первоначально реакцию можно проводить так: 50 мкл указанного CS буфера и 10 мкл образца сыворотки можно распределить в каждую из ячеек микропластины и инкубировать на вибраторе для микропластин в течение 1 ч при комнатной температуре. После завершения этой первой реакции ячейки микропластины промывают 5 раз, как это было описано выше.
По второй реакции 1 нг пероксидазы хрена с меткой антител человека к моноклональному иммуноглобулину IgG мыши и растворенных в 50 мкл сыворотки теленка можно распределить в каждую из ячеек микропластины и инкубировать 1 ч на вибраторе для микропластин при комнатной температуре. После завершения реакции ячейки микропластины можно промывать 5 раз тем же способом. После этого в каждую из ячеек добавили перекись водорода (в качестве субстрата) и 50 мкл раствора о-фенилендиамина (в качестве цветного проявителя) и провели инкубацию в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем в каждую ячейку можно добавить 50 мкл раствора 4 М серной кислоты, для того чтобы прекратить дальнейшее проявление и записать поглощение при 490 нм.
Настоящее изобретение делает возможным выявление мутантного вируса гепатита В, в частности вируса, имеющего мутацию основного поверхностного антигена у 133 аминокислотного остатка. Настоящее изобретение обеспечивает также систему обнаружения, способную к высокоспецифичному и чувствительному выявлению вируса на ранних стадиях инфицирования или развития ГЦК, когда ГЦК возможно лечить и вылечить.
Кроме того, указанные характерные черты настоящего изобретения позволяют проводить точную диагностику пациентов на ранней стадии ГЦК и помогают также с более высокой эффективностью подавлять мутантный вирус гепатита В.
Белки и их антитела по настоящему изобретению можно использовать, чтобы разработать профилактические и лечебные вакцины, а также и иммунологические лекарственные средства. Информация по секвенированию структурных генов указанных мутантных вирусов будет полезна при разработке систем обнаружения релевантных белковых антигенов и антител.
Комплексы антиген-антитело могут быть выявлены известными способами. Специфические моноклональные и поликлональные антитела можно получить при иммунизации животных (таких, как мыши и кролики) пептидами или белками, специфичными к мутантным вирусам гепатита В, выделенным из ГЦК. Подавляющие вирус противовирусные средства можно разработать в культуре клеток или in vivo и нацелить против таких белков и молекул.
Настоящее изобретение основано на изучении изолированного генома вируса, выделенного из ГЦК и имеющего мутацию основного поверхностного антигена у 133 аминокислотного остатка (метионина в треонин). Это изобретение делает возможным высокоспецифичное обнаружение указанного мутантного вируса гепатита В, выделенного из ГЦК, и обеспечивает исходный материал (такой, как белки, поликлональные и моноклональные антитела), чтобы разработать такие системы обнаружения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Oon, C-J., "Viral hepatitis В in Singapore: epidemiology, prevention and control-monitoring the hepatitis В programme and management of carriers." J.Royal College Physic. London (1997), in press.
2. Ogata, N., et al. "Infectivity and pathogenicity in chimpanzees of a surface gene mutant of hepatitis В virus thwt emerged in a vaccinated infant". J.Infec. Disease (1997) 175:511-523.
3. Oon, C-J., "Issues associated with HBV mutant strains." J.Royal College Physic. London (1997), in press.
4. Oon, C-J., et al. "Hepatitis В surface antigen (HBsAg) mutants - their significance". Annals Acad. Med. Singapore (1997), in press.
5. Tsai, C-J., et al. "Additive effect modification of hepatitis В surface antigen and e antiden on the development of hepatocellular carcinoma"/ Brit. J.Cancer (1996) 73:1498-1502.
6. Oon, C-J., "Molecular epidemiology of hepatitis В "a" variants and mutants: significance in immune population". JAMA (1996) 12:5-6.
7. Goh, K-T, "Hepatitis В immunization in Singapore" Lancet (1996) 348:1385-1386.
8. Oon, C-J., et al., "Natural history of hepatitis В surface antigen mutants in children". Lancet (1996) 348:1524-1525.
9. Harrison, T.J., "Genetic variation in hepatitis В virus", Eur. J. Gastroenter. & Hepatol. (1996) 8:306-311.
10. Oon, C-J., et al., "Molecular epidemiology of hepatitis В virus vaccine variants in Singapore". Vaccine (1995) 13:699-702.
11. Oon, C-J., et al. "Molecular epidemiology of hepatitis В "a" variants and mutants - significance and transmissibility". Proc.3nd Intematl. Svmp. Viral Hepatitis & HCC. Sigapore (1995) pp.39-43.
12. Carman, W., et al., "Viral genetic variation: hepatitis В virus as a clinical example". Lancet (1993) 341:349-353.
13. Harrison, T.J., "Variants of hepatitis В virus". Vox Sang (1992) 63:161-167.
14. Carman, W.F. et al., "Vaccine-induced escape mutant of hepatitis В virus". Lancet (1990) 336:325-329.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО ОБНАРУЖЕНИЯ HCV АНТИГЕНА/АНТИТЕЛА | 2014 |
|
RU2667429C2 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ СНИЖЕНИЯ УРОВНЯ HS В ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ НАПИТКАХ | 2008 |
|
RU2476590C2 |
| ВАРИАНТЫ ГЕМАГГЛЮТИНИНА И НЕЙРАМИНИДАЗЫ ГРИППА | 2010 |
|
RU2535970C2 |
| ХИМЕРНЫЕ ГЕНЫ OSPA, БЕЛКИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2011 |
|
RU2583289C2 |
| МЕНИНГОКОККОВЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ fHBP | 2009 |
|
RU2475496C2 |
| ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ | 2001 |
|
RU2228530C2 |
| КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА (ВАРИАНТЫ), СПОСОБЫ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ, ПРИМЕНЕНИЯ И СПОСОБЫ СТИМУЛЯЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТИХ КОМПОЗИЦИЙ | 2002 |
|
RU2316347C2 |
| ХИМЕРНЫЕ ГЕНЫ OSPA, БЕЛКИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2011 |
|
RU2773402C2 |
| ОПТИМИЗИРОВАННЫЕ С ПОМОЩЬЮ ВЫЧИСЛИТЕЛЬНЫХ СРЕДСТВ АНТИГЕНЫ С ШИРОКИМ СПЕКТРОМ РЕАКТИВНОСТИ ДЛЯ ВИРУСОВ ГРИППА H5N1 И H1N1 | 2013 |
|
RU2639551C2 |
| ПОЛИПЕПТИД С АСПАРТАТКИНАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТЫ | 2021 |
|
RU2821918C1 |
Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в медицине. В изобретении описывается изолированный штамм вируса гепатита В человека «S»-133 Оон, геном которого относится к подтипу adr, депонирован в Европейской коллекции клеточных культур под №№ Р97121504, или Р97121505, или Р 97121506, и кодирует полипептид основного поверхностного антигена вируса гепатита В человека. Упомянутый антиген имеет мутацию в аминокислотной последовательности (полипептид), а именно в 133 положении метионин заменен на треонин. Раскрыты варианты изолированных нуклеиновых кислот, кодирующих мутированный полипептид, и варианты изолированных нуклеиновых кислот, кодирующих пептиды с антигенными свойствами указанного полипептида. В тексте описания приведены нуклеотидные последовательности вариантов нуклеиновых кислот (НК), кодирующих упомянутый полипептид и пептиды. Описаны также варианты векторов для клонирования фрагментов ДНК мутантного вируса гепатита В человека, включающие соответственно изолированную НК и изолированную НК, функционально связанную с промотором транскрипции РНК, где каждая из изолированных НК кодирует указанный полипептид. Раскрыты способы продуцирования полипептида и пептида и способы получения очищенного полипептида и пептида с использованием указанных векторов. Описаны соответствующие очищенные полипептиды и пептиды мутированного антигена, сохраняющие антигенные свойства полипептидов природного вируса гепатита В человека, и способы получения антител к ним и анти-антитела, в том числе моноклональные антитела. Раскрыты также различные способы применения упомянутых изолированных НК, полипептидов и пептидов с целью диагностики и лечения заболеваний, связанных с вирусом гепатита В человека. Использование изобретения позволяет разрабатывать схемы диагностики и лечения заболеваний, связанных с мутированным вирусом гепатита В человека. 34 н. и 32 з.п. ф-лы, 2 ил.
(а) введение вектора по п.12 в подходящую клетку;
(б) культивирование полученной клетки для получения полипептида;
(в) выявление полипептида, полученного на стадии (б);
(г) очистку выявленного полипептида.
(а) введение вектора по п.13 в подходящую клетку;
(б) культивирование полученной клетки для получения пептида;
(в) выявление пептида, полученного на стадии (б);
(г) очистку выявленного пептида.
а) получение указанного полипептида в очищенной форме,
б) иммунизацию организма, способного продуцировать антитела к очищенному полипептиду,
в) сбор продуцированных антител,
г) контактирование антител со стадии в) с очищенным полипептидом в условиях, обеспечивающих образование комплекса,
д) определение специфического связывания антител с полипептидом и отбором антител по способности образовывать комплекс.
а) получение пептида в очищенной форме,
б) иммунизацию организма, способного продуцировать антитела к очищенному пептиду,
в) сбор продуцированных антител,
г) контактирование антител со стадии в) с очищенным пептидом в условиях, обеспечивающих образование комплекса,
д) определение специфического связывания антител с пептидом и отбором антител по способности образовывать комплекс.
а) получение от субъекта соответствующей пробы нуклеиновой кислоты и
б) определение, представляет ли проба нуклеиновой кислоты со стадии (а) ту нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена вируса гепатита В человека, в аминокислотной последовательности которого в 133 положении метионин заменен на треонин, или она является производной этой нуклеиновой кислоты.
а) контактирование указанной мРНК с олигонуклеотидом по п.22 в условиях, допускающих сцепление этой мРНК с олигонуклеотидом с образованием комплекса;
б) выделение образовавшегося комплекса и
в) идентификацию указанной мРНК в выделенном комплексе для определения, является ли эта мРНК той нуклеиновой кислотой, которая кодирует указанный полипептид, или является ее производной.
а) трансляцию указанной мРНК в условиях, подходящих для получения последовательности аминокислот, и
б) сравнение последовательности аминокислот со стадии (а) с последовательностью аминокислот, кодируемой изолированной нуклеиновой кислотой по п.9, для того чтобы определить, представляет ли эта проба нуклеиновой кислоты ту нуклеиновую кислоту, которая кодирует данный полипептид, или является ее производной.
а) амплификацию нуклеиновой кислоты, присутствующей в пробе со стадии (а),
б) выявление присутствия полипетида в полученной в результате амплификации нуклеиновой кислоте.
а) получение от субъекта соответствующей пробы,
б) определение, является ли проба со стадии (а) нуклеиновой кислотой, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена вируса гепатита В человека, в аминокислотной последовательности которого в 133 положении метионин заменен на треонин, или она является ее производной, которое осуществляют путем контактирования пробы пациента с антителом по п.32 или 33 в условиях, подходящих для связывания с антителом, и определяют инфицированность пациента.
а) получение от субъекта соответствующей пробы нуклеиновой кислоты,
б) определение, является ли проба со стадии (а) нуклеиновой кислотой, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В человека, охарактеризованного в п.1, в аминокислотной последовательности которого в 133 положении метионин заменен на треонин, или она является производной этой нуклеиновой кислоты.
а) контактирование указанной мРНК с олигонуклеотидом по п.22 в условиях, допускающих сцепление этой мРНК с олигонуклеотидом с образованием комплекса;
б) выделение образовавшегося комплекса и
в) идентификацию указанной мРНК в выделенном комплексе для определения, является ли эта мРНК той нуклеиновой кислотой, которая кодирует указанный полипептид, или является ее производной.
а) трансляцию указанной мРНК в условиях, подходящих для получения последовательности аминокислот, и
б) сравнение последовательности аминокислот со стадии (а) с последовательностью аминокислот, кодируемой изолированной нуклеиновой кислотой по п.9, для того чтобы определить, представляет ли эта проба нуклеиновой кислоты ту нуклеиновую кислоту, которая кодирует данный полипеитид, или является ее производной.
а) амплификацию нуклеиновой кислоты, присутствующей в указанной пробе со стадии (а); и
б) выявление присутствия полипептида в полученной в результате амплификации нуклеиновой кислоте.
а) получение от субъекта соответствующей пробы нуклеиновой кислоты,
б) определение, является ли проба со стадии (а) нуклеиновой кислотой, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена вируса гепатита В человека, охарактеризованного в п.1, в аминокислотной последовательности которого в 133 положении метионин заменен на треонин, или она является ее производной, которое осуществляют путем контактирования пробы пациента с антителом по п.32 в условиях, подходящих для связывания с антителом, и определяют предрасположенность указанного субъекта к гепатоцеллюлярной карциноме.
а) контактирование полипептида, представляющего собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В человека, в аминокислотной последовательности которого в 133 положении метионин заменен на треонин, с указанным химическим соединением в условиях, обеспечивающих связывание указанного полипептида с этим химическим соединением,
б) выявление специфического связывания химического соединения с полипептидом и
в) определение связи между химическим соединением и полипептидом для идентификации химического соединения, способного лечить инфекцию, вызванную указанным штаммом вируса.
а) контактирование полипептида, представляющего собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, в аминокислотной последовательности которого в 133 положении метионин заменен на треонин, с указанным химическим соединением в условиях, обеспечивающих связывание указанного полипептида с этим химическим соединением,
б) выявление специфического связывания химического соединения с этим полипептидом и
в) определение связи между химическим соединением и полипептидом для идентификации химического соединения, способного предотвратить инфекцию этого штамма вируса.
а) контактирование полипептида, представляющего собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В человека, в аминокислотной последовательности которого в 133 положении метионин заменен на треонин, с указанным химическим соединением в условиях, обеспечивающих связывание указанного полипептида с этим химическим соединением,
б) выявление специфического связывания химического соединения с полипептидом и
в) определение связи между химическим соединением и полипептидом для идентификации химического соединения, способного лечить гепатоцеллюлярную карциному.
а) контактирование полипептида, представляющего собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В человека, в аминокислотной последовательности которого в 133 положении метионин заменен на треонин, с указанным химическим соединением в условиях, обеспечивающих связывание указанного полипептида с этим химическим соединением,
б) выявление специфического связывания химического соединения с полипептидом, и
в) определение связи между химическим соединением и полипептидом для идентификации химического соединения, способного предотвратить гепатоцеллюлярную карциному.
а) получение от субъекта соответствующего образца жидкости организма,
б) определение присутствия в образце со стадии (а) полипептида, являющегося мутантом основного поверхностного антигена вируса гепатита В человека, в аминокислотной последовательности которого в 133 положении метионин заменен на треонин, для осуществления скрининга указанного образца на величине штамма по п.1.
| US 5639637 А, 17.06.1997 | |||
| CHIOUHL et al., Altered antigenicity of «a» determinant variants of hepatitis В Virus, J.Gen.Virol., 1997 Oct; 78(Pt10):2639-45. |
