Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится в целом к вакцинным композициям. В частности изобретение относится к вакцинным композициям E1E2 HCV, включающим антигены E1E2, субмикронные эмульсии масла в воде и/или олигонуклеотиды CpG.
Известный уровень техники
Вирус гепатита С (HCV) является основной причиной парентерального гепатита не-A, не-В (NANBH). Вирус присутствует в крови от 0,4 до 2,0% доноров крови. Хронический гепатит развивается у приблизительно 50% инфицированных и из них у приблизительно 20% инфицированных индивидуумов развивается цирроз печени, который иногда ведет к гепатоклеточной карциноме. Соответственно этому исследование и контроль заболевания имеет существенное медицинское значение.
HCV был впервые идентифицирован и охарактеризован Houghton et al. как случай NANBH. Геномная последовательность вируса HCV известна, также как и способы получения последовательности. Смотри, например, международные публикации №№ 89/04669; WO 90/11089 и WO 90/14436. HCV имеет смысловую, односпиральную геномную РНК с 9,5 т.н. и является членом семейства вирусов Flaviridae. На основе филогенетического анализа идентифицировано, по меньшей мере, шесть различных, но родственных генотипов HCV (Simmonds et al., J. Gen. Virol. (1993) 74:2391-2399). Вирус кодирует единственный полипротеин, имеющий более 3000 аминокислотных остатков (Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455; Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:1711-1715). Процессинг полипротеина осуществляется во время трансляции и посттрансляционно с образованием как структурных, так и неструктурных (NS) белков.
В частности, как показано на фиг.1, геномом HCV кодируется несколько белков. Порядок и номенклатура расщепляемых продуктов полипротеина HCV являются следующими: NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Первоначальное расщепление полипротеина катализируется протеазами хозяина, которые высвобождают три структурных белка, N-концевой нуклеокапсидный белок (обозначаемый как «остов») и два гликопротеина оболочки, "E1" (также известный как E) и "E2" (также известный как E2/NS1), а также неструктурные (NS) белки, которые содержат ферменты вируса. Области NS обозначают NS2, NS3, NS4 и NS5. NS2 представляет собой интегральный белок мембраны с протеолитической активностью, и в сочетании с NS3 расщепляет NS2-NS3 sissle связь, что, в свою очередь, дает NS3 N-конец и высвобождает большой полипротеин, который имеет как активность сериновой протеазы, так и РНК-геликазную активность. Протеаза NS3 служит для процессинга оставшегося полипротеина. В данных реакциях NS3 высвобождает кофактор NS3 (NS4a), два белка (NS4b и NS5a) и РНК-зависимую РНК-полимеразу (NS5b). Завершение созревания полипротеина инициируется автокаталитическим расщеплением в месте соединения NS3-NS4a, катализируемым сериновой протеазой NS3.
E1 определяется как группа с 32-35 кДа и превращается в одиночную H-чувствительную эндополосу с приблизительно 18 кДа. Наоборот, E2 при иммунопреципитации проявляется в виде сложного образа, связанного с генерацией множественных видов полос (Spaete et al., Virol., (1992) 188:819-830; Selby et al., J. Virol. (1996) 70:5177-5182; Grakoui et al., J. Virol. (1993) 67:1385-1395; Tomei et al., J. Virol. (1993) 67:4017-4026). Гликопротеины E1 и E2 оболочки HCV образуют стабильный комплекс, который характеризуется совместной иммунопреципитацией (Grakoui et al., J. Virol. (1993) 67:1385-1395; Lanford et al., Virology (1993) 197:225-235; Ralston et al., J. Virol. (1993) 67:6753-6761).
E1 и E2 остаются в клетках и не имеют сложных углеводов при стабильной экспрессии или при экспрессии во временной системе вируса коровьей оспы (Spaete et al., Virology (1992) 188:819-830; Ralston et al., J. Virol. (1993) 67:6753-6761). Так как белки E1 и E2 обычно являются связанными с мембранами в данных экспрессионных системах, получали секретируемые формы, для того, чтобы облегчить очистку белков. Смотри, например, патент США № 6121020. Кроме того, описана внутриклеточная продукция E1E2 в клетках Hela. Смотри, например, международную публикацию № WO 98/50556.
Гликопротеины E1 и E2 HCV представляют существенный интерес, потому что они, как показано, защищают против заражения вирусом при исследовании на приматах (Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:1294-1298). Однако сохраняется потребность в эффективных вакцинных композициях, включающих данные антигены для профилактики инфицирования HCV.
Вакцинные композиции часто включают иммунологические адъюванты для увеличения иммунных ответов. Например, полный адъювант Фрейнда (ПАФ) является сильным иммуностимулирующим агентом, который успешно применялся со многими антигенами в эксперименте. ПАФ включает три компонента: минеральное масло, эмульгированный агент и убитые микобактерии, такие как Mycobacterium tuberculosis. Водные растворы антигенов смешивают с данными компонентами для создания эмульсии вода в масле. Несмотря на то, что ПАФ эффективен как адъювант, он вызывает тяжелые побочные эффекты, включая боль, образование нарывов и лихорадку, в первую очередь из-за присутствия микобактериального компонента. ПАФ, следовательно, не применяют в медицинских и ветеринарных вакцинах.
Мурамилдипептид (MDP) представляет собой минимальную единицу комплекса стенки микобактериальной клетки, которая создает адъювантную активность, наблюдаемую у ПАФ. Смотри, например, Ellouz et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1974) 59:1317. Создано несколько синтетических аналогов MDP, которые проявляют широкий спектр адъювантной способности и побочных эффектов. Для обзора данных аналогов смотри Chedid et al., Prog. Allergy (1978) 25:63. Представители аналогов MDP включают треонильные производные MDP (Byars et al., Vaccine (1987) 5:223), н-бутильные производные MDP (Chedid et al., Infect. Immun. 35:417) и липофильное производное мурамилтрипептида (Gisler et al., in Immunomodulations of Microbial Products and Related Synthetic Compounds (1981) Y. Yamamura and S. Kotani, eds., Excerpta Medica, Amsterdam, p. 167).
Одно липофильное производное MDP представляет собой N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (MTP-PE). Данный мурамиловый трипептид включает фосфолипидные хвосты, которые создают возможность для ассоциации гидрофобной части молекулы с липидным окружением, в то время как мурамилпептидная часть связана с водным окружением. Таким образом, сам MTP-PE способен действовать как эмульгирующий агент для создания стабильных эмульсий масла в воде. MTP-PE применяли в эмульсии 4% сквалена с 0,008% Твином™ 80, обозначаемой как MTP-PE-LO (низшее масло), для доставки антигена gD вируса простого герпеса, что давало эффективные результаты (Sanchez-Pescador et al., J. Immunol. (1988) 141:1720-1727), несмотря на плохую физическую стабильность. Недавно была разработана безопасная, высокоиммуногенная, субмикронная эмульсия масла в воде, MF59, которая содержит 4-5% мас./об. сквалена, 0,5% мас./об. Твина 80™, 0,5% Спана 85™, и, необязательно, варьирующие количества MTP-PE, для применения в вакцинных композициях. Смотри, например, Ott et al., "MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines" in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell M.F. and Newmann M.J. eds.) Plenum Press, New York, 1995, pp. 277-296. Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:1294-1298 и Houghton et al., in Viral Hepatitis and Liver Disease (1997), p. 656, описывают применение комплексов E1/E2 HCV с субмикронными эмульсиями масла в воде, которые включают MTP-PE.
Бактериальная ДНК включает неметилированные динуклеотиды CpG, которые характеризуются иммуностимулирующими эффектами на мононуклеарные клетки периферической крови in vitro. Смотри Kreig et al., J. Clin. Immunol. (1995) 15:284-292. Олигонуклеотиды CpG применяли для увеличения иммунных ответов. Смотри, например, патенты США №№ 6207646; 6214806; 6218371 и 6406705.
Несмотря на использование таких адъювантов, традиционные вакцины часто не способны обеспечить адекватную защиту против патогена, на который они направлены. Соответственно продолжает существовать потребность в эффективных вакцинных композициях против HCV, которые включают безопасные и нетоксичные адъюванты.
Краткое изложение существа изобретения
Настоящее изобретение частично основано на неожиданном открытии того, что применение антигенов E1E2 HCV в сочетании с субмикронными эмульсиями масла в воде и олигонуклеотидами, содержащими иммуностимулирующие последовательности нуклеиновой кислоты (ISS), такими как мотивы CpY, CpR и неметилированный CpG (цитозин, за которым следует гуанозин, связанные через фосфат), дает существенно более высокие титры антител, чем таковые, выявляемые без таких адъювантов. Альтернативно, представленные здесь композиции могут быть использованы только с ISS, без субмикронных эмульсий масла в воде, или только с субмикронными эмульсиями масла в воде, в которых отсутствует MTP-PE, без ISS. Применение таких сочетаний обеспечивает безопасный и эффективный подход к увеличению иммуногенности антигенов E1E2 HCV.
Соответственно в одном осуществлении изобретение направлено на композицию, включающую антиген E1E2 HCV и субмикронную эмульсию масла в воде, в которой отсутствует MTP-PE, где субмикронная эмульсия масла в воде способна увеличивать иммунный ответ на антиген E1E2 HCV. Композиция может дополнительно включать ISS, такую как олигонуклеотиды, содержащие мотивы неметилированных CpG ("олигонуклеотид CpG"), который, когда он присутствует, действует, увеличивая иммунный ответ на антиген.
В еще одном осуществлении объект изобретения направлен на способ стимуляции иммунного ответа у субъекта, являющегося позвоночным, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества антигена E1E2 HCV и субмикронной эмульсии масла в воде, в которой отсутствует MTP-PE, где субмикронная эмульсия масла в воде способна увеличивать иммунный ответ на антиген E1E2 HCV. Субъекту может быть также введена одна или более ISS, такая как один или более олигонуклеотидов, содержащих мотивы неметилированных CpG, где ISS способна увеличивать иммунный ответ на антиген E1E2 HCV. Субмикронная эмульсия масла в воде может присутствовать в той же композиции, что и антиген, или может вводиться в виде отдельной композиции. Более того, если присутствует ISS, она может присутствовать в той же композиции, что и антиген и/или субмикронная эмульсия масла в воде, или в отличной композиции.
В еще одних осуществлениях изобретение направлено на способ получения композиции, включающий соединение субмикронной эмульсии масла в воде, в которой отсутствует MTP-PE, с антигеном E1E2 HCV. В определенных осуществлениях способ дополнительно включает соединение ISS, такой как олигонуклеотид, содержащий мотивы неметилированных CpG, способный увеличивать иммунный ответ на антиген E1E2 HCV, с антигеном E1E2 и субмикронной эмульсией масла в воде.
В дополнительных осуществлениях изобретение направлено на композицию, включающую антиген E1E2 HCV и ISS, такую как олигонуклеотид CpG, способный увеличивать иммунный ответ на антиген E1E2 HCV.
В еще одном осуществлении изобретение направлено на способ стимуляции иммунного ответа у субъекта, являющегося позвоночным, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества антигена E1E2 HCV и ISS, такой как олигонуклеотид CpG, где ISS способна увеличивать иммунный ответ на антиген E1E2 HCV. ISS может присутствовать в той же композиции, что и антиген, или может вводиться в виде отдельной композиции.
В еще одних осуществлениях изобретение направлено на способ получения композиции, включающий комбинацию ISS, такой как олигонуклеотид CpG, с антигеном E1E2 HCV, где ISS способна увеличивать иммунный ответ на антиген E1E2 HCV.
Молекула CpG в любом из осуществлений, представленных выше, может иметь формулу 5'-X1X2CGX3X4, где X1 и X2 представляют собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT и TpG, а X3 и X4 выбраны из группы, состоящей из TpT, CpT, ApT, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA, GpT, CpA и TpG, где "p" обозначает связь через фосфат. В определенных осуществлениях олигонуклеотид CpG включает последовательность GACGTT, GACGTC, GTCGTT или GTCGCT, с несколькими прилегающими дополнительными нуклеотидами.
В дополнительном осуществлении олигонуклеотид CpG для применения в композициях настоящего изобретения имеет последовательность 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID NO:1) или последовательность 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO:5).
В определенных осуществлениях субмикронная эмульсия масла в воде включает:
(1) метаболизируемое масло, где масло присутствует в количестве от 0,5% до 20% от суммарного объема и
(2) эмульгирующий агент, где эмульгирующий агент составляет от 0,01% до 2,5% по массе (мас./об.) и где масло и эмульгирующий агент присутствуют в форме эмульсии масла в воде, имеющей капельки масла, по существу все из которых имеют диаметр от приблизительно 100 нм до менее 1 микрона,
где субмикронная эмульсия масла в воде способна увеличивать иммунный ответ на антиген E1E2 HCV.
В других осуществлениях субмикронная эмульсия масла в воде представляет собой описанное выше и не имеет блоксополимера полиоксипропилен-полиоксиэтилена, также как и какого-либо мурамилпептида.
В дополнительных осуществлениях эмульгирующий агент включает моно-, ди- или триэфир полиоксиэтиленсорбитана и/или моно-, ди- или триэфир сорбитана.
В определенных осуществлениях масло присутствует в количестве от 1% до 12%, таком как от 1% до 4% от суммарного объема и эмульгирующий агент составляет величину от 0,01% до 1% по массе (мас./об.), такую как от 0,01% до 0,05% по массе (мас./об.).
В других описанных здесь осуществлениях субмикронная эмульсия масла в воде включает 4-5% мас./об. сквалена, 0,25-1,0% мас./об. Твина 80™ (моноолеат полиоксиэтиленсорбитана) и/или 0,25-1,0% Спана 85™ (триолеат сорбитана) и необязательно N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (MTP-PE).
В других осуществлениях субмикронная эмульсия масла в воде состоит по существу из:
(1) 5% сквалена по объему; и
(2) одного или более эмульгирующих агентов, выбранных из группы, состоящей из Твина 80™ (моноолеат полиоксиэтиленсорбитана) и Спана 85™ (триолеат сорбитана), где суммарное количество присутствующего эмульгирующего(их) агента(ов) составляет 1% по массе (мас./об.); где сквален и эмульгирующий(ие) агент(ы) присутствуют в форме эмульсии масла в воде, имеющей капельки масла, по существу все из которых имеют диаметр от приблизительно 100 нм до менее 1 микрона, и где в композиции отсутствует блоксополимер полиоксипропилен-полиоксиэтилена, и дополнительно, где субмикронная эмульсия масла в воде способна увеличивать иммунный ответ на антиген HCV.
В других осуществлениях один или более эмульгирующих агентов представляют собой моноолеат полиоксиэтиленсорбитана и триолеат сорбитана, а суммарное количество присутствующих моноолеата полиоксиэтиленсорбитана и триолеата сорбитана составляет 1% по массе (мас./об.).
В определенных осуществлениях в композиции отсутствует мурамилпептид.
Данный и другие аспекты изобретения должны быть понятны при отсылке к последующему подробному описанию и прилагаемым фигурам.
Краткое описание фигур
На фигуре 1 показано диаграммное представление генома HCV с изображением различных областей полипротеина HCV.
На фигурах 2A-2С (SEQ ID NOS:3 и 4) представлена нуклеотидная и соответствующая аминокислотная последовательность области E1/E2/p7 HCV-1. Номера, представленные на фигуре, даны относительно полноразмерного полипротеина HCV-1. Представлены области E1, E2 и p7.
Фигура 3 представляет собой диаграмму плазмиды pMHE1E2-809, кодирующей E1E2809, типичный белок Е1Е2 для применения в настоящем изобретении.
На фигуре 4 представлены ИФА титры антител к E1E2809 мышей, иммунизированных E1E2809 плюс CpG; Е1Е2809 плюс MF59; E1E2809 плюс CpG и MF59; и E1E2809 плюс 4XMF59, как описано в примерах. Кружками обозначены титры антител в индивидуальных мышиных сыворотках. Прямоугольники представляют собой среднее геометрическое титра антител (GMT) в группе из 10 мышей. Линии, отражающие величины ошибки, представляют собой интервалы сравнения для статистически значимых различий, определяемых по односторонней оценке дисперсии.
Подробное описание изобретения
В практике настоящего изобретения будут применяться, если не указано иначе, общепринятые для специалистов в данной области техники способы химии, биохимии, технологий рекомбинантных ДНК и иммунологии. Такие способы полностью объяснены в литературе. Смотри, например, Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., текущее издание); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).
Следует отметить, что применяемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают множественное число, если в содержании ясно не указано иначе. Таким образом, например, ссылка на антиген включает смесь двух и более антигенов и тому подобное.
В тексте применяются следующие сокращения аминокислот:
I. Определения
В описании настоящего изобретения будут применяться следующие термины, и они предназначаются для определения указанного ниже.
Термины «полипептид» и «белок» относятся к полимеру из аминокислотных остатков и не ограничиваются минимальной длиной продукта. Таким образом, пептиды, олигопептиды, димеры, мультимеры и тому подобное включаются в данное определение. Как полноразмерные белки, так и их фрагменты охватываются этим определением. Термины также включают постэкспрессионные модификации полипептида, например, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и тому подобное. Более того, в целях настоящего изобретения термин «полипептид» относится к белку, который включает модификации относительно природной последовательности, такие как делеции, вставки и замены (обычно консервативные по природе), до тех пор, пока белок сохраняет желаемую активность. Данные модификации могут быть направленными за счет сайт-направленного мутагенеза или могут быть случайными за счет мутации хозяев, которые продуцируют белки, или за счет ошибок, обусловленных амплификацией ПЦР.
Термином «полипептид E1» обозначают молекулу, происходящую из области E1 HCV. Зрелая область E1 HCV-1 начинается приблизительно с аминокислоты 192 полипротеина и продолжается до приблизительно аминокислоты 383, пронумерованных относительно полноразмерного полипротеина HCV-1 (смотри фигуры 1 и 2A-2C. Аминокислоты 192-383 фигур 2A-2C соответствуют положениям аминокислот 20-211 SEQ ID NO:4). Аминокислоты от около 173 до приблизительно 191 (аминокислоты 1-19 SEQ ID NO: 4) служат сигнальной последовательностью для E1. Таким образом, термином «полипептид E1» обозначают либо предшественник белка E1, включающий сигнальную последовательность, или зрелый белок E1, у которого отсутствует сигнальная последовательность, или даже полипептид E1 с гетерологичной сигнальной последовательностью. Полипептид E1 включает С-концевую последовательность для заякоревания в мембране, которая соответствует приблизительно положениям аминокислот 360-383 (смотри международную заявку № WO 95/04301, опубликованную 15 февраля 1996 г.). Полипептид E1, как здесь определяется, может включать для заякоревания или не включать С-концевую последовательность или ее часть.
Термином «полипептид E2» обозначают молекулу, происходящую из области E2 HCV. Зрелая область E2 HCV-1 начинается приблизительно с аминокислот 383-385, пронумерованных относительно полноразмерного полипротеина HCV-1 (смотри фигуры 1 и 2A-2C. Аминокислоты 383-385 фигур 2A-2C соответствуют положениям аминокислот 211-213 SEQ ID NO:4). Сигнальный пептид начинается приблизительно с аминокислоты 364 полипротеина. Таким образом, термином «полипептид E2» обозначают либо предшественник белка E2, включающий сигнальную последовательность, или зрелый белок E2, у которого отсутствует сигнальная последовательность, или даже полипептид E2 с гетерологичной сигнальной последовательностью. Полипептид E2 включает С-концевую последовательность для заякоревания в мембране, которая соответствует приблизительно положениям аминокислот 715-730, и может продолжаться до приблизительно аминокислотного остатка 746 (смотри Lin et al., J. Virol. (1994)68:5063-5073). Полипептид E2, как здесь определяется, может включать или не включать С-концевую последовательность для заякоревания или ее часть. Более того, полипептид E2 может также включать всю область p7 или ее часть, которая непосредственно прилегает к C-концу E2. Как показано на фигурах 1 и 2A-2C область p7 найдена в положениях 747-809, пронумерованных относительно полноразмерного полипротеина HCV-1 (положения аминокислот 575-637 SEQ ID NO:4). Кроме того, известно, что существует много видов E2 HCV (Spaete et al., Virol. (1992) 188:819-830; Selby et al., J. Virol. (1996) 70:5177-5182; Grakoui et al., J. Virol. (1993) 67:1385-1395; Tomei et al., J. Virol. (1993) 67:4017-4026). Соответственно в целях настоящего изобретения термин «E2» охватывает любой из данных видов E2, включая, без ограничения, виды, которые имеют делеции 1-20 или более аминокислот с N-конца E2, такие как делеции 1, 2, 3, 4, 5 ... 10 ... 15, 16, 17, 18, 19 ... и т.д. аминокислот. Такие виды E2 включают те, которые начинаются с аминокислоты 387, аминокислоты 402, аминокислоты 403 и т.д.
Типичные области E1 и E2 HCV-1 представлены на фигурах 2A-2C и SEQ ID NO:4. В целях настоящего изобретения области E1 и E2 определяют по отношению к номеру аминокислоты полипротеина, кодируемого геномом HCV-1, с первого метионина, обозначаемому как положение 1. Смотри, например, Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455. Однако следует отметить, что применяемый здесь термин «полипептид E1» или «полипептид E2» не ограничивается последовательностью HCV-1. В этом отношении соответствующие области E1 или E2 в других изолятах HCV могут быть легко определены согласованием последовательностей изолятов таким образом, чтобы привести последовательности к максимальному согласованию. Это может быть осуществлено с помощью любого из ряда пакетов компьютерных программ, такого как ALIGN 1.0, имеющегося в распоряжении University of Virginia, Department of Biochemistry (Attn: Dr. William R. Pearson). Смотри Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:2444-2448.
Более того, термин «полипептид E1» или «полипептид E2», как здесь определено, не ограничен полипептидом, имеющим точную последовательность, изображенную на фигурах. Конечно, геном HCV находится в состоянии постоянного изменения in vivo и содержит несколько вариабельных доменов, которые проявляют относительно высокие степени вариабельности между изолятами. Ряд консервативных и вариабельных областей в данных штаммах известен и в целом аминокислотные последовательности эпитопов, происходящие из данных областей, должны иметь высокую степень гомологии последовательностей, например, гомологию аминокислотных последовательностей более 30%, предпочтительно более 40%, более 60% и даже более 80-90% гомологии, при выравнивании двух последовательностей. Вполне очевидно, что термины охватывают полипептиды E1 и E2 из любого из различных штаммов и изолятов HCV, включая изоляты, имеющие любой из 6 генотипов HCV, описанных Simmonds et al., J. Gen. Virol. (1993) 74:2391-2399 (например, штаммы 1, 2, 3, 4 и т.д.), также как вновь идентифицированные изоляты и подтипы данных изолятов, такие как HCV1a, HCV1b и т.д.
Таким образом, например, термин полипептид "E1" или "E2" относится к природным последовательностям E1 или E2 любого из различных штаммов HCV, а также к аналогам, мутеинам и иммуногенным фрагментам, как далее определено ниже. Полные генотипы многих из данных штаммов известны. Смотри, например, патент США № 6150087 и номера в GenBank №№ AJ238800 и AJ238799.
Кроме того, термины «полипептид E1» и «полипептид E2», охватывают белки, которые включают модификации по отношению к природной последовательности, такие как внутренние делеции, вставки и замены (обычно консервативные по природе). Данные модификации могут быть направленными за счет сайт-направленного мутагенеза или могут быть случайными за счет возникающих в природе случайных мутаций. Все данные модификации охватываются настоящим изобретением до тех пор, пока модифицированные полипептиды E1 и E2 действуют в плане предназначенной для них цели. Таким образом, например, если полипептиды E1 и/или E2 предназначены для применения в вакцинных композициях, модификации должны быть такими, чтобы иммунологическая активность (т.е. способность вызывать гуморальный или клеточный иммунный ответ на полипептид) не была потеряна.
Комплексом "E1E2" обозначают белок, содержащий, по меньшей мере, один полипептид E1 и, по меньшей мере, один полипептид E2, как описано выше. Такой комплекс может также включать всю или часть области p7, которая непосредственно прилегает к С-концу E2. Как показано на фигурах 1 и 2A-2C область p7 найдена в положениях 747-809, пронумерованных относительно полноразмерного полипротеина HCV-1 (положения аминокислот 575-637 SEQ ID NO:4). Типичный комплекс E1E2, который включает белок p7, обозначают здесь как "E1E2809".
Способ ассоциации E1 и E2 в комплекс E1E2 несущественен. Полипептиды E1 и E2 могут ассоциироваться в результате нековалентных взаимодействий, таких как электростатические силы, или в результате образования ковалентных связей. Например, полипептиды E1E2 настоящей заявки могут быть в форме гибридного белка, который включает иммуногенный полипептид E1 и иммуногенный полипептид E2, как определено выше. Гибрид может быть экспрессирован с полинуклеотида, кодирующего химеру E1E2. Альтернативно, комплексы E1E2 могут образовываться спонтанно просто в результате смешивания белков E1 и E2, которые были получены индивидуально. Сходно, при коэкспрессии и секреции в среды белки E1 и E2 могут спонтанно образовывать комплекс. Таким образом, термин охватывает комплексы E1E2 (также называемые агрегатами), которые спонтанно образуются при очистке E1 и/или E2. Такие агрегаты могут включать один или более мономеров E1 в ассоциации с одним или более мономерами E2. Не требуется, чтобы количество присутствующих мономеров E1 и E2 было равным до тех пор, пока присутствуют, по меньшей мере, один мономер E1 и один мономер E2. Определение присутствия комплекса E1E2 легко осуществляется при применении стандартных способов определения белка, таких как электрофорез в полиакриламидном геле и иммунологические способы, такие как иммунопреципитация.
Термины «аналог» и «мутеин» относятся к биологически активным производным базовой молекулы или к фрагментам таких производных, которые сохраняют желаемую активность, такую как иммунореактивность в описанных здесь тестах. В целом термин «аналог» относится к соединениям, имеющим природную полипептидную последовательность и структуру с добавлениями, заменами (обычно консервативными по природе) и/или делециями одной или более аминокислот по отношению к природной молекуле, до тех пор, пока модификации не нарушают иммуногенной активности. Термин «мутеин» относится к пептидам, имеющим один или более пептидных миметиков («пептоидов»), таких как описанные в международной публикации № WO 91/04282. Предпочтительно, чтобы аналог или мутеин имели, по меньшей мере, такую же иммуноактивность, что и природная молекула. Способы создания полипептидных аналогов и мутеинов известны специалистам в данной области техники и описаны далее ниже.
Особенно предпочтительные аналоги включают замены, которые являются консервативными по природе, т.е. те замены, которые имеют место в пределах семейства аминокислот, которые сходны в отношении своих боковых цепей. Конкретно, аминокислоты обычно подразделяют на четыре семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда относят к классу ароматических аминокислот. Например, есть основания предположить, что отдельная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или сходная консервативная замена аминокислоты на структурно сходную аминокислоту не должна оказывать существенный эффект на биологическую активность. Например, интересующий полипептид может включать до приблизительно 5-10 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен или даже до приблизительно 15-25 или 50 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, или любое целое число между 5-50 до тех пор, пока желаемая функция молекулы остается интактной. Специалист в данной области техники может легко определить области интересующей молекулы, которые легко позволяют сделать замену, при обращении к схемам Hopp/Woods и Kyte-Doolittle, которые хорошо известны в данной области техники.
Под «фрагментом» подразумевается полипептид, состоящий только из части интактной полноразмерной полипептидной последовательности и структуры. Фрагмент может включать С-концевую делецию и N-концевую делецию, и/или внутреннюю делецию природного полипептида. «Иммуногенный фрагмент» конкретного белка HCV обычно должен включать, по меньшей мере, приблизительно 5-10 смежных аминокислотных остатков полноразмерной молекулы, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 15-25 смежных аминокислотных остатков полноразмерной молекулы и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 20-50 или более смежных аминокислотных остатков полноразмерной молекулы, которые определяют ее эпитоп, или любое целое число между 5 аминокислотами и полноразмерной последовательностью, предлагаемое так, чтобы рассматриваемый фрагмент сохранял способность проявлять иммунный ответ, как здесь определено. Для описания известных иммуногенных фрагментов E1 и E2 HCV смотри, например, Chien et al., международная публикация № WO 93/00365.
Применяемый здесь термин «эпитоп» относится к последовательности из, по меньшей мере, приблизительно от 3 до 5, предпочтительно приблизительно от 5 до 10 или 15, и не более чем приблизительно 500 аминокислот (или любое целое число между ними), которые определяют последовательность, которая сама или как часть более длинной последовательности, вызывает иммунный ответ у субъекта, которому она вводится. Часто эпитоп должен связываться с антителом, вырабатываемым в ответ на такую последовательность. Не существует верхнего критического лимита длины фрагмента, который может включать последовательность почти полноразмерного белка, или даже гибридный белок, включающий два или более эпитопов из полипротеина HCV. Эпитоп, используемый в целях изобретения, не ограничивается полипептидом, имеющим точную последовательность части родительского белка, из которого он произошел. Конечно, геномы вирусов находятся в состоянии постоянного изменения и содержат несколько вариабельных доменов, которые проявляют относительно высокие степени вариабельности между изолятами. Таким образом, термин «эпитоп» охватывает последовательности, идентичные природной последовательности, а также модификации природной последовательности, такие как делеции, добавки и замены (обычно консервативные по природе).
Области данного полипептида, которые включают эпитоп, могут быть идентифицированы с применением ряда способов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области техники. Смотри, например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Например, линейные эпитопы могут быть определены, например, с помощью одновременного синтеза большого числа пептидов на твердых подложках, пептидов, соответствующих частям белковой молекулы, и взаимодействия пептидов с антителами, пока пептиды все еще привязаны к подложкам. Такие способы известны в данной области техники и описаны в, например, патенте США № 4708871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:178-182; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. При применении таких способов был идентифицирован ряд эпитопов HCV. Смотри, например, Chien et al., Viral Hepatitis and Liver Disease (1994) pp. 320-324 и далее ниже. Сходно, конформационные эпитопы с легкостью идентифицируют путем определения пространственной конформации аминокислот таким способом, как, например, рентгеноструктурной кристаллографией и двумерным ядерным магнитным резонансом. Смотри, например, Epitope Mapping Protocols, выше. Антигенные области белков могут быть также идентифицированы с применением стандартной антигенности и кривых гидропатии, таких как рассчитанные с применением, например, компьютерной программы версии 1.0 Omiga, предлагаемой Oxford Molecular Group. В данной компьютерной программе применяется способ Hoop/Woods, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828, для определения профилей антигенности и способ Kyte-Doolittle, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132, для кривых гидропатии.
Применяемый здесь термин «конформационный эпитоп» относится к части полноразмерного белка или его аналога, или мутеина, имеющей структурные характеристики, нативные по отношению к аминокислотной последовательности, кодирующей эпитоп в пределах полноразмерного природного белка. Нативные структурные характеристики включают, но не ограничиваются этим, гликозилирование и трехмерную пространственную структуру. Длина последовательности, определяющей эпитоп, может широко варьироваться, так как данные эпитопы, как считается, образуются при трехмерной конфигурации антигена (например, укладки). Таким образом, аминокислоты, определяющие эпитоп, могут существовать в относительно небольшом количестве, но быть широко разбросанными по длине молекулы (или даже находиться в различных молекулах в случае димеров и т.д.), объединяясь в правильную эпитопную конформацию в результате укладки. Части антигена между остатками, определяющими эпитоп, могут не быть решающими для конформационной структуры эпитопа. Например, делеция или замена данных промежуточных последовательностей может не влиять на предлагаемый конформационный эпитоп, пока поддерживаются решающие для конформации эпитопа последовательности (например, цистеины, участвующие в образовании дисульфидной связи, сайты гликозилирования и т.д.).
Конформационные эпитопы легко идентифицируют, применяя способы, обсуждаемые выше. Более того, присутствие или отсутствие конформационного эпитопа в данном полипептиде может быть легко определено путем скрининга интересующего антигена в отношении взаимодействия с антителами (поликлональной сывороткой или моноклональной по отношению к конформационному эпитопу) и сравнения его взаимодействия с таковой денатурированного варианта антигена, в котором остаются только линейные эпитопы (если они есть). При таком скрининге с применением поликлональных антител может быть выгодно истощить поликлональную сыворотку сначала денатурированным антигеном и посмотреть остались ли антитела к интересующему антигену. Конформационные эпитопы, происходящие из областей E1 и E2, описаны, например, в международной публикации № WO 94/01778.
«Иммунный ответ» на антиген HCV или композицию представляет собой развитие у субъекта гуморального и/или клеточного иммунного ответа на молекулы, присутствующие в интересующей композиции. В целях настоящего изобретения «гуморальный иммунный ответ» обозначает иммунный ответ, опосредуемый молекулами антител, в то время как «клеточный иммунный ответ» представляет собой ответ, опосредованный Т-лимфоцитами и/или другими белыми клетками крови. Один важный аспект клеточного иммунитета включает антиген-специфический ответ цитолитических Т-клеток ("CTL"). CTL характеризуются специфичностью в отношении пептидных антигенов, которые презентируются в связи с белками, кодируемыми главным комплексом гистосовместимости (MHC) и экспрессируемыми на поверхности клеток. CTL помогают индуцировать и усиливать внутриклеточное разрушение внутриклеточных микробов или лизис клеток, инфицированных такими микробами. Другой аспект клеточного иммунитета включает антиген-специфический ответ хелперных Т-клеток. Хелперные Т-клетки действуют, помогая стимулировать функцию и сфокусировать активность неспецифических эффекторных клеток против клеток, представляющих на своей поверхности антигены пептида в комплексе с молекулами MHC. «Клеточный иммунный ответ» также относится к продукции цитокинов, хемокинов и других таких молекул, продуцируемых активированными Т-клетками и/или другими белыми клетками крови, включая происходящие от CD4+ и CD8+ T-клеток. Композиция или вакцина, которая вызывает клеточный иммунный ответ, может служить для сенсибилизации субъекта, являющегося позвоночным, в результате презентации антигена в комплексе с молекулами MHC на клеточной поверхности. Опосредованный клетками иммунный ответ направлен на или почти на клетки, презентирующие антиген на своей поверхности. Кроме того, могут быть генерированы антиген-специфические Т-лимфоциты, что дает дополнительную защиту иммунизированному хозяину. Способность конкретного антигена стимулировать опосредованный клетками иммунный ответ может быть определена с помощью ряда тестов, таких как тесты оценки лимфопролиферации (активации лимфоцитов), тесты на CTL цитотоксические клетки или тест на Т-лимфоциты, специфические для антигена у сенсибилизированного субъекта. Такие тесты хорошо известны в данной области техники. Смотри, например, Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151:4189-4199; Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376.
Таким образом, применяемый здесь термин иммунный ответ может быть таким, который стимулирует продукцию CTL и/или продукцию или активацию хелперных Т-клеток. Интересующий антиген может также вызывать опосредованный антителами иммунный ответ, включая, например, нейтрализацию связывающими (NOB)антителами. Наличие ответа NOB антител легко определить с помощью способов, описанных, например, в Rosa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:1759. Однако иммунный ответ может включать один или более из следующих эффектов: продукцию антител В-клетками; и/или активацию супрессорных Т-клеток и/или γδ Т-клеток, специфически направленных на антиген или антигены, присутствующие в интересующей композиции или вакцине. Данные ответы могут служить для нейтрализации инфекции и/или опосредовать клеточную цитотоксичность, зависимую от системы антитело-комплемент или от антитела (ADCC), обеспечивая защиту или облегчение симптомов у иммунизированного хозяина. Такие ответы могут быть определены с применением стандартных иммунотестов и тестов по нейтрализации, хорошо известных в данной области техники.
Применяемый здесь термин «иммуностимулирующая нуклеотидная последовательность» или «ISS» обозначает полинуклеотид, который включает, по меньшей мере, одну иммуностимулирующую олигонуклеотидную часть (ISS-ODN). Часть ISS представляет собой олигонуклеотид из одно- или двуспиральной ДНК или РНК, имеющий, по меньшей мере, шесть нуклеотидных оснований, которые могут включать или состоять из модифицированного олигонуклеотида или последовательности модифицированных нуклеотидов. Части ISS включают или могут прилегать к содержащей CG нуклеотидной последовательности или нуклеотидной последовательности p(lC), которая может быть палиндромной. Цистеин может быть метилированным или неметилированным. Примеры конкретных молекул ISS для применения в настоящем изобретении включают молекулы CpG, обсуждаемые далее ниже, а также молекулы CpY и CpR и тому подобное.
Компонент композиции E1E2 HCV, такой как субмикронная эмульсия масла в воде или олигонуклеотид CpG, увеличивает иммунный ответ на антиген E1E2 HCV, присутствующий в композиции, если композиция обладает более высокой способностью вызывать иммунный ответ, чем иммунный ответ, вызываемый эквивалентным количеством антигена при его доставке без дополнительного компонента. Такая увеличенная иммуногенность может быть определена путем введения композиции антигена с или без дополнительных компонентов и сравнения титров антител против двух таких вариантов с применением стандартных способов, таких как радиоиммунный анализ и ELISA, хорошо известных в данной области техники.
«Рекомбинантным» белком является белок, который сохраняет желаемую активность и который получен с помощью способов рекомбинантной ДНК, как здесь описано. В целом, интересующий ген клонируют и затем экспрессируют в трансформированных организмах, как описано далее ниже. Организм-хозяин экспрессирует чужеродный ген с продукцией белка в условиях экспрессии.
Под «выделенным», когда это относится к полипептиду, понимается тот случай, когда указанная молекула отделена и изолирована из целого организма, в котором молекула находится в природе или присутствует по существу в отсутствие других биологических макромолекул того же типа. Термин «выделенный» в отношении полинуклеотида обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, лишенную в целом или частично последовательностей, обычно связанных с ней в природе; или последовательность в том виде, в котором она существует в природе, но имеющую находящиеся в связи с ней гетерологические последовательности; или молекулу, отъединенную от хромосомы.
Под «эквивалентной антигенной детерминантой» подразумевается антигенная детерминанта из различных подвидов или штаммов HCV, таких как штаммы HCV 1, 2, 3 и т.д., чьи антигенные детерминанты необязательно идентичны из-за вариации последовательностей, но которые находятся в эквивалентных положениях рассматриваемой последовательности HCV. В целом аминокислотные последовательности эквивалентных антигенных детерминант должны иметь высокую степень гомологии последовательностей, например, гомологию аминокислотной последовательности более 30%, обычно более 40%, такую как более 60% и даже более 80-90% гомологии при сопоставлении двух последовательностей.
«Гомология» относится к проценту идентичности между двумя полинуклеотидными или полипептидными частями. Две последовательности ДНК или полипептидные последовательности являются «по существу гомологичными» друг другу, когда последовательности имеют, по меньшей мере, приблизительно 50%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 75%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 80-85%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 90%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 95-98% идентичность последовательностей молекул определенной длины. Применяемый здесь термин по существу гомологичные также относится к последовательностям, имеющим полную идентичность по отношению к конкретной последовательности ДНК или полипептида.
В целом, «идентичность» обозначает точное соответствие нуклеотида с нуклеотидом или аминокислоты с аминокислотой для двух полинуклеотидов или полипептидных последовательностей соответственно. Процент идентичности может быть определен с помощью прямого сравнения информации о последовательности двух молекул путем выравнивания последовательностей, расчета точного числа пар между двумя выровненными последовательностями, деления на длину более короткой последовательности и умножения результата на 100. Для упрощения анализа могут быть использованы легко доступные компьютерные программы, такие как ALIGN, Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, которые адаптируют алгоритм локальной гомологии Smith and Waterman, Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981, для анализа пептидов. Программы для определения идентичности нуклеотидных последовательностей доступны от Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (предлагаемые Genetics Computer Group, Madison, WI), например, программы BESTFIT, FASTA и GAP, которые также зависят от алгоритма Smith и Waterman. Данными программами легко пользоваться с параметрами по умолчанию, рекомендованными производителем и описанными в Wisconsin Sequence Analysis Package, цитированным выше. Например, процент идентичности конкретной нуклеотидной последовательности и последовательности сравнения может быть определен с применением алгоритма гомологии Smith и Waterman с таблицей подсчета по умолчанию и со штрафными баллами за пробелы в шести нуклеотидных положениях.
Другой способ определения процента идентичности в контексте настоящего изобретения представляет собой применение пакета программ MPSRCH с авторским правом University of Edinburgh, разработанных John F. Collins and Shane S. Sturrok, и распространяемых IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Из данного комплекта пакетов может быть применен алгоритм Smith-Waterman, когда применяют параметры по умолчанию для таблицы баллов (например, 12 штрафных баллов за открытые пробелы, штрафные баллы за расширение пробела на одну и шесть позиций). Количество «пар», полученное из данных, отражает «идентичность последовательностей». Другие подходящие программы для расчета процента идентичности или сходства между последовательностями обычно известны в данной области техники, например, другая программа сравнения представляет собой BLAST, применяемый с параметрами по умолчанию. Например, BLASTN и BLASTP могут быть использованы с применением следующих параметров по умолчанию: генетический код = стандартный; фильтр = нет; цепь = обе; отсекание = 60; ожидаемое = 10; матрица = BLOSUM62; описания = 50 последовательностей; сортировка по = HIGH SCORE; база данных = неизбыточная, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank трансляции CDS + швейцарский белок + Spupdate + PIR. Подробности данных программ могут быть найдены по следующему Интернет-адресу: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.
Альтернативно, гомология может быть определена с помощью гибридизации полинуклеотидов в таких условиях, когда они образуют стабильные дуплексы между гомологичными областями с последующим расщеплением нуклеазой(ами), специфичной(ыми) для односпиральных участков, определением размеров отщепленных фрагментов. Последовательности ДНК, которые являются по существу гомологичными, могут быть идентифицированы в эксперименте по Саузерн-гибридизации, например, в строгих условиях, как определено для данной конкретной системы. Определение подходящих условий гибридизации находится в компетенции специалистов в данной области техники. Смотри, например, Sambrook et al., выше; DNA Cloning, выше; Nucleic Acid Hybridization, выше.
II. Способы осуществления изобретения
Перед подробным описанием настоящего изобретения необходимо отметить, что данное изобретение не ограничено конкретными составами или параметрами процессов, которые, конечно, могут варьировать. Следует также понимать, что примененная здесь терминология предназначена лишь для описания конкретных осуществлений изобретения и не является ограничивающей.
Хотя в осуществлении настоящего изобретения может быть применен ряд композиций и способов, сходных или эквивалентных описанным здесь, здесь описываются предпочтительные материалы и способы.
Как отмечалось выше, настоящее изобретение основывается на открытии того, что антигены HCV E1E2 в сочетании с субмикронными эмульсиями масла в воде, не содержащими MTP-PE, а также с субмикронными эмульсиями масла в воде и иммуностимулирующими молекулами нуклеиновых кислот, такими как олигонуклеотиды CpG, дают композиции, которые вызывают существенно увеличенные титры антител по сравнению с наблюдаемыми без таких адъювантов. Индукция специфичных в отношении HCV антител полипептидами E1E2 служит для создания модельных систем, как in vitro, так и in vivo, для разработки вакцин HCV, в частности, для идентификации полипептидных эпитопов HCV E1, E2 и HCV E1E2, связанных с получением высоких титров антител против E1, E2 и/или E1E2, и/или клеточных иммунных ответов, направленных против HCV. Полипептиды E1E2 могут быть также применены для индукции иммунного ответа против HCV у млекопитающего, в частности, ответа антител против E1, E2 и/или E1E2, и/или клеточного иммунного ответа в терапевтических или профилактических целях.
Для лучшего понимания изобретения ниже приводится более подробное обсуждение, касающееся применения полипептидов E1E2 в рассматриваемых композициях, а также получения субмикронных эмульсий масла в воде, иммуностимулирующих молекул нуклеиновых кислот и включающих указанное выше композиций.
Полипептиды E1E2
Как объяснялось выше, комплексы E1E2, предназначенные для применения в настоящих композициях, включают полипептиды E1 и E2, связанные нековалентными или ковалентными связями. Геном вируса гепатита C обычно содержит одну рамку считывания из приблизительно 9600 нуклеотидов, которые транскрибируются в полипротеин. Полипротеин HCV расщепляется с образованием ряда отдельных продуктов в порядке NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH (смотри фигуру 1). Полипептид E1 HCV является гликопротеином и локализуется от приблизительно 192 до 383 аминокислоты (с нумерацией относительно полипротеина HCV-1). Смотри Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455. Аминокислоты от приблизительно 173 до приблизительно 191 представляют собой сигнальную последовательность для E1. Полипептид E2 HCV также является гликопротеином и локализован от приблизительно 383 или 384 аминокислоты до 746 аминокислоты. Сигнальный пептид для E2 начинается с приблизительно 364 аминокислоты полипротеина. Таким образом, применяемый здесь термин «полноразмерный» E1 или «неукороченный» E1 относится к полипептидам, которые включают, по меньшей мере, аминокислоты 192-383 полипротеина HCV (с нумерацией относительно HCV-1). Что касается E2, применяемый здесь термин «полноразмерный» или «неукороченный» относится к полипептидам, которые включают, по меньшей мере, аминокислоты, начиная с 383 или 384, по аминокислоту 746 полипротеина HCV (с нумерацией относительно HCV-1). Как будет ясно из данного раскрытия, полипептиды E2, предназначенные для применения в настоящем изобретении, могут включать аминокислоты из области p7, такие как аминокислоты 747-809.
Как объяснялось выше, E2 существует во множестве форм (Spaete et al., Virol. (1992) 188:819-830; Selby et al., J. Virol. (1996) 70:5177-5182; Grakoui et al., J. Virol. (1993) 67:1385-1395; Tomei et al., J. Virol. (1993) 67:4017-4026), и обрезание и протеолиз могут иметь место на N- и C-концах полипептидов E1 и E2. Таким образом, предназначенный для применения здесь полипептид E2 может включать, по меньшей мере, аминокислоты 405-661, например, с аминокислоты 400, 401, 402... по 661, также как 383 или 384-661, 383 или 384-715, 383 или 384-746, 383 или 384-749 или 383 или 384-809 или от 383 или 384 до любого C-конца между 661-809 полипротеина HCV с нумерацией относительно полноразмерного полипротеина HCV-1. Сходным образом предпочтительные для применения здесь полипептиды E1 могут включать аминокислоты 192-326, 192-330, 192-333, 192-360, 192-363, 192-383 или со 192 по любой C-конец между 326-383 полипротеина HCV.
Комплексы E1E2 могут быть также составлены из иммуногенных фрагментов E1 и E2, которые включают эпитопы. Например, фрагменты полипептидов E1 могут включать от приблизительно 5 аминокислот до почти полноразмерной молекулы, как, например, 6, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 185 или более аминокислот полипептида E1 или любое целое число между указанными числами. Сходным образом, фрагменты полипептидов E2 могут включать 6, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300 или 350 аминокислот полипептида E2 или любое целое число между указанными числами. Полипептиды E1 и E2 могут происходить из одного или разных штаммов HCV.
Например, эпитопы из, например, гипервариабельной области E2, такой как область, охватывающая аминокислоты 384-410 или 390-410, могут быть включены в полипептид E2. Особенно эффективным эпитопом E2 для включения в последовательность E2 является эпитоп, который включает консенсусную последовательность, происходящую из данной области, такую как консенсусную последовательность Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn, которая является консенсусной последовательностью для аминокислот 390-410 генома HCV типа 1. Известны и описаны, например, в Chien et al., Международная публикация № WO 93/00365, дополнительные эпитопы E1 и E2.
Более того, полипептиды E1 и E2 комплекса могут не содержать вовсе или не содержать часть пронизывающего мембрану домена. Последовательность заякоривания в мембране функционирует для связывания полипептида с эндоплазматическим ретикулумом. Обычно такие полипептиды способны к секреции в среду роста, в которой экспрессирующий белок организм культивируют. Однако, как описано в Международной публикации № 98/50556, такие полипептиды могут быть обнаружены также внутри клетки. Секрецию в среду роста легко обнаружить с помощью ряда способов детекции, включая, например, электрофорез в полиакриламидном геле и тому подобное и иммунологических способов, таких как тесты с иммунопреципитацией, как описано, например, в Международной публикации № WO 96/04301, опубликованной 15 февраля 1996 г. Что касается E1, обычно полипептиды, заканчивающиеся аминокислотой в положении приблизительно 370 или выше (на основе нумерации E1 HCV-1), должны удерживаться ER и, следовательно, не секретироваться в среду роста. Что касается E2, полипептиды, заканчивающиеся аминокислотой в положении приблизительно 731 или выше (также на основе нумерации последовательности E2 HCV-1), должны удерживаться ER и не секретироваться (смотри, например, Международную публикацию № WO 96/04301, опубликованную 15 февраля 1996 г.). Следует отметить, что данные положения аминокислот не являются абсолютными и могут в некоторой степени варьировать. Таким образом, настоящее изобретение охватывает применение полипептидов E1 и E2, которые сохраняют трансмембранный связывающий домен, а также полипептидов, лишенных всего трансмембранного связывающего домена или его части, включая полипептиды E1, заканчивающиеся аминокислотами в положении приблизительно 369 и ниже, и полипептиды E2, заканчивающиеся аминокислотами в положении приблизительно 730 и ниже, которые предназначены для включения в настоящее изобретение. Более того, укорочение с C-конца может продолжаться за пределами пронизывающего мембрану домена в направлении N-конца. Так, например, настоящим изобретением также охватываются варианты E1 с отсечением в положениях ниже, например 360, и варианты E2 с отсечением в положениях ниже, например 715. Все это необходимо в той мере, в какой полипептиды E1 и E2 остаются функциональными для предназначенной для них цели. Однако особенно предпочтительными укороченными конструктами E1 являются те, которые не выходят за пределы аминокислоты в положении приблизительно 300. Наиболее предпочтительными являются те, которые заканчиваются в положении 360. Предпочтительными укороченными конструктами E2 являются укороченные с C-конца варианты, которые не выходят за пределы аминокислоты в положении 715. Особенно предпочтительными укороченными вариантами являются те молекулы, которые укорочены после любой аминокислоты 715-730, такой как 725. Если применяют укороченные молекулы, предпочтительно использовать молекулы E1 и E2, которые обе укорочены.
Полипептиды E1 и E2 и их комплексы могут также находиться в виде асиалогликопротеинов. Такие асиалогликопротеины получают способами, известными в данной области техники, такими как применение клеток, в которых блокировано концевое гликозилирование. Когда данные белки экспрессируют в таких клетках и выделяют аффинной хроматографией на GNA лектине, белки E1 и E2 спонтанно агрегируют. Подробные способы получения данных агрегатов E1E2 описаны, например, в патенте США № 6074852.
Более того, комплексы E1E2 могут находиться в виде гетерогенной смеси молекул благодаря отсечению и протеолитическому расщеплению, как описано выше. Так, композиция, включающая комплексы E1E2, может включать множество форм E1E2, таких как E1E2, заканчивающиеся аминокислотой 746 (E1E2746), E1E28, заканчивающиеся аминокислотой 809 (E1E2809), или любую из различных других описанных выше молекул E1 и E2, таких как молекулы E2 с укорочением с N-конца на 1-20 аминокислот, таких как формы E2, начинающихся с аминокислоты 387, аминокислоты 402, аминокислоты 403 и т.д.
Комплексы E1E2 легко получать рекомбинантным способом либо в форме гибридных белков, либо с помощью, например, котрансфекции клеток-хозяев конструктами, кодирующими интересующие полипептиды E1 и E2. Котрансфекция может быть осуществлена транс- или цис-способом, т.е. с применением раздельных векторов или с применением одного вектора, который несет гены и E1, и E2. При применении одного вектора могут управляться одним набором контрольных элементов или, альтернативно, гены могут находиться в векторе в индивидуальных экспрессионных кассетах, управляемых индивидуальными контрольными элементами. После экспрессии белки E1 и E2 обычно спонтанно ассоциируют. Альтернативно, комплексы могут быть образованы путем совместного смешивания индивидуальных белков, которые были получены раздельно либо в очищенной, либо в полуочищенной форме, либо даже путем смешивания культуральных сред, в которых культивировали экспрессирующие белки клетки-хозяева, если белки являются секретируемыми. Наконец, комплексы E1E2 настоящего изобретения могут быть экспрессированы в виде гибридного белка, в котором желаемая часть E1 соединена с желаемой частью E2.
Способы получения комплексов E1E2 из полноразмерных, укороченных белков E1 и E2, которые секретируются в среду, а также из внутриклеточно продуцированных укороченных белков известны в данной области техники. Например, такие комплексы могут быть получены рекомбинантным способом, как описано в патенте США № 6121020; Ralston et al., J. Virol. (1993) 67:6753-6761, Grakoui et al., J. Virol. (1993) 67:1385-1395; и Lanford et al., Virology (1993) 197:225-235.
Так, полинуклеотиды, кодирующие полипептиды E1 и E2 HCV для применения в настоящем изобретении, могут быть получены с помощью стандартных способов молекулярной биологии. Например, полинуклеотидные последовательности, кодирующие описанные выше молекулы, могут быть получены с применением рекомбинантных способов, таких как скрининг кДНК и геномных библиотек из клеток, экспрессирующих ген, или путем извлечения гена из вектора, о котором известно, что он включает ген. Более того, желаемый ген может быть выделен непосредственно из молекул вирусной нуклеиновой кислоты с применением способов, описанных в данной области техники, таких как описанные Houghton et al., патент США № 5350671. Интересующий ген может быть также получен с помощью синтеза, а не клонирования. Могут быть сконструированы молекулы с подходящими кодонами для конкретной последовательности. Затем производят сборку полной последовательности из перекрывающихся олигонуклеотидов, полученных стандартными способами, и осуществляют сборку полной кодирующей последовательности. Смотри, например, Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et al. (1984) Science 223:1299; и Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.
Так, конкретные нуклеотидные последовательности могут быть получены из векторов, содержащих желаемые последовательности, или могут быть полностью или частично синтезированы с помощью известных в данной области техники различных способов синтеза олигонуклеотидов, таких как способы сайт-направленного мутагенеза и полимеразной цепной реакции (ПЦР), когда это является уместным. Смотри, например, Sambrook, выше. В частности, один из способов получения олигонуклеотидных последовательностей, кодирующих желаемые последовательности, заключается в отжиге комплиментарных наборов перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов, полученных в традиционном автоматизированном синтезаторе полинуклеотидов, с последующим лигированием подходящей ДНК-лигазой и амплификацией лигированной нуклеотидной последовательности посредством ПЦР. Смотри, например, Jayaraman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4084-4088. Для получения молекул с измененными или усиленными антигенсвязывающими свойствами или иммуногенностью могут быть дополнительно применены направленный синтез олигонуклеотидов (Jones et al. (1986) Nature 54:75-82), направленный мутагенез олигонуклеотидов в имеющихся нуклеотидных областях (Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327 и Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536) и ферментативное встраивание пропущенных олигонуклеотидов с применением T4 ДНК-полимеразы (Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033).
После того как кодирующие последовательности получены или выделены, такие последовательности могут быть клонированы в любой подходящий вектор или репликон. Специалистам в данной области техники известно множество векторов для клонирования, и выбор подходящего клонирующего вектора является делом предпочтения. Подходящие векторы включают, но не ограничиваются этим, плазмиды, фаги, транспозоны, космиды, хромосомы или вирусы, которые пригодны для репликации при соединении с подходящими элементами контроля.
Кодирующую последовательность затем ставят под контроль подходящих контрольных элементов в зависимости от применяемой для экспрессии системы. Так, кодирующая последовательность может быть поставлена под контроль промотора, сайта связывания рибосомы (для бактериальной экспрессии) и, необязательно, оператора таким образом, чтобы интересующая последовательность ДНК транскрибировалась в РНК подходящим трансформантом. Кодирующая последовательность может содержать или не содержать сигнальный пептид или лидирующую последовательность, которая затем может быть удалена хозяином при посттрансляционном процессинге. Смотри, например, патенты США №№ 4431739; 4425437; 4338397.
В дополнение к контрольным последовательностям может быть желательным добавление регуляторных последовательностей, которые позволяют регулировать экспрессию последовательностей в соответствии с ростом клетки-хозяина. Специалистам в данной области техники известны регуляторные последовательности, и примеры включают такие, которые вызывают включение или выключение экспрессии гена в ответ на химический или физический стимул, включая присутствие регуляторного соединения. В векторе могут также иметься регуляторные элементы и других типов. Например, здесь могут быть применены энхансерные элементы для повышения уровня экспрессии конструктов. Примеры включают энхансер раннего гена SV40 (Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761), энхансер/промотор из длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса (Gorman et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777) и элементы из CMV человека (Boshart et al. (1985) Cell 41:521), такие как элементы, включенные в последовательность интрона A CMV (патент США № 5688688). Экспрессионная кассета может дополнительно включать область начала репликации для автономной репликации в подходящей клетке-хозяине, один или более маркеров селекции, один или более сайтов рестрикции, потенциал для большого числа копий и сильный промотор.
Экспрессионный вектор конструируют таким образом, что конкретная кодирующая последовательность размещается в векторе с подходящими регуляторными последовательностями, причем положение и ориентация кодирующей последовательности по отношению к контрольным последовательностям таковы, что кодирующая последовательность транскрибируется под «контролем» контрольных последовательностей (т.е. РНК-полимераза, которая связывается с молекулой ДНК на контрольных последовательностях, транскрибирует кодирующую последовательность). Для достижения данной цели может быть желательной модификация последовательностей, кодирующих интересующую молекулу. Например, в некоторых случаях может быть необходимым модифицировать последовательность таким образом, чтобы ее можно было присоединить к контрольным последовательностям в правильной ориентации, т.е. для сохранения рамки считывания. Контрольные последовательности и другие регуляторные последовательности могут быть лигированы с кодирующей последовательностью перед вставкой в вектор. Альтернативно, кодирующая последовательность может быть клонирована прямо в экспрессионный вектор, который уже содержит контрольные последовательности и подходящий сайт рестрикции.
Как объяснялось выше, может быть также желательным получение мутантов или аналогов интересующего полипептида. Мутанты или аналоги полипептидов HCV для применения в рассматриваемых композициях могут быть получены путем делеции части последовательности, кодирующей интересующий полипептид, путем вставки последовательности и/или путем замены одного или более нуклеотидов в последовательности. Способы модификации нуклеотидных последовательностей, такие как сайт-направленный мутагенез и тому подобное, хорошо известны специалистам в данной области техники. Смотри, например, Sambrook et al., выше; Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448; Geisselsoder et al. (1987) BioTechniques 5:786; Zoller and Smith (1983) Methods Enzymol. 100:468; Dalbie-McFarland et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6409.
Молекулы могут быть экспрессированы в широком множестве систем, включая экспрессионные системы насекомых, млекопитающих, бактерий, вирусов и дрожжей, все они хорошо известны в данной области техники.
Например, экспрессионные системы клеток насекомых, такие как бакуловирусные системы, известны специалистам в данной области техники и описаны, например, Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin № 1555 (1987). Материалы и способы для экспрессионных систем бакуловирус/клетка насекомого имеются в продаже в форме наборов от, среди прочих, Invitrogen, San Diego CA (набор "MaxBac"). Сходным образом, экспрессионные системы клеток бактерий и млекопитающих хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в Sambrook et al., выше. Дрожжевые экспрессионные системы также известны в данной области техники и описаны, например, в Yeast Genetic Engineering (Barr et al., eds., 1989) Butterworths, London.
Также известен ряд подходящих клеток-хозяев для применения с указанными выше системами. Например, в данной области техники известны линии клеток млекопитающих и включают иммортализованные линии клеток, доступных от Американской коллекции типовых культур (ATCC), такие как, но не ограничиваясь этим, клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки HeLa, клетки почек детеныша хомячка (BHK), клетки почек обезьяны (COS), клетки почек эмбриона человека, клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), клетки почек быка Madin-Darby ("MDBK"), а также другие. Сходным образом, должны найти применение с настоящими экспрессионными конструктами бактериальные хозяева, такие как E. coli, Bacillus subtilis и Streptococcus spp. Дрожжевые хозяева, пригодные в настоящем изобретении, включают среди прочих Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe и Yarrowia lipolytica. Клетки насекомых для применения с бакуловирусными экспрессионными векторами включают среди прочих Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda и Trichoplusia ni.
Молекулы нуклеиновой кислоты, включающие интересующие нуклеотидные последовательности, могут быть стабильно интегрированы в геном клетки-хозяина или поддерживаться на стабильном эписомальном элементе в подходящей клетке-хозяине с применением различных способов доставки генов, хорошо известных в данной области техники. Смотри, например, патент США № 5399346.
В зависимости от выбранных экспрессионной системы и хозяина растущими клетками хозяина, трансформированными описанным выше экспрессионным вектором, образуются молекулы при условиях, при которых экспрессируется белок. Экспрессированный белок затем выделяют из клеток-хозяев и очищают. Если экспрессионная система секретирует белок в ростовую среду, продукт может быть очищен прямо из среды. Если он не секретируется, он может быть выделен из клеточных лизатов. Выбор подходящих условий роста и способов извлечения находятся в компетенции специалиста в данной области техники.
Композиции
После получения антигены E1E2 могут быть представлены в вакцинных композициях, например, в профилактических (т.е. для предотвращения инфекции) или терапевтических (для лечения HCV после инфицирования) вакцинах. Вакцины могут включать смеси одного или более комплексов E1E2, таких как комплексы E1E2, полученные из более чем одного вирусного изолята, а также дополнительные антигены HCV. Более того, как объяснялось выше, комплексы E1E2 могут находиться в виде гетерогенной смеси молекул благодаря урезанию и протеолитическому расщеплению. Так, композиция, включающая комплексы E1E2, может включать множество форм E1E2, таких как E1E2, заканчивающиеся аминокислотой 746 (E1E2746), E1E28, заканчивающиеся аминокислотой 809 (E1E2809), или любую из различных других описанных выше молекул E1 и E2, таких как молекулы E2 с укорочением с N-конца на 1-20 аминокислот, таких как формы E2, начинающихся с аминокислоты 387, аминокислоты 402, аминокислоты 403 и т.д.
Вакцины можно вводить в сочетании с другими антигенами и иммунорегулирующими агентами, например, иммуноглобулинами, цитокинами, лимфокинами и хемокинами, включая, но не ограничиваясь этим, такие цитокины как ИЛ-2, модифицированный ИЛ-2 (cys125→ser125), GM-CSF, ИЛ-12, γ-интерферон, IP-10, MIP1β, FLP-3, рибавирин и RANTES.
Вакцины обычно должны включать один или более «фармацевтически приемлемых наполнителей или носителей», таких как вода, солевой раствор, глицерин, этанол и т.д. В дополнение в таких носителях могут находиться вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, буферирующие pH агенты и тому подобное.
Необязательно имеющийся носитель представляет собой молекулу, которая сама по себе не индуцирует продукцию антител, вредных для индивидуума, получающего композицию. Подходящие носители обычно являются большими, медленно метаболизируемыми макромолекулами, такими как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, агрегаты липидов (такие как масляные капельки или липосомы) и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны специалистам в данной области техники. Более того, полипептид HCV может быть конъюгирован с бактериальным анатоксином, таким как анатоксин дифтерии, столбняка, холеры и т.д.
Как здесь объяснялось, в одной и той же композиции для повышения иммунного ответа могут присутствовать субмикронные эмульсии масла в воде и/или ISS, такие как олигонуклеотиды CpG (описываемые дополнительно ниже). Могут также присутствовать дополнительные адъюванты, такие как, но не ограничиваясь этим: (1) соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.д.; (2) адъювантная система RibiTM (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), содержащая 2% Сквалена, 0,2% Твина-80 и один или более компонентов бактериальной клеточной стенки из группы, состоящей из монофосфолипида A (MPL), димиколата трегалозы (TDM) и скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL + CWS (DetoxTM); (3) могут быть применены сапониновые адъюванты, такие как QS21 или StimulonTM (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), или полученные из них частицы, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы), причем эти ISCOM могут не содержать дополнительное поверхностно-активное вещество (смотри, например, Международную публикацию № WO 00/07621); (4) полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA); (5) цитокины, такие как интерлейкины, такие как ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-12, и т.д. (смотри, например Международную публикацию № WO 99/44636), интерфероны, такие как гамма-интерферон, колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF), фактор некроза опухолей (TNF) и т.д.; (6) детоксицированные мутанты бактериального АДФ-рибозилирующего токсина, такого как холерный токсин (CT), коклюшный токсин (PT) или термолабильный токсин E. coli (LT), в особенности LT-K63 (где аминокислота дикого типа в положении 63 заменена лизином) LT-R72 (где аминокислота дикого типа в положении 72 заменена аргинином), CT-S109 (где аминокислота дикого типа в положении 109 заменена серином) и PT-K9/G129 (где аминокислота дикого типа в положении 9 заменена лизином, а в положении 129 - глицином) (смотри, например, Международные публикации №№ WO 93/13202 и WO 92/19265); (7) монофосфорильный липид A (MPL) или 3-O-деацилированный MPL (3dMPL) (смотри, например, патенты GB 2220221; EPA 0689454), необязательно по существу в отсутствие квасцов (смотри, например, Международную публикацию № WO 00/56358); (8) сочетания 3dMPL с, например, QS21 и/или эмульсиями масла в воде (смотри, например, патенты EPA 0835318; EPA 0735898; EPA 0761231); (9) полиоксиэтиленовый простой эфир или полиоксиэтиленовый сложный эфир (смотри, например, Международную публикацию № WO 99/52549); (10) сапонин и иммуностимулирующий олигонуклеотид, такой как олигонуклеотид CpG (смотри, например, Международную публикацию № WO 00/62800); (11) иммуностимулятор и частица соли металла (смотри, например, Международную публикацию № WO 00/23105); (12) сапонин и эмульсия масла в воде (смотри, например, Международную публикацию № WO 99/11241); (13) сапонин (например, QS21) + 3dMPL + ИЛ-12 (необязательно + стерин) (смотри, например, Международную публикацию № WO 98/57659); и (14) другие вещества, которые действуют в качестве иммуностимулирующих агентов, для повышения эффективности композиции.
Мурамиловые пептиды включают, но не ограничиваются этим, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP),
N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP),
-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1',2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (MTP-PE) и т.д.
Обычно вакцинные композиции получают в форме, пригодной для инъекции, либо в виде жидких растворов, либо суспензий; могут быть также получены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией.
Вакцины должны включать терапевтически эффективное количество комплексов E1E2 и, при необходимости, любой другой из упомянутых выше компонентов. «Терапевтически эффективное количество» означает количество белка E1E2, которое должно индуцировать иммунологический ответ, предпочтительно защитный иммунологический ответ, у индивидуума, которому его вводят. Такой ответ должен обычно приводить к развитию у субъекта секреторного, клеточного и/или опосредуемого антителами иммунного ответа на вакцину. Обычно такой ответ включает, но не ограничивается этим, один или более из следующих ответов: образование антител любого из иммунологических классов, таких как иммуноглобулины A, D, E, G или M; пролиферация B- и T-лимфоцитов; обеспечение иммунологических клеток сигналами активации, роста и дифференцировки; экспансия хелперных T-клеточных, супрессорных T-клеточных и/или цитотоксичных T-клеточных и/или γδ T-клеточных популяций.
После составления вакцины обычно вводят парентерально, например, путем инъекции, либо подкожной, либо внутримышечной. Другие составы, пригодные для других способов введения, включают пероральные или легочные составы, суппозитории и трансдермальные нанесения. Дозировка для лечения может быть представлена схемой с одной дозой или схемой с множеством доз. Предпочтительно, чтобы эффективное количество было достаточным для осуществления лечения или профилактики симптомов заболевания. Точное необходимое количество должно варьировать в зависимости от, среди прочих факторов, подлежащего лечению субъекта; возраста и общего состояния подлежащего лечению индивидуума; способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела; степени желаемой защиты; тяжести подлежащего лечению состояния; выбранного конкретного полипептида E1E2 и способа его введения. Подходящее эффективное количество может быть легко определено специалистом в данной области техники. «Терапевтически эффективное количество» должно входить в относительно широкий диапазон, который может быть определен с помощью стандартных испытаний с применением известных в данной области техники моделей in vitro и in vivo. Количество полипептидов E1E1, примененное в нижеследующих примерах, служит общим руководством, которое может быть применено для оптимизации индукции антител против E1, E2 и/или E1E2.
В частности, комплекс E1E2 предпочтительно инъецируют внутримышечно крупному млекопитающему, такому как примат, например бабуин, шимпанзе или человек, в дозе от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 5,0 мг на дозу или в любом количестве между указанными границами, таком как от 0,5 мкг до приблизительно 1,0 мг, от 1 мкг до приблизительно 500 мкг, от 2,5 мкг до приблизительно 250 мкг, от 4 мкг до приблизительно 200 мкг, таком как 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ... 20 ... 30 ... 40 ... 50 ... 60 ... 70 ... 80 ... 90 ... 100 и т.д. мкг на дозу. Полипептиды E1E2 можно вводить либо млекопитающему, которое не инфицировано HCV, либо инфицированному HCV млекопитающему.
Введение полипептидов E1E2 может вызывать у млекопитающего титр антител против E1, E2 и/или E1E2, который может сохраняться, по меньшей мере, 1 неделю, 2 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 6 месяцев, 1 год или дольше. Полипептиды E1E2 можно также вводить для обеспечения ответа памяти. Если достигается такой ответ, титры антител со временем снижаются, однако экспозиция с вирусом HCV или иммуногеном приводит к быстрой индукции антител, например, в течение всего нескольких дней. Титры антител необязательно можно поддерживать бустерными инъекциями полипептидов E1E2 через 2 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 1 год или более после примирующей инъекции.
Предпочтительно, чтобы полипептид E1E2 индуцировал титр антител, равный, по меньшей мере, 10, 100, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 5000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000 (среднее геометрическое титра) или выше или любое число между указанными титрами при определении с применением стандартного иммунологического анализа, такого как иммунологический анализ, описанный в примерах ниже. Смотри, например, Chien et al., Lancet (1993) 342:933; и Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011.
Субмикронные эмульсии масла в воде
Как объяснялось выше, состав субмикронной эмульсии масла в воде также можно вводить позвоночному субъекту либо до, либо одновременно, либо после доставки антигена E1E2. Субмикронные эмульсии масла в воде для применения здесь включают нетоксичные, метаболизируемые масла и имеющиеся в продаже эмульгаторы. Примеры нетоксичных, метаболизируемых масел включают, без ограничения, растительные масла, рыбные масла, животные масла или синтетически полученные масла. Рыбные масла, такие как масло печени трески, масла печени акулы и китовый жир являются предпочтительными, и особенно предпочтительными являются сквален, 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен, обнаруженные в масле печени акулы. Масляный компонент должен присутствовать в количестве от приблизительно 0,5% до приблизительно 20% по объему, предпочтительно в количестве до приблизительно 15%, более предпочтительно в количестве от приблизительно 1% до приблизительно 12%, и наиболее предпочтительно от 1% до приблизительно 4% масла.
Водная часть адъюванта может быть забуференным физиологическим раствором или водой без добавок. Поскольку композиции предназначены для парентерального введения, предпочтительно готовить конечные растворы так, чтобы тоничность, т.е. осмолярность была по существу такой же, как и у нормальных физиологических жидкостей, для предотвращения набухания после введения или быстрой абсорбции композиции из-за различий в концентрации ионов между композицией и физиологическими жидкостями. Если вместо воды применяют физиологический раствор, предпочтительно забуферивать физиологический раствор для поддержания pH, совместимого с нормальными физиологическими условиями. В определенных условиях может иметься также необходимость поддерживать pH на конкретном уровне для обеспечения стабильности определенных компонентов композиции. Таким образом, pH композиций должен обычно равняться 6-8, и pH может поддерживаться с помощью физиологически приемлемого буфера, такого как фосфатный, ацетатный, трис, бикарбонатный или карбонатный буфер или тому подобный. Количество присутствующего водного агента обычно должно быть количеством, необходимым для доведения композиции до желаемого конечного объема.
Эмульгирующие агенты, пригодные для применения в составах масла в воде, включают, без ограничения, неионные поверхностно-активные вещества на основе сорбитана, такие как моно-, ди- или триэфиры сорбитана, например, такие, как имеющиеся в продаже под названием SpanTM или ArlacelTM, такой как SpanTM 85 (триолеат сорбитана); полиоксиэтиленовые моно-, ди- или триэфиры сорбитана, известные в продаже под наименованием TweenTM, такой как Tween 80TM (моноолеат полиоксиэтиленсорбитана); полиоксиэтиленовые жирные кислоты, имеющиеся в продаже под названием MyrjTM; эфиры полиоксиэтиленовых жирных кислот, полученные из лаурилового, ацетилового, стеарилового и олеилового спиртов, такой как известный под названием BrijTM, и тому подобное. Данные вещества легко доступны из ряда коммерческих источников, включая Sigma, St. Louis, MO и ICI America's Inc., Wilmington, DE. Данные эмульгирующие агенты могут быть применены отдельно или в сочетании. Эмульгирующий агент обычно должен присутствовать в количестве от 0,02% до приблизительно 2,5% по массе (мас./об.), предпочтительно от 0,05% до приблизительно 1%, и наиболее предпочтительно от 0,01% до приблизительно 0,5. Обычно имеющееся количество должно составлять приблизительно 20-30% от массы применяемого масла.
Эмульсии также могут содержать другие иммуностимулирующие агенты, такие как мурамиловые пептиды, включая, но не ограничиваясь этим, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP), -ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1',2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (MTP-PE) и т.д. Могут также присутствовать иммуностимулирующие компоненты стенки бактериальной клетки, такие как монофосфориллипид A (MPL), димиколат трегалозы (TDM) и скелет клеточной стенки (CWS). В альтернативном варианте эмульсия может не содержать данные агенты, как, например, эмульсия, не содержащая MTP-PE. Субмикронные эмульсии масла в воде настоящего изобретения могут также не содержать любые блок блок-сополимеры полиоксипропилен-полиоксиэтилен (POP-POE). Описание различных подходящих составов субмикронной эмульсии масла в воде для применения в настоящем изобретении, а также иммуностимулирующих агентов смотри, например, в Международной публикации № WO 90/14837; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 19th edition, 1995; Van Nest et al., "Advanced adjuvant formulations for use with recombinant subunit vaccines," In Vaccines 92, Modern Approaches to New Vaccines (Brown et al., ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp.57-62 (1992); Ott et al., "MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines" in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell, M.F. and Newman, M.J. eds.) Plenum Press, New York (1995) pp. 277-296; и патенте США № 6299884.
Для получения субмикронных частиц, т.е. частиц размером менее 1 микрона в диаметре и в нанометровом диапазоне размеров, может быть применен ряд способов. Например, могут быть применены имеющиеся в продаже эмульсификаторы, действующие по принципу больших сил сдвига, развиваемых при продавливании жидкостей через маленькие отверстия под высоким давлением. Примеры имеющихся в продаже эмульсификаторов включают, без ограничения, микрофлуидизатор модели 110Y (Microfluidics, Newton, MA), Gaulin модели 30CD (Gaulin, Inc., Everett, MA) и Rainnie Minilab Type 8.30H (Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, WI). Подходящее давление при применении конкретного эмульгатора легко определяется специалистом в данной области техники. Например, при применении микрофлуидизатора модели 110Y работа при давлении от 5000 до 30000 фунт/кв.дюйм (34500 кПа - 207000 кПа) обеспечивает образование капелек с диаметром от приблизительно 100 до 750 нм.
Размер капелек масла можно варьировать путем изменения соотношения поверхностно-активного вещества и масла (повышение соотношения снижает размер капелек), рабочего давления (повышение рабочего давления снижает размер капелек), температуры (повышение температуры снижает размер капелек) и добавлением амфипатического иммуностимулирующего агента (добавление таких агентов снижает размер капелек). Реальный размер капелек должен меняться в зависимости от конкретного поверхностно-активного вещества, масла и иммуностимулирующего агента, если таковые имеются, и от конкретных выбранных рабочих условий. Размер капелек можно варьировать путем применения измерительных приборов, таких как имеющийся в продаже анализатор субмикронных частиц (модель N4MD), производимый Coulter Corporation, и параметры можно варьировать, руководствуясь изложенными выше указаниями, до тех пор, пока по существу все капельки не станут меньше 1 микрона в диаметре, предпочтительно менее приблизительно 0,8 микрон в диаметре, и наиболее предпочтительно менее приблизительно 0,5 микрон в диаметре. Термин по существу все означает, по меньшей мере, приблизительно 80% (по количеству), предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 95%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 98%. Распределение размеров частиц обычно является гауссовским, так что средний диаметр является меньшим по сравнению с установленными границами.
Особенно предпочтительными для применения здесь субмикронными эмульсиями масла в воде являются эмульсии сквален/вода, не обязательно содержащие различные количества MTP-PE, такие как субмикронные эмульсии масла в воде, содержащие 4-5% мас./об. Сквалена, 0,25-1,0% мас./об. Tween80TM (моноолеат полиоксиэтиленсорбитана) и/или 0,25-1,0% Span85TM (триолеат сорбитана) и необязательно N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1',2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (MTP-PE), например, субмикронная эмульсия масла в воде, известная как "MF59" (Международная публикация № WO 90/14837; патент США № 6299884; и Ott et al., "MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines" in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell, M.F. and Newman, M.J. eds.) Plenum Press, New York, 1995, pp. 277-296). MF59 содержит 4-5% мас./об. Сквалена (например, 4,3%), 0,25-0,5% мас./об. Tween80TM и 0,5% мас./об. Span85TM и необязательно содержит различные количества MTP-PE, составленная в форме субмикронных частиц с помощью микрофлуидизатора, такого как микрофлуидизатор модели 110Y (Microfluidics, Newton, MA). Например, MTP-PE может присутствовать в количестве приблизительно 0-500 мкг/дозу, более предпочтительно 0-250 мкг/дозу и наиболее предпочтительно 0-100 мкг/дозу. Применяемый здесь термин "MF59-0" относится к указанной выше субмикронной эмульсии масла в воде, не содержащей MTP-PE, а термин MF59-MTP обозначает состав, который содержит MTP-PE. Например, "MF59-100" содержит 100 мкг MTP-PE на дозу, и т.д. MF69, другая предназначенная для применения здесь субмикронная эмульсия масла в воде содержит 4,3% мас./об. Сквалена, 0,25% мас./об. Tween80TM и 0,75% мас./об. Span85TM, необязательно MTP-PE. Еще одной субмикронной эмульсией масла в воде является MF75, известная также как SAF, содержащая 10% Сквалена, 0,4% Tween80TM, 5% блок-сополимера плюроника L121 и thr-MDP, также микрофлуидизированная в субмикронную эмульсию. MF75-MTP обозначает состав MF75, который включает MTP, например, 100-400 мкг MTP-PE на дозу.
Субмикронные эмульсии масла в воде, способы их получения и иммуностимулирующие агенты, такие как мурамиловые пептиды, для применения в композициях подробно описаны в Международной публикации WO 90/14837.
После составления субмикронной эмульсии масла в воде ее можно вводить позвоночному субъекту либо до, либо одновременно, либо после доставки антигена и ISS, если она применяется. Если составы адъюванта вводят перед иммунизацией антигеном, их можно вводить уже за 5-10 дней до иммунизации, предпочтительно за 3-5 дней до иммунизации и наиболее предпочтительно за 1-3 дня или 2 дня до иммунизации интересующими антигенами. При раздельном введении субмикронный состав масла в воде можно вводить в то же место, что и место доставки антигенных композиций, или в другое место доставки.
Если желательна одновременная доставка, субмикронный состав масла в воде может быть включен в антигенные композиции. В целом, антигены и субмикронная эмульсия масла в воде могут быть соединены простым смешиванием, перемешиванием или встряхиванием. Для получения вакцинных композиций могут быть применены и другие способы, такие как быстрое пропускание смеси из двух компонентов через небольшое отверстие (такое, как игла для подкожных впрыскиваний).
При объединении различные компоненты композиции могут находиться в широком диапазоне соотношений. Например, компоненты антигена и эмульсии обычно применяют при объемном отношении от 1:50 до 50:1, предпочтительно от 1:10 до 10:1, более предпочтительно от приблизительно 1:5 до 3:1 и наиболее предпочтительно приблизительно 1:1. Однако другие соотношения могут быть более подходящими для конкретных целей, таких, когда конкретный антиген имеет низкую иммуногенность, и в этом случае требуется относительно большее количество антигенного компонента.
Иммуностимулирующие молекулы нуклеиновой кислоты (ISS)
Ранее сообщалось, что бактериальная ДНК стимулирует иммунные ответы у млекопитающих. Смотри, например, Krieg et al., Nature (1995) 374:546-549. Данная способность к иммуностимуляции была объяснена высокой частотой встречаемости иммуностимулирующих молекул нуклеиновой кислоты (ISS), таких как неметилированные динуклеотиды CpG, имеющиеся в бактериальной ДНК. Было показано, что олигонуклеотиды, содержащие неметилированные мотивы CpG, вызывают активацию B-клеток, NK клеток и презентирующих антиген клеток (APC), таких как моноциты и макрофаги. Смотри, например, патент США № 6207646.
В настоящем изобретении применяются адъюванты на основе ISS. ISS изобретения включают олигонуклеотид, который может быть частью большего нуклеотидного конструкта, такого как плазмидная или бактериальная ДНК. Олигонуклеотид может иметь линейную или кольцевую конфигурацию или может содержать как линейные, так и кольцевые сегменты. Олигонуклеотид может включать модификации, такие как, но не ограничиваясь этим, модификации YOH или 5'OH группы, модификации нуклеотидного основания, модификации сахарного компонента и модификации фосфатной группы. ISS может включать рибонуклеотиды (содержащие рибозу в качестве единственного или основного сахарного компонента), дезоксирибонуклеотиды (содержащие дезоксирибозу в качестве основного сахарного компонента). В олигонуклеотид могут быть также включены модифицированные сахара или аналоги сахаров. Примеры сахарных частей, которые могут быть применены, включают рибозу, дезоксирибозу, пентозу, дезоксипентозу, гексозу, дезоксигексозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу, ликсозу и аналог сахара циклопентильную группу. Сахар может находиться в пиранозильной или фуранозильной форме. Может быть применено фосфорное производное (или модифицированная фосфатная группа) и оно может представлять собой монофосфат, дифосфат, трифосфат, алкилфосфат, алканфосфат, фосфоронтиоат, фосфордитиоат и тому подобное. Основания нуклеиновой кислоты, которые включены в олигонуклеотидную основу ISS, могут быть природными пуриновыми и пиримидиновыми основаниями, а именно урацилом или тимином, цитозином, аденином или гуанином, а также природными или синтетическими модификациями данных оснований. Более того, доступно и известно специалистам в данной области техники большое количество неприродных нуклеозидов, включающих различные гетероциклические основания и различные сахарные части (и аналоги сахаров).
В структурном отношении базовый олигонуклеотид ISS представляет собой содержащую CG нуклеотидную последовательность или p(lC) нуклеотидную последовательность, которая может быть палиндромной. Цитозин может быть метилирован или неметилирован. Примеры конкретных молекул ISS для применения в настоящем изобретении включают молекулы CpG, CpY и CpR и тому подобное, которые известны в данной области техники.
Предпочтительными ISS являются такие, которые берут начало от семейства молекул CpG, динуклеотиды CpG и синтетические олигонуклеотиды, которые включают мотивы CpG (смотри, например, Krieg et al. Nature (1995) 374:546 и Davis et al. J. Immunol. (1998) 160:870-876), такие как любой из различных иммуностимулирующих CpG олигонуклеотидов, раскрытых в патенте США № 6207646. Такие CpG олигонуклеотиды обычно включают от, по меньшей мере, 8 до приблизительно 100 нуклеотидов, предпочтительно от 8 до 40 нуклеотидов, более предпочтительно 15-35 нуклеотидов, предпочтительно 15-25 нуклеотидов и любое количество нуклеотидов между данными величинами. Например, олигонуклеотиды, включающие консенсусный мотив CpG, представленный формулой 5'-X1CGX2-3', где X1 и X2 являются нуклеотидами, а C является неметилированным, должны найти применение в качестве иммуностимулирующих CpG молекул. Обычно X1 представляет собой A, G или T, а X2 является C или T. Другие пригодные молекулы CpG включают те, которые охватываются формулой 5'-X1X2CGX3X4, где X1 и X2 представляют собой последовательность, такую как GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT или TpG, а X3 и X4 представляют собой TpT, CpT, ApT, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA, GpT, CpA или TpG, где "p" обозначает связь через фосфат. Предпочтительно, чтобы олигонуклеотид не включал последовательность GCG на 5'- и/или 3'-конце или рядом с ним. Кроме того, предпочтительно, чтобы к 5'-концу CpG примыкали два пурина (предпочтительно динуклеотид GpA) или пурин и пиримидин (предпочтительно GpT), а к 3'-концу примыкали два пиримидина, предпочтительно динуклеотид TpT или TpC. Таким образом, предпочтительные молекулы должны включать последовательность GACGTT, GACGTC, GTCGTT или GTCGCT, и данные последовательности должны фланкироваться несколькими дополнительными нуклеотидами, например, 1-20 или более нуклеотидами, предпочтительно от 2 до 10 нуклеотидами и более предпочтительно от 3 до 5 нуклеотидами или любым целым числом между указанными границами. Нуклеотиды, расположенные за пределами области центрального ядра, по-видимому, являются очень легко заменяемыми.
Более того, олигонуклеотиды CpG, предназначенные для применения здесь, могут быть одно- и двухцепочечными. Двухцепочечные молекулы более стабильны in vivo, тогда как одноцепочечные молекулы проявляют повышенную иммунную активность. Кроме того, фосфатный остов может быть модифицированным, например, модифицированным фосфородитиоатом, для повышения иммуностимулирующей активности молекулы CpG. Как описано в патенте США № 6207646, молекулы CpG с фосфоротиоатными остовами преимущественно активируют B-клетки, а молекулы, имеющие фосфодиэфирные остовы преимущественно активируют моноцитные (макрофаги, дендритные клетки и моноциты) и NK клетки.
Типичные CpG олигонуклеотиды для применения в настоящих композициях включают молекулы с последовательностью 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID NO:1) и 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO:5).
Молекулы ISS могут быть легко протестированы на их способность стимулировать иммунный ответ с помощью стандартных способов, хорошо известных в данной области техники. Например, способность молекулы стимулировать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ легко определяется с помощью описанных выше иммунологических анализов. Более того, антиген и субмикронные композиции масла в воде можно ввести с ISS и без них для определения того, повышается ли иммунный ответ.
Как объяснялось выше, ISS можно вводить либо до, либо одновременно, либо после доставки антигена и/или субмикронной эмульсии масла в воде. При введении перед иммунизацией антигеном и/или субмикронной эмульсией масла в воде, ISS можно вводить уже за 5-10 дней до иммунизации, предпочтительно за 3-5 дней до иммунизации и наиболее предпочтительно за 1-3 дня или 2 дня до иммунизации. При раздельном введении ISS могут быть доставлены в то же место, что и место доставки антигенных композиций, или в другое место доставки. Если желательна одновременная доставка, то ISS могут быть включены в антигенные композиции.
Обычно следует применять ISS от приблизительно 0,5 мкг до 5000 мкг ISS, более обычно от 0,5 мкг до приблизительно 1000, предпочтительно от 0,5 мкг до приблизительно 500 мкг или от 1 до приблизительно 100 мкг, предпочтительно от приблизительно 5 мкг до приблизительно 50 мкг, предпочтительно от 5 до приблизительно 30 или любое количество в указанных диапазонах ISS на дозу должно найти применение с настоящими способами.
III. Экспериментальная часть
Ниже приведены примеры конкретных осуществлений для реализации настоящего изобретения. Примеры предназначены лишь для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.
Были предприняты усилия для обеспечения точности примененных чисел (например, количеств, температур и т.д.), однако, безусловно, допустимы некоторая экспериментальная погрешность и отклонение.
Пример 1
Продукция E1E1 HCV
Комплекс E1E2 HCV для применения в настоящих вакцинных композициях получали в виде слитого белка следующим образом. В частности, экспрессионная плазмида для млекопитающих pMH-E1E2-809 (фигура 3) кодирует слитый белок E1E2, который включает аминокислоты 192-809 HCV-1 (смотри Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455). Последовательность молекулы E1E2809 показана здесь на фигурах 2A-2C.
Для экспрессии последовательности E1E2 HCV из pMH-E1E2-809 применяли клетки яичников китайского хомячка (CHO). В частности, использовали клетки CHO DG44. Данные клетки, описанные Uraub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77:4216-4220, были получены из клеток CHO K-1 и превращены в дефектные по дигидрофолатредуктазе (dhfr) посредством двойной делеции в гене dhfr.
Клетки CHO DG44 трансфицировали pMH-E1E2-809. Трансфицированные клетки выращивали на селективной среде, такой, что только клетки, экспрессирующие ген dhfr, могли расти (Sambrook et al., выше). Выделенные колонии CHO собирали (˜800 колоний) в отдельные лунки 96-луночного планшета. Из исходных 96-луночных планшетов были сделаны реплики для проведения экспериментов по экспрессии. Клетки планшет-реплик выращивали до образования клетками конфлуентного монослоя. Клетки фиксировали на стенках планшета и делали проницаемыми с помощью холодного метанола. Для зондирования фиксированных клеток применяли моноклональное антитело 3D5C3 против E1E2 и моноклональное антитело 3E5-1 против E2. После добавления антимышиного конъюгата HRP, а затем субстрата, определяли линии клеток с наибольшей экспрессией. Затем наиболее сильно экспрессирующие линии клеток размножали в 24-луночных кластерных планшетах. Тестирование экспрессии повторяли, и вновь наиболее сильно экспрессирующие линии клеток размножали в лунках большего объема. Это повторяли до тех пор, пока размноженные в 6-луночных планшетах клеточные линии с наибольшей экспрессией не размножали во флаконах для культуры ткани. На данном этапе количество клеток было достаточным для обеспечения точного определения количества и сбора клеток, и были проведены количественные анализы экспрессии. Для определения клеток с высокой экспрессией проводили ELISA (Spaete et al., Virol. (1992) 188:819-830) на клеточном экстракте.
Пример 2
Очистка HCV E1E2
После экспрессии клетки CHO лизировали, и продуцированный внутриклеточно E1E2809 очищали аффинной хроматографией на GNA-лектине (стадия GNA), затем колоночной хроматографией на гидроксиапатите (HAP) (стадия HAP), фильтрацией через мембрану DV50 (стадия DV50), ВЭ колоночной хроматографией на SP-сефарозе (стадия SP), фильтрацией через мембрану Q (стадия Q) и колоночной хроматографией на сефадексе G25 (стадия G25). По завершении каждой из стадий обработки пул продукта либо фильтровали через фильтр 0,2 мкм и хранили при 2-8°С, либо сразу обрабатывали посредством следующей стадии очистки. После завершения процесса очистки антиген фильтровали через фильтр 0,2 мкм и оставляли замороженным при -60°С или ниже до фильтрации для получения состава.
В частности, для лизиса клеток к клеткам CHO при 2-8°С добавляли два объема охлажденного буфера для лизиса (1% Тритон X-100 в 100 мМ Трис, pH 8, и 1 мМ ЭДТА). Смесь центрифугировали при 5000 об/мин в течение 45 мин при 2-8°С для удаления обломков. Супернатант собирали и фильтровали через предварительный фильтр Sartorias 0,65 мкм Sartopure (Sartorius), затем через предварительный фильтр Sartorias 0,65 мм Sartofine и затем через фильтр Sartorious 0,45 мкм Sartobran и фильтр 0,2 мкм Sartobran. Отфильтрованный лизат хранили на льду до нанесения на колонку GNA.
Колонку GNA-агарозы (1885 мл, 200 x 600, Vector Labs, Burlingame, CA) предварительно уравновешивали восемью объемами буфера для уравновешивания (25 мМ NaPO4, 1,0 М NaCl, 12% Тритон X-100, pH 6,8) перед нанесением. Лизат наносили на колонку со скоростью 31,4 мл/мин (6 см/час) в течение ночи. Колонку промывали 4 объемами колонки буфера для уравновешивания, затем промывали еще 5 объемами колонки 10 мМ NaPO4, 80 мМ NaCl, 0,1% Тритон X-100, pH 6,8. Продукт элюировали 1 М метил-α-D-маннопиранозидом (MMP), 10 мМ NaPO4, 80 мМ NaCl, 0,1% Тритон X-100, pH 6,8. Пик элюции, приблизительно 1 объем колонки, собирали, фильтровали через фильтр 0,2 мкм и хранили при -60°С или ниже для HAP-хроматографии.
HAP-хроматографию проводили при комнатной температуре. 1200-мл (100 x 150 мм) керамическую колонку типа I гидроксиапатита (BioRad) кондиционировали одним объемом колонки 0,4 М NaPO4, pH 6,8, затем уравновешивали не менее чем десятью объемами 10 мМ NaPO4, 80 мМ NaCl, 0,1% Тритон X-100, pH 6,8. Четыре партии пулов элюата GNA размораживали в водяной бане с циркуляцией при температуре не выше 30°С, фильтровали через фильтр 0,2 мкм и наносили на уравновешенную колонку со скоростью 131 мл/мин (100 см/час). После нанесения на колонку наносили буфер для уравновешивания HAP в качестве догоняющего буфера. Когда поглощение в УФ становилось выше фонового, собирали незадерживаемую фракцию. Сбор продукта прекращали, когда объединенный объем продукта достигал объема нанесения плюс 75% объема колонки. Незадерживаемый HAP пул далее обрабатывали фильтрацией на DV50 для снижения вирусов.
Фильтрацию на DV50 проводили при комнатной температуре. Раствор для нанесения на DV50 получали двукратным разбавлением пула HAP и доведением до 0,15% Тритон X-100, 1 мМ ЭДТА, pH 5,3. Разбавление и доведение достигались добавлением буфера для разведения 1 (3 мМ лимонная кислота, 2 мМ ЭДТА, 0,2% Тритон X-100) для доведения pH пула до 5,3 с последующим добавлением буфера для разведения 2 (2 мМ ЭДТА, 0,2% Тритон X-100, pH 5,3) для доведения конечного объема до 2-кратного по отношению к исходному объему пула HAP.
Разбавленный и доведенный пул HAP (раствор для нанесения на DV50) фильтровали через 10-дюймовый (25,2 см) мембранный картридж Pall Ultipor VF DV50 (Pall). Держатель фильтра соединяли с фильтровальным картриджем, предварительно увлажненным водой, и стерилизовали автоклавированием при 123°С в течение 60 минут с медленным выпуском пара перед применением. Фильтр затем предварительно увлажняли буфером для уравновешивания SP (10 мМ цитрат натрия, 1 мМ ЭДТА, 0,15% Тритон X-100, pH 5,3) и осушали перед нанесением раствора для нанесения на DV50 при давлении не более 45 фунт/кв.дюйм (310 кПа). Затем наносили раствор для нанесения на DV50 со скоростью тока приблизительно 800 мл/мин при трансмембранном давлении приблизительно 30 фунт/кв.дюйм (207 кПа). Фильтрат собирали и хранили при 2-8°С в течение ночи и применяли на стадии SP.
SP-хроматографию проводили при комнатной температуре. 88-мл (50 x 45 мм) ВЭ колонку SP-сефарозы (Pharmacia, Peapack, NJ) уравновешивали 15 объемами колонки уравновешивающего буфера (10 мМ цитрат натрия, 1 мМ ЭДТА, 0,15% Тритон X-100, pH 5,3). На колонку наносили фильтрат DV50. Колонку промывали сначала 5 объемами колонки уравновешивающего буфера и затем 20 объемами колонки промывающего буфера, содержащего 10 мМ цитрат натрия, 15 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1% Tween-80TM, pH 6,0). Продукт элюировали с колонки 10 мМ цитратом натрия, 180 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1% Tween-80TM, pH 6,0. В качестве пула продукта собирали весь пик поглощения при 280 нм. Продукт хранили при 2-8°С в течение ночи и применяли на стадии фильтрации через Q-мембрану.
Стадию фильтрации через Q-мембрану проводили при комнатной температуре. Последовательно соединяли две стерилизованные дисковые мембраны Sartorious Q100X. Мембраны уравновешивали не менее чем 300 мл буфера для уравновешивания Q (10 мМ цитрат натрия, 180 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1% Tween-80TM, pH 6,0). Через уравновешенные мембраны Q фильтровали весь пул элюата SP при скорости тока 30-100 мл/мин и затем быстро промывали 40 мл буфера для уравновешивания Q. Фильтрат и промыв собирали и объединяли в качестве пула продукта и использовали на стадии G25.
Стадию G25 проводили при комнатной температуре. 1115-мл (100 x 142 мм) колонку сефадекса G-25 Pharmacia (Pharmacia, Peapack, NJ) уравновешивали не менее чем пятью объемами буфера для составления (10 мМ цитрат натрия, 270 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1% Tween-80TM, pH 6,0). На колонку наносили пул фильтрата Q, и незадержанные на колонке фракции собирали, фильтровали через фильтр 0,22 мкм (Millipore)и хранили замороженными при -60°С или ниже до применения.
Пример 3
Иммуногенность вакцинных композиций E1E2 HCV у мышей
Иммуногенность E1E2809 HCV, продуцированного и очищенного, как описано выше, в сочетании с субмикронной эмульсией масла в воде и/или олигонуклеотидом CpG определяли следующим образом.
Составы, примененные в данном исследовании, суммированы в таблице 1. MF59, субмикронную эмульсию масла в воде, которая содержит 4-5% мас./об. сквалена, 0,5% мас./об. Tween-80TM, 0,5% мас./об. Span 85TM, получали, как описано ранее. Смотри Международную публикацию № WO 90/14837; патент США № 6299884; и Ott et al., "MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines" in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell, M.F. and Newman, M.J. eds.) Plenum Press, New York, 1995, pp. 277-296. Для групп 4 и 9 применяли четырехкратное количество MF59. Примененной в данном исследовании MF59 была MF59-0, и она не содержала MTP-PE.
Составы, примененные в группах 1, 3, 6 и 8, также включали 25 мкг активной молекулы CpG на дозу. Последовательность активной молекулы CpG была: 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID NO:1).
Составы, примененные в группе 5, включали 25 мкг неактивной контрольной молекулы CpG на дозу. Последовательность неактивной молекулы CpG была: 5'- TCCAGGACTTCTCTCAGGTT-3' (SEQ ID NO:2).
Составы, примененные для групп 1-4, включали 2,8 мкг на дозу антигена E1E2809 HCV, продуцированного, как описанного выше.
Составы, примененные для групп 5-9, включали 2,0 мкг на дозу E2715 HCV, укороченного белка E2, продуцированного в клетках CHO, как описано в патенте США № 612020.
Мыши линии Balb/C в возрасте 6 недель были разделены на 9 групп (по 10 мышей на группу), и им вводили внутримышечно 50 мкл вакцинной композиции с компонентами, указанными в таблице 1. Мышам вводили бустерные инъекции на 30 и 90 дни после исходной инъекции. Сыворотку собирали через 14 дней после последней инъекции, и титры антител против E1E2 и E2 определяли с помощью ферментного иммуноанализа. Смотри Chien et al., Lancet (1993) 342:933.
Результаты показаны в таблице 1 и на фигуре 4. Как можно видеть, мыши, иммунизированные E1E2 HCV с применением в качестве адъюванта CpG, сочетанным с MF59, давали значительно более высокие (P<0,05) уровни антител против E1E2 по сравнению с мышами, иммунизированными E1E2 с применением в качестве адъювантов только MF59 или только 4x MF59. Один CpG вызывал более высокую продукцию антител по сравнению с уровнем антител при применении одного MF59, хотя разница не была значимой. Напротив, мыши, иммунизированные E2715 с применением MF59 и/или CpG, продуцировали очень низкий уровень антител, составлявший менее 50% от уровня у отвечающих мышей. Это удивительно, поскольку в предшествующих экспериментах E2715 вызывал высокий уровень антител у мышей, причем ответ наблюдался у всех тестированных мышей.
Иммуногенность HCV E1E2809 и E2715 при применении CPG и/или MF59 в качестве адъювантов. Числа в скобках обозначают количество животных, продуцирующих антитела, по отношению к числу иммунизированных животных.
CpG
MF59
CpG+MF59
4X MF59
Контрольный CpG
CpG
MF59
CpG+MF59
4xMF59
Пример 4
Иммуногенность вакцинных композиций HCV E1E2 у шимпанзе
Иммуногенность E1E2809 HCV, продуцированного и очищенного, как описано выше, в сочетании с субмикронной эмульсией масла в воде и/или олигонуклеотидом CpG определяли следующим образом.
Составы, примененные в данном исследовании, суммированы в таблице 2. MF59 и E1E2809 описаны выше. Последовательность примененной молекулы CpG была следующей: 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO:5).
Шимпанзе были разделены на 2 группы (по 5 животных на группу), и им вводили внутримышечно вакцинную композицию с компонентами, указанными в таблице 1. В частности, одну группу животных иммунизировали на 0, 1 и 6 месяцы 20 мкг E1E2809 и MF59. Вторую группу животных также иммунизировали на 0, 1 и 6 месяцы 20 мкг E1E2809 и MF59, а также 500 мкг CpG.
Образцы сыворотки получали через 14 дней после последней иммунизации, и титры антител против E1E2 определяли с помощью иммуноферментного анализа. В частности, антигеном E1E2 покрывали полистироловые планшеты для микротитрования, и связанное антитело определяли с помощью конъюгированного с HRP антителом против человека с последующим проявлением с помощью тетраметилбензидинового субстрата.
Как можно видеть в таблице 2, шимпанзе, иммунизированные HCV E1E2 с применением CpG в сочетании с MF59 в качестве адъюванта, продуцировали значительно более высокие (P<0,05) уровни антител против E1E1 по сравнению с животными, иммунизированными E1E1 с применением только MF59.
Иммуногенность E1E2809 HCV при применении CPG и MF59 в качестве адъювантов.
E1E2809;
CpG
E1E2809;
CpG+MF59
Соответственно раскрыты новые вакцинные композиции HCV и способы их использования. Исходя из представляемых материалов будет ясно, что хотя предпочтительные осуществления раскрыты в деталях, другие варианты осуществления могут быть выполнены в рамках сути и объема притязаний изобретения, определенных в прилагаемой формуле изобретения.
Изобретение относится к области вирусологии и медицины. Композиция включает антиген Е1/Е2 вируса гепатита С (HCV), субмикронную эмульсию масла в воде и иммуностимулирующую последовательность нуклеиновой кислоты (ISS) или олигонуклеотид CpG. Композиция увеличивает иммунный ответ организма на вводимый антиген. Также предложены способы стимуляции иммунного ответа у субъекта с использованием таких композиций. Изобретение может быть использовано в медицине. 11 н. и 29 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл.
(a) антиген Е1Е2 вируса гепатита С (HCV), включающий аминокислотную последовательность с, по меньшей мере, 80%-ной идентичностью с непрерывной аминокислотной последовательностью, представленной в положениях 192-809 фигур 2А-2С;
(b) субмикронную эмульсию масла в воде, включающую эмульгирующий агент, который не является N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламином (МТР-РЕ), и где субмикронная эмульсия масла в воде способна увеличивать иммунный ответ на антиген Е1Е2 HCV; и
(c) иммуностимулирующую последовательность нуклеиновой кислоты (ISS).
(i) метаболизируемое масло, где масло присутствует в количестве от 0,5 до 20% от суммарного объема; и
(ii) эмульгирующий агент, где эмульгирующий агент присутствует в количестве от 0,01 до 2,5% по массе (мас./об.) и где масло и эмульгирующий агент представлены в форме эмульсии масла в воде, содержащей капельки масла, по существу все из которых имеют диаметр от приблизительно 100 нм до менее 1 микрона.
(a) антиген Е1Е2 вируса гепатита С (HCV), включающий аминокислотную последовательность с, по меньшей мере, 80%-ной идентичностью с непрерывной аминокислотной последовательностью, представленной в положениях 192-809 фигур 2А-2С;
(b) субмикронную эмульсию масла в воде, способную увеличивать иммунный ответ на антиген Е1Е2 HCV, где субмикронная эмульсия масла в воде включает
(i) метаболизируемое масло, где масло присутствует в количестве от 1 до 12% от суммарного объема, и
(ii) эмульгирующий агент, где эмульгирующий агент присутствует в количестве от 0,01 до 1% по массе (мас./об.) и включает моно-, ди- или триэфир полиоксиэтиленсорбитана и/или моно-, ди- или триэфир сорбитана, где масло и эмульгирующий агент представлены в форме эмульсии масла в воде, содержащей капельки масла, по существу все из которых имеют диаметр от приблизительно 100 нм до менее 1 микрона; и
(c) олигонуклеотид CpG, где олигонуклеотид CpG включает последовательность GACGTT, CACGTC, GTCGTT или GTCGCT.
(а) антиген Е1Е2 вируса гепатита С (HCV), включающий аминокислотную последовательность, представленную в положениях 192-809 фигур 2А-2С;
(b) субмикронную эмульсию масла в воде, способную увеличивать иммунный ответ на антиген Е1Е2 HCV, где субмикронная эмульсия масла в воде включает 4-5% мас./об. сквалена, 0,25-1,0% мас./об. моноолеата полиоксиэтиленсорбитана и/или 0,25-1,0% триолеата сорбитана и, необязательно, N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (МТР-РЕ), где масло и эмульгирующий агент представлены в форме эмульсии масла в воде, содержащей капельки масла, по существу все из которых имеют диаметр от приблизительно 100 нм до менее 1 микрона; и
(c) олигонуклеотид CpG, где олигонуклеотид CpG включает последовательность 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID NO:1) или последовательность 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO:5).
(a) антиген Е1Е2 вируса гепатита С (HCV), включающий аминокислотную последовательность с, по меньшей мере, 80%-ной идентичностью с непрерывной аминокислотной последовательностью, представленной в положениях 192-809 фигур 2А-2С;
(b) субмикронную эмульсию масла в воде, способную увеличивать иммунный ответ на антиген Е1Е2 HCV, где субмикронная эмульсия масла в воде включает
(i) метаболизируемое масло, где масло присутствует в количестве от 1 до 12% от суммарного объема, и
(ii) эмульгирующий агент, где эмульгирующий агент присутствует в количестве от 0,01 до 1% по массе (мас./об.) и включает моно-, ди- или триэфир полиоксиэтиленсорбитана и/или моно-, ди- или триэфир сорбитана, где масло и эмульгирующий агент представлены в форме эмульсии масла в воде, содержащей капельки масла, по существу все из которых имеют диаметр от приблизительно 100 нм до менее 1 микрона; и
(с) олигонуклеотид CpG, где олигонуклеотид CpG включает последовательность GACGTT, GACGTC, GTCGTT или GTCGCT.
(a) антиген Е1Е2 вируса гепатита С (HCV), включающий аминокислотную последовательность, представленную в положениях 192-809 фигур 2А-2С;
(b) субмикронную эмульсию масла в воде, способную увеличивать иммунный ответ на антиген Е1Е2 HCV, где субмикронная эмульсия масла в воде включает 4-5% мас./об. сквалена, 0,25-1,0% мас./об. моноолеата полиоксиэтиленсорбитана и/или 0,25-1,0% триолеата сорбитана и, необязательно, N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (МТР-РЕ), где масло и эмульгирующий агент представлены в форме эмульсии масла в воде, содержащей капельки масла, по существу, все из которых имеют диаметр от приблизительно 100 нм до менее 1 микрона; и
(c) олигонуклеотид CpG, где олигонуклеотид CpG включает последовательность 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3' (SEQ ID NO:1) или последовательность 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (SEQ ID NO:5).
| ИММУНОГЕННАЯ ПОЛИПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ, СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ И СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ, НАБОР | 1992 |
|
RU2136311C1 |
| US 6218371, 17.04.2001. | |||
