СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНОЗИНА И 5'-ИНОЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ МЕТОДОМ ФЕРМЕНТАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ, ПРИНАДЛЕЖАЩИХ К РОДУ Escherichia Российский патент 2006 года по МПК C12N1/21 C12P19/30 C12P19/38 C12R1/19 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу получения инозина, являющегося важным исходньм реагентом для синтеза 5'-инозиновой кислоты (инозин-5'-фосфата), и к новому микроорганизму, используемому для его продукции.

Предшествующий уровень техники

Традиционно нуклеозиды получают в промышленном масштабе методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, ауксотрофных по аденину, или этих штаммов, которым дополнительно придана устойчивость к различньм соединениям, таким как аналоги пуринов и сульфагуанидин, при этом указанные штаммы принадлежат к роду Bacillus (патентные заявки Японии №54-17033 (1979), 55-2956 (1980) и 55-45199 (1980), выложенная патентная заявка Японии 56-162998 (1981), патентные заявки Японии №57-14160 (1982) и 57-41915 (1982), выложенная патентная заявка Японии №59-42895 (1984), к роду Brevibacterium (патентные заявки Японии №51-5075 (1976) и 58-17592 (1983), и Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)), к роду Escherichia (заявка РСТ W09903988) и подобные им.

Получение указанных мутантных штаммов обычно состоит из обработки микроорганизмов с целью получения мутаций, такой как облучение УФ-излучением или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), с последующей селекцией нужного штамма на подходящей селективной питательной среде. С другой стороны, также практикуется выращивание мутантных штаммов, принадлежащих к роду Bacillus (выложенные патентные заявки Японии №58-158197 (1983), 58-175493 (1983), 59-28470 (1984), 60-156388 (1985), 1-27477 (1989), 1-174385 (1989), 3-58787 (1991), 3-164185 (1991), 5-84067 (1993), и 5-192164(1993)) к роду Brevibacterium (выложенная патентная заявка Японии 63-248394 (1988)), и к роду Escherichia (заявка РСТ W09903988), полученных с использованием методов генной инженерии.

Продуктивность штаммов - продуцентов инозина далее может быть улучшена путем увеличения способности к экскреции инозина. В настоящее время общепризнано, что проникновение метаболитов через цитоплазматическую мембрану обычно происходит с участием более или менее специфических транспортных белков, осуществляющих их выброс (Рао, S.S. et al, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62 (1), 1-34, (1998); Paulsen I.T. et al, J. Mol. Biol., 277, 573-592, (1998); Saier M.H. et al, J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 1,257-279, (1999)). Ранее авторы настоящего изобретения показали, что штаммы - продуценты инозина или ксантозина, принадлежащие к роду Escherichia и к роду Bacillus и обладающие повышенной активностью белка RhtA, кодируемого геном rhtA (ybiF), повышеной активностью белка YijE, кодируемого геном yijE или повышенной активностью белка YdeD, кодируемого геном ydeD, продуцировали больше инозина или ксантозина, чем родительские штаммы (патентные заявки РФ №2002101666, 2002104463 и 2002104464 соответственно).

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности инозина штаммами - продуцентами инозина, и предоставление способа получения инозина и 5'-инозиновой кислоты с использованием указанных штаммов.

Данная цель была достигнута путем установления того факта, что ген yicM, предположительно кодирующий мембранный белок, придает устойчивость к аналогу пуриновых оснований, 6-меркаптопурину и к пуриновым нуклеозидам, таким как инозин и гуанозин, в случае, когда природный аллель указанного гена введен в клетки штамма на многокопийной плазмиде. Белок YicM, кодируемый геном yicM, не вовлечен в путь биосинтеза пуриновых нуклеотидов и принадлежит к надсемейству транспортных белков (Рао, S.S. et al, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62 (1), 1-34, (1998)). Более того, ген yicM может увеличивать продукцию нуклеозидов в случае, когда его дополнительные копии введены в клетки соответствующих продуцентов инозина, принадлежащих к роду Escherichia. Таким образом было совершено настоящее изобретение.

Таким образом, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм, принадлежащий к роду Escherichia, обладающий способностью к продукции инозина.

В частности, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм с повышенной способностью к продукции инозина, основанной на повышении активности белка, вовлеченного, как предполагается, в транспорт пуриновых нуклеозидов из клетки указанного микроорганизма. Более конкретно, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм с повышенной способностью к продукции инозина, основанной на повышении экспрессии гена, кодирующего белок, вовлеченный в процесс экскреции пуриновых нуклеозидов.

Далее настоящее изобретение предоставляет способ получения пуринового нуклеозида методом ферментации, включающим стадии выращивания указанного выше микроорганизма в питательной среде с целью продукции и накопления пуринового нуклеозида в питательной среде, и выделения пуринового нуклеозида из культуральной жидкости.

Далее настоящее изобретение предоставляет способ получения 5'-инозиновой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного инозина, и выделения полученной и накопленной 5'-инозиновой кислоты.

Настоящее изобретение включает в себя следующее:

1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, обладающая способностью к продукции инозина, в которой активность белка YicM повышена.

2. Бактерия, в соответствии с п.1, в которой активность белка, описанного в пунктах (А) или (В), в клетке упомянутой бактерии повышена:

(A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2;

(B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью, придающей бактерии повышенную устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину.(здесь и далее белки, описанные в пунктах (А) и (В), упоминаются как «белки согласно настоящему изобретению»).

3. Бактерия в соответствии с п.2, в которой активности белков, описанных в пунктах (А) или (В), повышены путем трансформации бактерии с помощью ДНК, кодирующей белки, описанные в пунктах (А) или (В), или путем изменения регуляции экспрессии указанной ДНК в хромосоме упомянутой бактерии.

4. Бактерия в соответствии с п.3, в которой трансформация осуществляется с использованием многокопийного вектора.

5. Способ получения инозина, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с любым из пунктов 1-4 в питательной среде и выделения из культуральной жидкости полученного и накопленного в ней инозина.

6. Способ в соответствии с п.5, в котором бактерия обладает повышенной экспрессией генов биосинтеза пуриновых нуклеозидов.

7. Способ получения 5'-инозиновой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с любым из п.п. с 1 по 4 в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного инозина.

8. Способ в соответствии с п.7, в котором бактерия модифицирована с целью повышения экспрессии генов биосинтеза пуриновых нуклеозидов.

Настоящее изобретение более детально будет описано ниже.

1. Бактерия согласно настоящему изобретению.

Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, обладающая способностью к продукции инозина, в которой активность белка, описанного в пунктах (А) или (В), в клетке упомянутой бактерии повышена: (А) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2;

(В) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью, придающей бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E.coli).

Использованный здесь термин «способность к продукции инозина» означает способность к продукции и накоплению инозина в питательной среде. Термин «бактерия, принадлежащая к роду к роду Escherichia и обладающая способностью к продукции инозина» означает то, что бактерия, принадлежащая к роду к роду Escherichia, обладает способностью к продукции и накоплению в питательной среде инозина в количестве большем, чем природный штамм E.coli, такие как штаммы E.coli W3110 и MG1655, и предпочтительно означает, что микроорганизм способен к продукции и накоплению в питательной среде количество не менее чем 10 мг/л, более предпочтительно, не менее чем 50 мг/л инозина.

Термин «активность белка, описанного в пунктах (А) или (В), в клетке упомянутой бактерии повышена» означает, что количество молекул указанного белка в клетке повышено, или сама активность в пересчете на белок повышена. Термин «активность» означает активность, придающую бактерии устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину.

К белкам согласно настоящему изобретению относятся белки, описанные в следующих пунктах (А) или (В):

(A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2;

(B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину.

Белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2, является белком YicM. Белок YicM не вовлечен в путь биосинтеза пуриновых нуклеотидов и принадлежит к большому надсемейству транспортных белков MFS (MFS - major facilitator superfamily) (Pao, S.S., et al, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (I): 1-32, (1998)) и к кластеру ортологов пермеаз экспорта арабинозы (COG - cluster of orthologous group) 2814 (Tatusov, R.L. et al, Nucleic Acids Res., 29: 22-28 (2001)). Другими белками, принадлежащими к этому семейству в Е. coli, являются белки AraJ and YdeA, осуществляющие транспорт арабинозы из клетки (Bost, S. et al, J. Bacteriol., 181:2185-2191 (1999)), и белок YdhP. Геном Bacillus subtilis содержит 6 генов, кодирующих гомологи гена yicM: ybcL, yceJ, ydhL, yftil, ytbD, ywfA. Белок YicM из штамма Е. coli К-12 является высокогидрофобным белком, состоящим из 396 аминокислот, содержащим 12 предполагаемых трансмембранных сегментов и обладающим неизвестной функцией. Белок YicM кодируется геном yicM. Ген yicM из штамма Е. coli К-12 (нуклеотиды с 3838176 по 3839366 в последовательности с инвентарным номером NC_000913; gi: 16127994 в базе данных GenBank) расположен в хромосоме Е. coli между генами nlpA и yicN на 82.73'.

Количество «нескольких» аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Оно может быть от 2 до 35, предпочтительно от 2 до 15, и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (А).

Может быть использован белок, имеющий гомологию не менее чем 90%, предпочтительно не менее, чем 95%, более предпочтительно, не менее чем 98%, с аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2, и обладающий активностью белка YicM.

Для оценки степени гомологии между ДНК возможно использование нескольких способов расчета, таких как BLAST search, FASTA search и CrustalW.

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) это самообучающийся алгоритм поиска, используемый программами BLASTP, BLASTN, BLASTX, MEGABLAST, TBLASTN, и TBLASTX; эти программы оценивают значимость найденных результатов с использованием статистических методов Karlin, Samuel и Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-7). Способ поиска FASTA описан W.R. Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990 183:63-98). Способ ClustalW описан Thompson J.D., Higgins D.G. и Gibson T.J. ("CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-4680).

Термин «повышенная устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину» означает способность бактерии к росту на минимальной питательной среде, содержащей 6-меркаптопурин, инозин и гуанозин в концентрации, при которой природный или родительский штамм не может расти, или способность бактерии расти на питательной среде, содержащей 6-меркаптопурин, инозин и гуанозин, с большей скоростью, чем природный или родительский штамм. Упомянутая выше концентрация 6-меркаптопурина, инозина и гуанозина составляет обычно от 50 до 10000 мкг/мл, предпочтительно от 100 до 1000 мкг/мл.

Методы увеличения активности белка согласно настоящему изобретению, в особенности методы увеличения количества молекул указанного белка в клетке, включают методы изменения последовательности, регулирующей экспрессию ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, и методы увеличения числа копий гена, но не ограничиваются ими.

Изменение последовательности, регулирующей экспрессию ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, может быть достигнуто путем помещения ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, под контроль сильного промотора. В качестве сильных промоторов известны, например lac промотор, trp промотор, trc промотор, P_L промотор фага лямбда. С другой стороны, промотор может быть усилен, например, путем введения мутации в указанный промотор с целью увеличения уровня транскрипции гена, расположенного после промотора. Далее, известно, что замена нескольких нуклеотидов в участке между местом связывания рибосомы (RBS) и старт кодоном, а в особенности, в последовательности непосредственно перед старт кодоном, в значительной степени влияет на уровень трансляции мРНК. Например, было обнаружено 20-кратное изменение уровня экспрессии в зависимости от природы трех нуклеотидов, предшествующих старт кодону (Gold et al., Annu. Rev. MicrobioL, 35, 365-403,1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629,1984).

Более того, некий «энхансер» может быть дополнительно введен с целью увеличения уровня транскрипции указанного гена. Введение ДНК, содержащей либо ген, либо промотор в хромосомную ДНК описано, например, в выложенной патентной заявке Японии №1-215280 (1989).

В качестве альтернативы, число копий гена может быть увеличено путем введения гена в многокопийный вектор с образованием рекомбинантной ДНК, с последующим введением такой рекомбинантной ДНК в микроорганизм. Примерами векторов, использующихся для введения рекомбинантной ДНК, являются плазмидные векторы, такие как pMW118, pBR322, pUC19, pBluescript KS⁺ pACYC177, pACYC184, pOK12, pAYC32, pMW119, pET22b и подобные им, фаговые векторы, такие как 11059, 1BF101, M13mp9, фаг Mu (выложенная патентная заявка Японии №2-109985) и подобные им, и транспозоны (Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/TechnoL, 1,417 (1983)), такие как Mu, Tn10, Tn5 и подобные им. Кроме того, усиление экспрессии гена может быть достигнуто путем интеграции гена в бактериальную хромосому методом гомологичной рекомбинации или подобным.

Методы использования сильного промотора или «энхансера» могут быть скомбинированы с методами увеличения числа копий гена.

Методами получения хромосомной ДНК, гибридизации, полимеразной цепной реакции (ПЦР), получения плазмидной ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве затравок и подобными методами могут являться традиционные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны в книге Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) и других подобных изданиях.

Для выведения микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, и обладающего повышенной экспрессией гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, необходимые участки генов могут быть получены с помощью ПЦР на основе уже доступной информации о генах Е. coli. Например, ген yicM, который, как предполагается, кодирует транспортер, может быть клонирован из хромосомной ДНК штаммов Е. coli К 12 W3110 и Е. coli MG1655 с использованием метода ПЦР. Хромосомная ДНК, используемая для этого, также может быть получена из любого другого штамма Е. coli.

К белкам согласно настоящему изобретению относятся мутанты и варианты белка YicM, которые могут существовать вследствие природного разнообразия, при условии, что указанные мутанты и варианты демонстрируют функциональные свойства белка YicM, по крайней мере устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину. ДНК, кодирующая указанные мутанты и варианты, может быть получена путем выделения ДНК, которая гибридизуется с геном yicM(SEQ ID NO: 1) или частью указанного гена в жестких условиях, и которая кодирует белок, увеличивающий продукцию пуриновых нуклеотидов. Термин «жесткие условия», упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические не образуются. Например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру, ДНК, обладающие гомологией не менее 70% друг относительно друга. В качестве варианта примером жестких условий являются условия соответствующие условиям, отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 60°С, 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS. В качестве зонда для ДНК, кодирующей варианты и гибридизующейся с геном YicM, также может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером 1. Зонд подобного рода может быть получен в результате ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером 1, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером 1, в качестве матрицы. В случае, когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50°С, 2×SSC и 0.1% SDS.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции инозина. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции инозина.

В качестве родительского штамма - продуцентов инозина, в которым активности белков согласно настоящему изобретению будут повышены, может быть использован штамм Е.coli FADRaddedd (pMWKQAp). Указанный штамм является производным от известного штамма W3110, содержащего мутации, введенные в ген purF, кодирующий PRPP амидотрансферазу, ген purR, кодирующий репрессор биосинтеза пуринов, ген deoD, кодирующий фосфорилазу пуриновых нуклеозидов, ген ригА, кодирующий сукцинил-АМР-синтазу, ген add, кодирующий аденозиндеаминазу, ген edd, кодирующий 6-фосфоглюконатдегидразу (WO 9903988), а также содержащего плазмиду pMWKQAp - производную от вектора pMWKQ, в которой находятся гены pur FKQ, кодирующие PRPP амидотрансферазу, нечувствительную к гуанозин монофосфату (GMP) (WO 9903988). Для получения плазмиды pMWKQAp, ген bla был вырезан из плазмиды pUC21 по сайту рестрикции PagI и клонирован в сайт NcoI плазмиды pUK21. Из полученной плазмиды ген bla был вырезан с помощью рестриктаз Bsu151 и SmaI и клонирован в плазмиду pMWKQ по сайтам рестрикции Bsu151-SmaI. Полученная плазмида pMWKQAp сообщала клеткам устойчивость к ампициллину.

Чтобы увеличить саму активность в пересчете на белок согласно настоящему изобретению, также возможно ввести мутацию в структурную часть гена, кодирующего белок, чтобы увеличить активность белка. Для того, чтобы ввести мутацию в ген, могут быть использованы сайт-специфический мутагенез (Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)), методы рекомбинантной ПЦР (PCR Technology, Stockton Press (1989)), химический синтез специфических участков ДНК, обработка нужного гена с помощью гидроксиламина, обработка микробных штаммов, содержащей нужный ген, с помощью УФ-излучения или химического реагента, такого как нитрозогуанидин или азотистая кислота, или подобным методом. Микроорганизм, в котором активность указанного белка повышена, может быть отобран как штамм, растущий на минимальной среде, содержащей 6-меркаптопурин, инозин и гуанозин в концентрациях, указанных в Таблице 1 (смотри ниже).

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть в дальнейшем улучшена за счет увеличения экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез пуринов. Примерами таких генов являются гены риr регулона из Е. coli (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996). Описан штаммом Е. coli продуцент инозина, содержащий мутантный ген purF, кодирующий PRPP амидотрансферазу, нечувствительную к ингибированию GMP и АМР по типу обратной связи, инактивированный ген purR, кодирующий репрессор биосинтеза пуринов (WO 9903988).

Механизмом, увеличивающим продукцию пуриновых нуклеозидов бактерией путем увеличения активности белков согласно настоящему изобретению, является, как можно предположить, повышенная экскреция целевого пуринового нуклеозида из клетки бактерии.

2. Способ получения инозина.

К способам согласно настоящему изобретению относится способ получения инозина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления инозина в питательной среде, и выделения инозина из культуральной жидкости.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка пуринового нуклеозида из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых пуриновый нуклеозид продуцируется с использованием микроорганизма. Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, неорганические ионы и другие необходимые органические компоненты. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза, лактоза, сахароза, галактоза, фруктоза, арабиноза, мальтоза, ксилоза, трегалоза, рибоза и гидролизат крахмала; спирты, такие как глицерин, маннитол и сорбитол; различные органические кислоты, такие как глюконовая кислота, фумаровая кислота, лимонная кислота и янтарная кислота и подобные им.

В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония, органические источники азота, такие как гидролизат соевых бобов; газообразный аммиак, раствор аммония и подобные соединения. Желательно, чтобы подходящие небольшие количества витаминов, таких как витамин B₁, и других необходимых веществ, например нуклеиновых кислот, таких как аденин и РНК, или дрожжевой экстракт и подобные соединения присутствовали в питательной среде в качестве органических питательных компонент. Кроме того, небольшие количества фосфата кальция, сульфата магния, ионов железа, ионов марганца и подобных соединений могут быть добавлены, если необходимо.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях в течение 16-72 часов, температуре при выращивании поддерживается в пределах от 30 до 45°С и рН в пределах от 5 до 8. рН среды может регулироваться неорганическими или органическими кислотными или щелочными веществами, а также газообразным аммиаком.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем целевой пуриновый нуклеозид может быть выделен из культуральной жидкости любым из традиционных методов или любой комбинацией этих методов, таким как ионообменная хроматография и осаждение.

3. Способ получения 5'-инозиновой кислоты.

К способам согласно настоящему изобретению также относится способ получения 5'-инозиновой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного инозина, и выделения полученной и накопленной 5'-инозиновой кислоты.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка инозина из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых инозин продуцируется с использованием микроорганизма. Далее, согласно настоящему изобретению фосфорилирование полученного и накопленного инозина, а также выделение полученной и накопленной 5'-инозиновой кислоты может быть осуществлено методом, подобным традиционным методам, в которых пуриновые нуклеотиды, такие как 5'-инозиновая кислота, получается из пуринового нуклеозида, такого как инозин.

Фосфорилирование пуринового нуклеозида может быть осуществлено ферментативно с использованием различных фосфатаз, нуклеозидкиназ и нуклеозидфосфотрансфераз, или химически с использованием фосфорилирующих агентов, таких как POCl₃ или подобным им. Могут быть использованы фосфатаза, способная к катализу селективного переноса фосфорильной группы пирофосфата в 5'-положение нуклеозида (Mihara et. al, Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganii. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66:2811-2816), или кислая фосфатаза, использующая полифосфорные кислоты (их соли), фенилфосфорную кислоту (ее соли) или карбамилфосфорную кислоту (ее соли) в качестве донора фосфорной кислоты (W09637603 A1), или подобные им. Также, в качестве примера фосфатазы может быть приведена фосфатаза, способная к каталитическому переносу фосфорильной группы в 2', 3', 5'-положение нуклеозида с использованием в качестве субстрата п-нитрофенилфосфата (Mitsugi, К., et al, Agric. Biol. Chem. 1964, 28, 586-600), неорганического фосфата (JP42-1186), или ацетил фосфата (JP61-41555), или подобная ей. В качестве примера нуклеозидкиназы может быть приведена гуанозин-инозинкиназа из Е. coli (Mori et. al. Cloning of a guanosineinosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 1995. 177:4921-4926; W09108286), или подобная ей. В качестве примера нуклеозидфосфотрансферазы может быть приведена нуклеозидфосфотрансфераза, описанная Hammer-Jespersen, К. (Nucleoside catabolism, p.203-258. In A Munch-Petesen (ed.), Metabolism ofnucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press, New York), или подобная ей. Химическое фосфорилирование нуклеозидов может быть осуществлено с использованием фосфорилирующего агента, такого как РОС1з (Yoshikawa et. al. Studies ofphosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1969,42:3505-3508), или подобного ему.

Подписи к чертежам

Фиг.1. Схема хромосомного фрагмента ДНК, содержащегося в фазмиде рМР1, который придавал клеткам устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину.

На Фиг.2 показана структура плазмиды pYlCM1.

На Фиг.3 показана последовательность хромосомной ДНК из штамма Е.coli К-12, располагающаяся на хромосоме указанного штамма перед геном yicM (также представлена в списке последовательностей как последовательность под номером 5). Альтернативный старт-кодон обозначен жирным шрифтом. Предполагаемый сайт связывания рибосомы подчеркнут.

Наилучший способ осуществления изобретения

Пример 1. Клонирование генов, которые придают устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину из Е.coli в фазмиду mini-Mu.

Гены из E.coli, которые обуславливают устойчивость к аналогам пуриновых оснований, были изначально клонированы in vivo с использованием фазмиды mini-Mu d5005 (Groisman, E.A., et al., J. Bacteriol., 168, 357-364 (1986)). Штамм MG1655, лизогенный по фагу MuCts62, был использован в качестве донора. Свежеприготовленные лизаты были использованы для инфицирования лизогенного по фагу MuCts производного этого штамма. Полученные клетки высевались на минимальную среду М9 с глюкозой, содержащую канамицин (40 мкг/мл) и 6-меркаптопурин (200 мг/мл). Были отобраны колонии, появившиеся после 48-72 часов культивирования, из колоний была выделена плазмидная ДНК и использована для трансформации штамма MG1655 и TG1 deoD gsk3 стандартными методами. Трансформанты были отобраны на чашках с агаризованным L-бульоном, содержащим канамицин, как указано выше. Штамм TG1 deoD gsk3 - это родительский штамм, специально сконструированный для проверки степени устойчивости к инозину и гуанозину. Указанный штамм был получен путем последовательного переноса мутаций в генах deoD и gsk3 трансдукцией фагом Р1 в известный штамм TG1, обладающий устойчивостью к инозину и гуанозину, благодаря способности к деградации пуринов. Штамм TG1 deoD gsk3 не способен деградировать инозин и гуанозин, благодаря мутации deoD (W09903988) и чувствителен к нуклеозидам благодаря мутации gsk3 (Petersen С. J. Biol. Chem., 274, 5348-5356, 1999.).Из трансформантов, устойчивых к 200 мкг/мл 6-меркаптопурина, 1 мг/мл инозина и 30 мкг/мл гуанозина, была выделена плазмидная ДНК. Нуклеотидная последовательность концов хромосомных ДНК вставок определялась с использованием затравок, приведенных в Списке последовательностей под номерами 3 и 4 (SEQ ID NO:3 и 4), соответственно для левого и правого участков присоединения фага Mu. Полная нуклеотидная последовательность генома штамма Е. coli K-12 определена (Science, 277,1453-1474, 1997). Поэтому полученные данные о нуклеотидной последовательности были сравнены с информацией из GenBank, и таким образом были идентифицированы клонированные фрагменты.

Оказалось, что были клонированы несколько типов вставок, принадлежащих к различным участкам хромосомы. Одна из них, 6-МР1, являющаяся хромосомной вставкой (11970 т.п.о.) в фазмиду рМР1, показана на Фиг.1.

Пример 2. Идентификация гена vicM, придающего устойчивость к 6-меркаптопурину. инозину и гуанозину

Фрагмент 6-МР1 содержал по крайней мере 8 генов. Для того, чтобы идентифицировать ген, придающий устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину, каждый из генов был субклонирован в многокопийный вектор рОК12 (Vieira, Messing, Gene, 100,189-194,1991) и проверен на способность придавать устойчивость к указанным реагентам. Среди них ген yicM, содержащий примерно 342 п.о. перед предполагаемым старт-кодоном (последовательность Genbank, инвентарный номер NP_418118), был вырезан из фрагмента 6-МР1 с использованием ферментов рестрикции PstI и PvuII и вставлен в вектор рОК12 (Vieira, Messing, Gene, 100, 189-194, 1991), предварительно обработанный ферментами рестрикции PstI и Есо32I. Так была получена плазмида pYICM1, содержащая ген YicM (Фиг.2).

Плазмида pYICMI, а также вектор рОК12 были введены в штаммы Е. coli TG1 и TG1 deoD gsk3. Так были получены штаммы TG1(pYICM1), TG1(pOK12), TG1 deoD gsk3(pYICM1) и TG1 deoD gsk3(pOK12). Затем была определена способность этих штаммов расти в присутствии 6-меркаптопурина, инозина и гуанозина на чашках с минимальной агаризованной средой М9 с глюкозой, содержащей ступенчатые концентрации ингибитора. Чашки были засеяны клетками (от 10⁵ до 10⁶) ночной культуры, выращенной на минимальной среде, содержащей 50 мг/мл канамицина в случае штаммов с плазмидами. Степень роста была оценена после инкубации в течение 44 часов при 37°С.

Результаты представлены в Таблице 1.

Таблица 1.ШтаммРост на минимальной среде, содержащей:6-МР, мкг/млИнозин, мкг/млГуанозин, мкг/мл2005003001000103050E.coli TG1 (pYiCM1)--n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.E.coli TG1 (pOK12)++n.d.n.d.n.d.n.d.n.d.E.coli TG1 deoD gsk3 (pYICM1)n.d.n.d.-----E.coli TGl deoD gsk3 (pOK12)n.d.n.d.++++-Примечание. Рост оценивался через 48 часов, n.d.: не определяли; +: хороший рост; -: отсутствие роста.

Штамм E.coli TG1 deoD gsk3 (pYICM1) демонстрирует устойчивость к инозину и гуанозину. Этот штамм может считаться устойчивым ко всем трем аналогам (6-меркаптопурину, инозину и гуанозину), поскольку родительский штамм E.coli TG1 (pYICM1) устойчив к 6-меркаптопурину. Штамм E.coli TG1 deoD gsk3 (pYICM1) получен из E.coli TG1 (pYICM1) без изменения фенотипа 6-МР^R.

Как видно из Таблицы 1, амплификация гена yicM в значительной степени увеличила устойчивость клеток к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину.

Пример 3: Идентификация точки начала трансляции гена vicM.

Точка начала трансляции гена yic М не была известна, а предполагаемый аминокислотный состав соответствующего белка изменялся в разных базах данных. В соответствии с базой данных Genbank, белок (NP_418118) состоял из 451 аминокислоты. В соответствии с базой SWISS-PROT белок (Р31438) состоял из 412 аминокислот. В соответсвии с базой EcoGene белок (EG 11689) состоял из 396 аминокислот. Соответствующие старт кодоны отмечены жирным шрифтом на Фиг.3.

Нуклеотидная последовательность хромосомной области, находящейся перед геном yicM, представлена в Списке последовательностей под номером 5. Для определения истинной точки начала трансляции гена yicM были синтезированы три пары затравок, а именно SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11. Затем, используя сайт-направленный мутагенез, мы разрушили потенциальные старт кодоны указанного гена, содержащегося на плазмиде pYICM1, поочередным введением мутаций. Так, кодон GTG был заменен на CTG, и оба кодона ATG (ATG1 и ATG2) были заменены на АТС. Приведенные выше замены подтвердили с помощью секвенирования. Затем в штамме TG1 deoD gsk3 был изучен эффект влияния мутаций на фенотип клеток. Каждая из плазмид, содержащих мутантный ген yicM, была введена в клетки указанного штамма, после чего был проверен рост этого штамма в присутствии ингибирующих концентраций инозина. Результаты представлены в Таблице 2.

Таблица 2ШтаммРост на среде М9 с инозином-500 мкг/млЕ. coli TG1 deoD gsk3 (рОК12)+-Е. coli TG1 deoD gsk3 (pOK12-yicM)++Е. coli TG1 deoD gsk3 (pOK12-yicM gtg→ctg)++Е. coli TG1 deoD gsk3 (pOK12-yicM atgl→atc)++Е. coli TG1 deoD gsk3 (pOK12-yicM atg2→atc)+-Примечание. Рост оценивался через 48 часов. +: хороший рост; -: отсутствие роста.

Как видно из Таблицы 2, амплификация природного гена yicM сообщила клеткам устойчивость к инозину. Мутации в кодонах GTG и ATG1 никак не повлияли на устойчивость к инозину. Тем не менее, когда кодон ATG2 был мутирован, клетки стали чувствительны к инозину. Таким образом, было высказано предположение, что кодон ATG2 является истинным старт кодовом гена yicM. Тот факт, что только перед самой короткой ORF находится последовательность, напоминающая сайт связывания рибосомы (подчеркнуто на Фиг.3), подтвердило это предположение.

Таким образом, ген yicM кодирует белок, состоящий из 396 аминокислотных остатков (последовательность 2) и предсказанную молекулярную массу 41.85 кДа. Анализ сиквенса белка YicM стандартными методами (Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol, 157,105-132, (1982), Tusnady and Simon, J. Mol. BioL, 283,489-506 (1998)) показал, что это высокогидрофобный белок, состоящий из 12 предсказанных трансмембранных сегментов. Белок YicM принадлежит к семейству транспортеров, осуществляющих перенос субстратов через мембрану посредством протон-движущей силы (Drug:H⁺ Antiporter-1 (12 Spanner) (DHA1)), входящему, в свою очередь, в надсемейство MFS (MFS - major facilitator superfamily) (Pao, S.S. et al, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (I): 1-32 (1998)) и к кластеру ортологов пермеаз эффлюкса арабинозы (COG) 2814 (Tatusov, R.L. et al, Nucleic Acids Res., 29: 22-28 (2001)). Другими белками из Е. coli, принадлежащим к этому семейству, являются AraJ, YdeA and YdhP. Геном Bacillus subtilis содержит 6 генов, кодирующих гомологи гена yicM gene: ybcL, yceJ, ydhL, yfliI, ytbD, ywfA. Таким образом, может быть предсказано, что ген yicM кодирует белок, участвующий в эффлюксе некоторых метаболитов. Тот факт, что суперэкспрессия этого гена сообщает клетке устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину, позволяет считать производные инозина возможными субстратами для кодируемого им белка.

Пример 4. Влияние амплификации гена yicM на продукцию инозина штаммом Е. coli - продуцентом инозина.

Штамм FADRaddedd (pMWKQAp) - продуцент инозина был трансформирован вектором рОК.12 и плазмидой pYICM1. Так были получены штаммы FADRaddedd (pMWKQAp, pOK12) и FADRaddedd (pMWKQAp, pYICM1). Каждый из этих штаммов выращивался при 37°С в течение 18 часов в L-бульоне, содержащем 100 мг/л ампициллина и 75 мг/л канамицина, и 0.3 мл полученной культуры было перенесено в 3 мл питательной среды для ферментации, содержащей 100 мг/л ампициллина и 75 мг/л канамицина, в пробирке 20×200 мм и инкубировалось при 37°С в течение 72 часов на роторной качалке.

Состав питательной среды для ферментации (г/л):

Глюкоза 40.0(NH₄)₂SO₄ 16.0КН₂PO₄0.1MgSO₄×7H₂O 1.0FeSO₄×7H₂O 0.01MnSO₄×5Н₂О 0.01Дрожжевой экстракт 8.0СаСО₃30.0

Глюкоза и сульфат марганца стерилизовались раздельно. СаСО₃ стерилизовали нагреванием при 180°С в течение 2 часов. рН поддерживали в районе 7.0. Антибиотики добавляли в среду после стерилизации.

После выращивания количество инозина, накопленное в среде, определялось методом ВЭЖХ. Образец культуральной жидкости (500 мкл) был отцентрифугирован при 15000 об/мин в течение 5 мин, супернатант был разбавлен водой в 4 раза и проанализирован с помощью ВЭЖХ.

Условия для анализа с помощью ВЭЖХ:

Колонка: Luna С 18(2) 250×3 мм, 5 u (Phenomenex, USA). Буфер: 2% v/v C₂H₅OH; 0.8% v/v триэтиламин, 0.5% v/v уксусная кислота (ледяная), рН 4.5. Температура: 30°С. Скорость потока: 0.3 мл/мин. Объем пробы: 5 мкл. УФ-детектор: 250 нм.

Время удерживания (мин):

Ксантозин 13.7Инозин 9.6Гипоксантин 5.2Гуанозин 11.4Аденозин 28.2

Результаты представлены в Таблице 3.

Таблица 3.ШтаммOD540Инозин, г/лFADRaddedd (pMWKQAp, pOK12)8.61.1FADRaddedd (pMWKQAp, pYICM1)9.01.5

Как видно из Таблицы 3, амплификация гена yicM увеличивала продукцию инозина штаммом FADRaddedd (pMWKQAp).

Изобретение относится к биотехнологии. Инозин, а также 5'-инозиновую кислоту получают с использованием бактерий Escherichia, при этом продукция инозина указанными бактериями увеличена за счет увеличения активности белка, кодируемого геном yicM. Данное изобретение позволяет увеличить выход инозина и 5'-инозиновой кислоты. 3 н. 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл.

1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, обладающая способностью к продукции инозина, в которой активность белка YicM повышена.2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что активность белка, описанного в пунктах (А) или (В), в клетке вышеупомянутой бактерии повышена:

(A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2;

(B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью, придающей бактерии повышенную устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину.