Область техники
Настоящее изобретение относится к способу получения пуриновых нуклеозидов, таких как инозин и ксантозин, являющихся важными исходными реагентами для синтеза инозин-5’-фосфата, ксантозин-5’-фосфата и гуанин-5’-фосфата, и к новому микроорганизму, используемому для их продукции.
Предшествующий уровень техники
Традиционно нуклеозиды получают в промышленном масштабе методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, ауксотрофных по аденину, или этих штаммов, которым дополнительно придана устойчивость к различным соединениям, таких как аналоги пуринов и сульфагуанидин. Примерами таких штаммов являются штаммы, принадлежащие к роду Bacillus (патентные заявки Японии №38-23039, 54-17033, 55-2956 и 55-45199, выложенная патентная заявка Японии №56-162998, патентные заявки Японии 57-14160 и 57-41915 и выложенная патентная заявка Японии №59-42895), к роду Brevibacterium (патентные заявки Японии №51-5075 и 58-17592 и Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)), к роду Escherichia (заявка РСТ WO 9903988) и подобные им.
Получение указанных мутантных штаммов обычно состоит из обработки микроорганизмов с целью получения мутаций, например, путем облучения Уф-излучением или обработки нитрозогуанидином (N-метил-N’-нитро-N-нитрозогуанидином) с последующей селекцией нужного штамма на подходящей питательной среде для селекции. С другой стороны, также практикуется выращивание мутантных штаммов, принадлежащих к роду Bacillus (выложенные патентные заявки Японии №58-158197, 58-175493, 59-28470, 60-156388, 1-27477, 1-174385, 3-58787, 3-164185, 5-84067 и 5-192164) и к роду Brevibacterium (выложенная патентная заявка Японии 63-248394), полученных с использованием методов генной инженерии.
Ранее авторы настоящего изобретения получили, исходя из Е. coli К12, мутант, содержащий мутацию rhtA23, придающую устойчивость к высокой концентрации треонина, гомосерина и некоторым другим аминокислотам и аналогам аминокислот на минимальной питательной среде. Кроме того, указанная мутация rhtA23 улучшала продукцию L-треонина соответствующим штаммом-продуцентом Е. coli (ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, August 24-29, 1997, abstract No.457). Более того, авторы настоящего изобретения выяснили, что ген rhtA расположен в положении 18 min на хромосоме E.coli рядом, и ген rhtA идентичен открытой рамке считывания ybiF, расположенной между генами рехВ и ompX. Кроме того, авторы настоящего изобретения установили, что мутация rhtA23 является заменой А на G положении - 1 относительно старт-кодона ATG. Предполагается, что указанная мутация увеличивает транспорт треонина и гомосерина из клетки (ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, August 24-29, 1997, abstract No.457).
Но в настоящее время нет сообщений, описывающих какие-либо экспортеры пуриновых соединений.
Описание изобретения
Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности нуклеозидов штаммами-продуцентами нуклеозидов и предоставление способа получения нуклеозидов, таких как инозин и ксантозин, с использованием указанных штаммов.
Данная цель была достигнута путем установления того факта, что мутация rhtA23 придает микроорганизму устойчивость к аналогу пурина, 8-азааденину, и повышает продукцию нуклеозида. Кроме того, природный ген rhtA, кодирующий, как предполагается, мембранный белок, не вовлеченный в путь биосинтеза пуриновых нуклеозидов, также придает микроорганизму устойчивость к аналогу пурина, в случае, когда природный аллель указанного гена вводится в клетку на многокопийном векторе. Более того, природный ген rhtA может увеличивать продукцию штамма в случае, когда в соответствующие штаммы-продуценты нуклеозидов, принадлежащие к роду Escherichia или Bacillus, введены дополнительные копии указанного гена. Таким образом было совершено настоящее изобретение.
Таким образом, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм, принадлежащий к роду Escherichia или Bacillus, обладающий способностью к продукции пуриновых нуклеозидов.
В частности, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм с повышенной способностью к продукции пуриновых нуклеозидов, основанной на повышении активности белка, вовлеченного, как предполагается, в транспорт пуриновых нуклеозидов из клетки указанного микроорганизма. Более конкретно, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм с повышенной способностью к продукции пуриновых нуклеозидов, основанной на повышении экспрессии гена, кодирующего белок, вовлеченный в процесс экскреции пуриновых нуклеозидов.
Далее настоящее изобретение предоставляет способ получения пуриновых нуклеозидов методом ферментации, включающим стадии выращивания указанного выше микроорганизма в питательной среде с целью продукции и накопления пуриновых нуклеозидов в питательной среде, и выделения пуриновых нуклеозидов из культуральной жидкости.
Далее настоящее изобретение предоставляет способ получения пуриновых нуклеотидов, таких как инозин-5’-фосфат и ксантозин-5’-фосфат, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного пуринового нуклеозида, и выделения полученного пуринового нуклеозида.
Также настоящее изобретение предоставляет способ получения гуанозин-5’-фосфата, включающий стадии выращивания указанной выше бактерии в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного ксантозина, аминирования полученного ксантозин-5’-фосфата, и выделения полученного гуанозин-5’-фосфата.
Настоящее изобретение включает в себя следующее.
Изобретение 1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или к роду Bacillus, обладающая способностью к продукции пуринового нуклеозида, в которой активность белка, описанного в пунктах (А) или (В), в клетке упомянутой бактерии повышена:
(A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2;
(B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью, придающей бактерии повышенную устойчивость к 8-азааденину.
Изобретение 2. Бактерия в соответствии с Изобретением 1, в которой активности белков, описанных в пунктах (А) или (В), повышены путем трансформации бактерии с помощью ДНК, кодирующей белки, описанные в пунктах (А) или (В), или путем изменения регуляции экспрессии указанной ДНК в упомянутой бактерии.
Изобретение 3. Бактерия в соответствии с Изобретением 2, в которой трансформация осуществляется с использованием многокопийного вектора.
Изобретение 4. Бактерия в соответствии с Изобретением 1, в которой пуриновым нуклеозидом является инозин.
Изобретение 5. Бактерия в соответствии с Изобретением 1, в которой пуриновым нуклеозидом является ксантозин.
Изобретение 6. Способ получения пуринового нуклеозида, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с любым из Изобретений 1-5 в питательной среде и выделения из культуральной жидкости полученного и накопленного в ней пуринового нуклеозида.
Изобретение 7. Способ в соответствии с Изобретением 6, в котором пуриновым нуклеозидом является инозин.
Изобретение 8. Способ в соответствии с Изобретением 6, в котором пуриновым нуклеозидом является ксантозин.
Изобретение 9. Способ в соответствии с любым из Изобретений 6-8, в котором бактерия модифицирована с целью повышения экспрессии генов биосинтеза пуриновых нуклеозидов.
Изобретение 10. Способ получения пуринового нуклеотида, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с любым из Изобретений 1-5 в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного нуклеозида, и выделения полученного и накопленного пуринового нуклеотида.
Изобретение 11. Способ в соответствии с Изобретением 10, в котором пуриновым нуклеотидом является инозин-5’-фосфат.
Изобретение 12. Способ в соответствии с Изобретением 10, в котором пуриновым нуклеотидом является ксантозин-5’-фосфат.
Изобретение 13. Способ в соответствии с любым из Изобретений 10-12, в котором бактерия модифицирована с целью повышения экспрессии генов биосинтеза пуриновых нуклеозидов.
Изобретение 14. Способ получения гуанозин-5’-фосфата, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с Изобретением 5 в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного ксантозина, аминирования полученного ксантозин-5’-фосфата, и выделения полученного и накопленного гуанозин-5’-фосфата.
Изобретение 15. Способ в соответствии с Изобретением 14, в котором бактерия модифицирована с целью повышения экспрессии генов биосинтеза пуриновых нуклеозидов.
Настоящее изобретение более детально будет описано ниже.
1. Микроорганизм согласно настоящему изобретению.
Вышеуказанной бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или к роду Bacillus, обладающая способностью к продукции пуринового нуклеозида, в которой активность белка, описанного в пунктах (А) или (В), в клетке упомянутой бактерии повышена: (А) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2; (В) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к 8-азааденину.
Термин “бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или к роду Bacillus”, означает, что бактерия относится к роду Escherichia или к роду Bacillus в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е. coli). В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Bacillus, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Bacillus subtilis (В. subtilis).
Термин “пуриновый нуклеозид” включает в себя инозин, ксантозин, гуанозин и аденозин.
Использованный здесь термин “способность к продукции пуринового нуклеозида” означает способность к продукции и накоплению пуринового нуклеозида в питательной среде. Термин “обладающая способностью к продукции пуринового нуклеозида” означает то, что микроорганизм, принадлежащий к роду Escherichia или к роду Bacillus, обладает способностью к продукции и накоплению в питательной среде пуринового нуклеозида в количестве большем, чем природный штамм Е. coli, такие как штаммы E.coli W3110 и MG1655, или природный штамм В. subtilis, такой как штамм В. subtilis 168, и предпочтительно означает, что микроорганизм способен к продукции и накоплению в питательной среде количество не менее чем 10 мг/л, более предпочтительно не менее чем 50 мг/л инозина, ксантозина, гуанозина или/и аденозина.
Термин “активность белка, описанного в пунктах (А) или (В), в клетке упомянутой бактерии повышена” означает, что количество молекул указанного белка в клетке повышено или сама активность в пересчете на белок повышена. Термин “активность” означает активность, придающую бактерии устойчивость к 8-азааденину.
К белкам согласно настоящему изобретению относятся белки, описанные в следующих пунктах (А) или (В):
(A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2;
(B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к 8-азааденину.
Белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2, является белком RhtA. Белок RhtA является, как предполагается, трансмембранным белком, состоящим из 95 аминокислот и обладающим неизвестной функцией. Белок RhtA кодируется геном rhtA. Ген rhtA расположен в положении 18 min на хромосоме Е. coli рядом с опероном glnHPQ, кодирующим компоненты системы транспорта глутамина. Ген rhtA идентичен открытой рамке считывания (ОRF1) гена ybiF (нуклеотиды с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА218541, gi:440181 в базе данных GenBank), расположенной между генами рехВ и оmрХ. Участок, экспрессирующий белок, кодируемый указанной ORF, был обозначен как rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine - устойчивость к гомосерину и треонину), поскольку ранее авторы настоящего изобретения получили, исходя из Е.соli К12, мутант, содержащий мутацию в гене rhtA, T-23 или thrR (также упоминаемую здесь как rhtA23), придающую устойчивость к высокой концентрации треонина и гомосерина на минимальной питательной среде (SU Patent No.974817, Astaurova, О.В. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 21, 611-616 (1985)). Указанная мутация rhtA23 улучшала продукцию L-треонина (SU Patent No.974817, US Patent No.6165756), гомосерина и глутамата (Astaurova, О.В. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 27, 556-561, 1991) соответствующим штаммом-продуцентом Е. coli, таким как штамм ВКПМ В-3996. Кроме того, авторы настоящего изобретения установили, что мутация rhtA23 является заменой А на G положении - 1 относительно старт-кодона ATG (ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, August 24-29, 1997, abstract No.457).
Количество “нескольких” аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Оно может быть от 2 до 30, предпочтительно от 2 до 15 и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (А).
Термин “устойчивость к 8-азааденину” означает способность бактерии к росту на минимальной питательной среде, содержащей 8-азааденин в концентрации, при которой штамм дикого типа или родительский штамм не может расти, или способность бактерии расти на питательной среде, содержащей 8-азааденин, с большей скоростью, чем штамм дикого типа или родительский штамм. Упомянутая выше концентрация 8-азааденина составляет обычно от 50 до 5000 мкг/мл, предпочтительно от 100 до 1000 мкг/мл.
Методы увеличения активности белка согласно настоящему изобретению, в особенности методы увеличения количества молекул указанного белка в клетке, включают методы изменения последовательности, регулирующей экспрессию ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, и методы увеличения числа копий гена, но не ограничиваются ими.
Изменение последовательности, регулирующей экспрессию ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, может быть достигнуто путем помещения ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, под контроль сильного промотора. В качестве сильных промоторов известны, например, lac промотор, trp промотор, trc промотор, pl промотор фага лямбда. С другой стороны, промотор может быть усилен, например, путем введения мутации в указанный промотор с целью увеличения уровня транскрипции гена, расположенного после промотора. Далее, известно, что замена нескольких нуклеотидов в участке между местом связывания рибосомы (RBS) и старт-кодоном, а в особенности, в последовательности непосредственно перед старт-кодоном, в значительной степени влияет на транслируем ость мРНК. Например, было обнаружено 20-кратное изменение уровня экспрессии в зависимости от природы трех нуклеотидов, предшествующих старт-кодону (Gold et al. Annu. Rev. Microbiol. 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984). Как описано выше, авторы настоящего изобретения установили, что мутация rhtA23 является заменой А на G положении - 1 относительно старт-кодона ATG. Поэтому было высказано предположение, что мутация rhtA23 усиливает экспрессию гена rhtA и, как следствие, увеличивает уровень устойчивости к треонину, гомосерину и некоторым другим субстратам, транспортируемым из клетки.
Более того, некий “энхансер” может быть дополнительно введен с целью увеличения уровня транскрипции указанного гена. Введение ДНК, содержащей либо ген, либо промотор в хромосомную ДНК, описано, например, в выложенной патентной заявке Японии №1-215280.
В качестве альтернативы, число копий гена может быть увеличено путем введения гена в многокопийный вектор с образованием рекомбинантной ДНК, с последующим введением такой рекомбинантной ДНК в микроорганизм. Примерами векторов, использующихся для введения рекомбинантной ДНК, являются плазмидные векторы, такие как pMW118, pBR322, pUC19, pET22b и подобные им, фаговые векторы, такие как 11059, 1BF101, M13mp9, фаг Mu (выложенная патентная заявка Японии №2-109985) и подобные им, и транспозоны (Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)), такие как Mu, Tn10, Tn5 и подобные им. Кроме того, усиление экспрессии гена может быть достигнуто путем интеграции гена в бактериальную хромосому методом гомологичной рекомбинации или подобным.
Методы использования сильного промотора или “энхансера” могут комбинироваться с методами увеличения числа копий гена.
Для выведения микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia или к роду Bacillus и обладающего повышенной экспрессией гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, необходимые участки генов могут быть получены с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакцией) на основе уже доступной информации о генах Е. coli и В. subtilis. Например, ген rhtA, который, как предполагается, кодирует транспортер, может быть клонирован из хромосомной ДНК штаммов Е. coli K12 W3110 и Е. coli MG1655 с использованием метода ПЦР. Хромосомная ДНК, используемая для этого, также может быть получена из любого другого штамма Е. coli.
К белкам согласно настоящему изобретению относятся мутанты и варианты белка RhtA, которые могут существовать вследствие природного разнообразия, при условии, что указанные мутанты и варианты демонстрируют функциональные свойства белка RhtA, по крайней мере устойчивость к 8-азааденину. ДНК, кодирующая указанные мутанты и варианты, может быть получена путем выделения ДНК, которая гибридизуется с геном rhtA (SEQ ID NO:1) или частью указанного гена в жестких условиях и которая кодирует белок, увеличивающий продукцию пуриновых нуклеотидов. Термин “жесткие условия”, упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические - не образуются. Например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру ДНК, обладающие гомологией не менее 70% друг относительно друга. В качестве варианта, примером жестких условий являются условия, соответствующие условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например 60° С, 1× SSC, 0,1% SDS, предпочтительно 0,1× SSC, 0,1% SDS. В качестве зонда для ДНК, кодирующей варианты и гибридизующейся с геном rhtA, также может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером 1. Зонд подобного рода может быть получен в результате ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером 1, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером 1, в качестве матрицы. В случае, когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50° C, 2× SSC и 0,1% SDS.
Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции пуриновых нуклеозидов. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции пуриновых нуклеозидов.
В качестве родительского штамма-продуцента инозина, в которым активности белков согласно настоящему изобретению будут повышены, может быть использован штамм Е. coli AJ13732 (FADRaddeddyicPpgixapA(pMWKQ)) (WО 9903988). Указанный штамм является производным от известного штамма W3110, содержащего мутации, введенные в ген purF, кодирующий PRPP амидотрансферазу, ген purR, кодирующий репрессор биосинтеза пуринов, ген deoD, кодирующий фосфорилазу пуриновых нуклеозидов, ген purА, кодирующий сукцинил-АМР-синтазу, ген add, кодирующий аденозиндеаминазу, ген edd, кодирующий 6-фосфоглюконатдегидразу, ген pgi, кодирующий фосоглюкозоизомеразу, ген харА, кодирующий ксантозинфосфорилазу (purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-, pgi-, харА-), а также содержащего плазмиду pMWKQ - производную от вектора pMW218, в которой находятся гены purFKQ, кодирующие PRPP амидотрансферазу, нечувствительную к гуанозин монофосфату (GMP) (WО 9903988).
В качестве родительского штамма-продуцента ксантозина, в котором активности белков согласно настоящему изобретению будут повышены, может быть использован штамм Е. coli AJ13732 guaA::Tn10 (pMWKQ). Штамм Е. coli AJ13732 guaA::Tn10 (pMWKQ) сконструирован путем разрушения гена, кодирующего GMP синтетазу, в штамме AJ13732 (pMWKQ) (см. Пример 7).
В качестве родительского штамма, принадлежащего к роду Bacillus, - продуцента инозина, может быть использован штамм В. subtilis KMBS16. Указанный штамм является производным от известного штамма В. subtilis trpC2, содержащим мутации, введенные в ген purR, кодирующий репрессор биосинтеза пуринов (purR::spc), ген purA, кодирующий сукцинил-АМР-синтазу (purA::erm), ген deoD, кодирующий фосфорилазу пуриновых нуклеозидов (deoD::kan). В качестве других родительских штаммов, принадлежащих к роду Bacillus, в которых активности белков согласно настоящему изобретению будут повышены, могут быть использованы штаммы В. subtilis AJ12707 (FERM Р-12951) (патентная заявка Японии JP 6113876 А2), В. subtilis AJ3772 (FERM P-2555) (патентная заявка Японии JP 62014794 A2) и подобные им.
Чтобы увеличить саму активность в пересчете на белок согласно настоящему изобретению, также возможно ввести мутацию в структурную часть гена, кодирующего белок, чтобы увеличить активность белка. Для того чтобы ввести мутацию в ген, могут быть использованы сайт-специфический мутагенез (Kramer, W. and Frits, H.J. Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)), методы рекомбинантной ПЦР (PCR Technology, Stockton Press (1989)), химический синтез специфических участков ДНК, обработка нужного гена с помощью гидроксиламина, обработка микробных штаммов, содержащей нужный ген, с помощью УФ-излучения или химического реагента, такого как нитрозогуанидин или азотистая кислота, или подобным методом. Микроорганизм, в котором активность указанного белка повышена, может быть отобран как штамм, растущий на минимальной среде, содержащей 8-азааденин.
Бактерия согласно настоящему изобретению может быть в дальнейшем улучшена за счет увеличения экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез пуринов. Примерами таких генов являются гены оперона рurЕКВ-purC(orf)QLF-purMNH(J)-purD из В. subtilis (Ebbole D.J. and Zalkin H., J. Biol. Chem., 262, 17, 8274-87, 1987) и гены рur регулона из Е. coli (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).
Было показано, что продукция инозина увеличивалась при использовании устойчивых к 8-азагуанину мутантов В. subtilis с генетически модифицированной репрессией ферментов синтеза пуриновых нуклеозидов (Shiio I. and Ishii К., J. Biochem., 69, 339-347, 1971). Продукция инозина штаммом Е. coli, содержавшим мутантный ген purF, кодирующий PRPP амидотрансферазу, свободную от ингибированию GMP и АМР по типу обратной связи, была увеличена путем инактивации генa purR, кодирующего репрессор биосинтеза пуринов (WO 9903988).
Механизмом, увеличивающим продукцию пуриновых нуклеозидов бактерией путем увеличения активности белков согласно настоящему изобретению, является, как можно предположить, повышенная экскреция целевого пуринового нуклеозида из клетки бактерии.
2. Способ получения пуриновых нуклеозидов.
К способам согласно настоящему изобретению относится способ получения пуринового нуклеозида, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления указанного пуринового нуклеозида в питательной среде, и выделения пуринового нуклеозида из культуральной жидкости. Более конкретно, к способам согласно настоящему изобретению относится способ получения инозина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления инозина в питательной среде, и выделения инозина из культуральной жидкости. Также к способам согласно настоящему изобретению относится способ получения ксантозина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления ксантозина в питательной среде, и выделения ксантозина из культуральной жидкости.
Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка пуринового нуклеозида из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых пуриновый нуклеозид продуцируется с использованием микроорганизма. Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и другие необходимые органические. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза, лактоза, галактоза, фруктоза, арабиноза, мальтоза, ксилоза, трехалоза, рибоза и гидролизат крахмала; спирты, такие как глицерин, маннитол и сорбитол; различные органические кислоты, такие как глюконовая кислота, фумаровая кислота, лимонная кислота и янтарная кислота и подобные им. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония, органические источники азота, такие как гидролизат соевых бобов; газообразный аммиак и подобные соединения. Желательно, чтобы подходящие небольшие количества витаминов, таких как витамин B1, и других необходимых веществ, например нуклеиновых кислот, таких как аденин и РНК, или дрожжевой экстракт и подобные соединения присутствовали в питательной среде в качестве органических питательных компонент. Кроме того, небольшие количества фосфата кальция, сульфата магния, ионов железа, ионов марганца и подобных соединений могут быть добавлены, если необходимо.
Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях в течение 16-72 ч, температура при выращивании поддерживается в пределах от 30 до 45° С и рН в пределах от 5 до 8. рН среды может регулироваться неорганическими или органическими кислотными или щелочными веществами, также как и газообразным аммиаком.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем целевой пуриновый нуклеозид может быть выделен из культуральной жидкости любым из традиционных методов или любой комбинацией этих методов, таким как ионообменная хроматография и осаждение.
3. Способ получения пуриновых нуклеотидов.
К способам согласно настоящему изобретению также относится способ получения пуринового нуклеотида, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного пуринового нуклеозида, и выделения полученного и накопленного пуринового нуклеотида. Более конкретно, к способам согласно настоящему изобретению также относится способ получения инозин-5’-фосфата, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного инозина, и выделения полученного и накопленного инозин-5’-фосфата. Также к способам согласно настоящему изобретению относится способ получения ксантозин-5’-фосфата, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного ксантозина, и выделения полученного и накопленного ксантозин-5’-фосфата.
Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка пуринового нуклеозида из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых пуриновый нуклеозид продуцируется с использованием микроорганизма. Далее, согласно настоящему изобретению фосфорилирование полученного и накопленного пуринового нуклеозида, а также выделение полученного и накопленного пуринового нуклеотида может быть осуществлено методом, подобным традиционным методам, в которых пуриновый нуклеотид получается из пуринового нуклеозида.
Фосфорилирование пуринового нуклеозида может быть осуществлено ферментативно с использованием различных фосфатаз, нуклеозидкиназ и нуклеозидфосфотрансфераз или химически с использованием фосфорилирующих агентов, таких как РОСl3 или подобным им. Могут быть использованы фосфатаза, способная к катализу селективного переноса фосфорильной группы пирофосфата в 5’-положение нуклеозида (Mihara et. al. Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganii. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66:2811-2816), или кислая фосфатаза, использующая полифосфорные кислоты (их соли), фенилфосфорную кислоту (ее соли) или карбамилфосфорную кислоту (ее соли) в качестве донора фосфорной кислоты (WO 9637603 A1), или подобные им. Также в качестве примера фосфатазы может быть приведена фосфатаза, способная к каталитическому переносу фосфорильной группы в 2’,3’,5’-положение нуклеозида с использованием в качестве субстрата п-нитрофенилфосфата (Mitsugi, К. et al. Agric. Biol. Chem. 1964, 28, 586-600), неорганического фосфата (JP 42-1186), или ацетилфосфата (JP 61-41555), или подобная ей. В качестве примера нуклеозидкиназы может быть приведена гуанозин-инозинкиназа из Е. coli (Mori et al. Cloning of a guanosine-inosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 1995, 177:4921-4926; WO 9108286), или подобная ей. В качестве примера нуклеозидфосфотрансферазы может быть приведена нуклеозидфосфотрансфераза, описанная Hammer-Jespersen, К. (Nucleoside catabolism, p.203-258. In A Munch-Petesen (ed.). Metabolism of nucleotides, nucleosides and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press, New York), или подобная ей. Химическое фосфорилирование нуклеозидов может быть осуществлено с использованием фосфорилирующего агента, такого как РОСl3 (Yoshikawa et al. Studies of phosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1969, 42:3505-3508), или подобного ему.
Также к способам согласно настоящему изобретению относится способ получения гуанозин-5’-фосфата, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного ксантозина, аминирования полученного и накопленного ксантозин-5’-фосфата, и выделения полученного и накопленного гуанозин-5’-фосфата. Согласно настоящему изобретению выращивание бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирование полученного и накопленного ксантозина, аминирование полученного и накопленного ксантозин-5’-фосфата, а также выделение полученного и накопленного гуанозин-5’-фосфата может быть осуществлено методом, подобным традиционным методам, в которых гуанозин-5’-фосфат получается из ксантозин-5’-фосфата.
Аминирование ксантозин-5’-фосфата может быть осуществлено ферментативно с использованием, например, GMP синтетазы из Е. coli (Fujio et al. High level of expression of XMP aminase in Escherichia coli and its application for the industial production of 5’-guanylic acid. Biosci. Biotech. Biochem. 1997, 61:840-845; EP 0251489 B1).
В способе согласно настоящему изобретению бактерия согласно настоящему изобретению может быть модифицирована с целью увеличения экспрессии генов биосинтеза пуриновых нуклеозидов.
Подписи к чертежам
На Фиг.1 показана структура плaзмиды pNZ16.
На Фиг.2 показана структура плазмиды рRНТА3.
На Фиг.3 приведено сравнение профилей гидрофобности белков RhtA и YdeD.
На Фиг.4 показано распределение белка RhtA в клеточных фракциях. В дорожке 1 присутствует осадок (15000 g) индуцированных клеток BL21(DE3), не содержащих плазмиду (контроль); в дорожках 2-7 присутствуют равные объемы осадков и растворимых фракций индуцированных клеток BL21(DE3), содержахцих плазмиду pET22b-rhtA: дорожки 2 и 3 - осадок и супернатант после центрифугирования при 15000 g соответственно; дорожки 4 и 5 - осадок и супернатант после центрифугирования при 180000 g соответственно; дорожки 6 и 7 - осадок и супернатант после центрифугирования при 180000 g соответственно, после обработки клеток 1 М КСl. Маркеры молекулярного веса (в кДа) приведены на левом поле, и положение белка RhtA показано стрелкой на правом поле.
На Фиг.5 показана структура плазмиды pLF-RHTA.
Наилучший способ осуществления изобретения
Пример 1. Клонирование гена rhtA из Е. coli в mini-Mu фазмиду.
Ген rhtA, который, как было ранее установлено, обуславливает устойчивость к гомосерину и треонину, был клонирован in vivo с использованием фазмиды mini-Mu d5005 (Groisman, E.A. et al. J. Bacteriol., 168, 357-364 (1986)). Штамм MG442 лизогенный по фагу MuCts62 (Гусятинер и др. Генетика, 14, 947-956 (1978)), был использован в качестве донора. Свежеприготовленные лизаты были использованы для инфицирования лизогенного по фагу MuCts производного штамма ВКПМ В-513 (Hfr К10 metB). Полученные клетки высевались на минимальную среду М9 с глюкозой, содержащую метионин (50 мкг/мл), канамицин (40 мкг/мл) и гомосерин (10 мг/мл). Были отобраны колонии, появившиеся после 48 ч культивирования. Из колоний была выделена плазмидная ДНК и использована для трансформации штамма ВКПМ В-513 стандартными методами. Трансформанты были отобраны на чашках с агаризованным L-бульоном, содержащим канамицин и гомосерин, как указано выше. Из трансформантов, устойчивых к гомосерину, была выделена плазмидная ДНК, и структура встроенных фрагментов была определена рестрикционным картированием. Оказалось, что из донора были клонированы два типа фрагментов, принадлежащих к различным участкам хромосомы. Таким образом, в Е. coli существует по крайней мере два различных гена, которые придают бактерии устойчивость к гомосерину, когда они присутствуют в многокопийной плазмиде. Было показано, что одним из типов хромосомных фрагментов является фрагмент из участка 86 min. В этом случае фенотип устойчивости обуславливался повышенной экспрессией генов rhtB и rhtС (Европейские патентные заявки ЕР 1013765 А1 и ЕР 1016710 А2).
Для того чтобы отобрать фазмиды со вставкой хромосомного фрагмента 18 min, использовалась гибридизация на колониях с использованием в качестве зонда смеси шести 32Р-меченых рекомбинантных фагов (3D2, 24F9, 1В4, 10АВ, 3Е5 и 1Е2) из коллекции Kohara (Kohara et al., Cell, 50, 495-508, 1987), содержащих хромосомный фрагмент 17.5 - 18.5 min. В результате была получена плазмида pNZ4S, содержащая фрагмент длиной 9.3 kb, придающий устойчивость клеток к треонину и гомосерину.
Пример 2. Клонирование гена rhtA в векторы pBlueScript KS+ и pAYCTER-3.
Плазмида pNZ4S была обработана рестриктазами ХmnI и StuI, и полученные фрагменты ДНК были разделены методом электрофореза в низкоплавкой агарозе. Необходимый фрагмент, содержащий ген rhtA вместе с его собственным регуляторным регионом, был элюирован и вставлен в противоположном направлении к lac промотору в место узнавания рестриктазой EcoRV вектора pBlueScript KS+ (Promega), предварительно обработанного рестриктазой EcoRV. Таким образом была получена плазмида pNPZ16 (Фиг.1). Кроме того, ген rhtA был переклонирован из pNPZ16 по сайтам SmaI-HindIII стабильного среднекопийного вектора pAYCTER3, производного вектора pAYC32. Так была получена плазмида рRНТА3 (Фиг.2). Вектор pAYCTER3 является очень стабильным среднекопийным вектором, сконструированным на основе плазмиды RSF1010 (Christoserdov A.Y., Tsygankov Y.D. Plasmid, 1986, v.16, pp.161-167) путем введения в вектор pAYC32 полилинкера из плазмиды pUC19 и сильного терминатора rrnВ.
Пример 3. Изучение гомологии продукта гена rhtA с продуктом гена ydeD, вовлеченного в экскрецию производных цистеина.
Ген rhtA (SEQ ID NO:1) кодирует белок, состоящий из 295 аминокислотных остатков, с молекулярным весом 31.3 кДа. Анализ последовательности белка RhtA известным методом (Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 157, 105-132, (1982)) показал, что данный белок является гидрофобным белком, содержащим 10 предполагаемых трансмембранных сегментов. Профиль гидрофобности и количество предполагаемых трансмембранных сегментов белка RhtA (Фиг.3, сплошная линия) и белка YdeD (Фиг.3, прерывистая линия) похожи друг на друга. Данный результат показывает их гомологию (Lolkema, J.S., and Slotboom, D.-J. FEMS Microbiol Rev., 22, 305-322 (1998)). Ген ydeD кодирует белок YdeD, вовлеченный в выброс из клетки метаболитов биосинтеза цистеина (Daβ ler et al., Mol. Microbiol. 36, 1101-1112 (2000)). На основании этого можно предположить, что ген rhtA кодирует некий мембранный белок, вовлеченный в транспорт из клетки некоторых метаболитов.
Пример 4. Конструирование плазмиды pET22b-rhtA и определение клеточной локализации продукта гена rhtA.
Кодирующая последовательность гена rhtA была получена на основе плазмиды pNPZ16 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием затравок SEQ ID NO:3, содержащей сайт рестрикции Ndel, и SEQ ID NO:4, содержащей сайт рестрикции EcoRI. Полученный продукт ПЦР был обработан рестриктазами NdeI и EcoRI и лигирован в бактериальный экспрессирующий вектор pET22b (Novogene), предварительно обработанный теми же рестриктазами. Полученная плазмида, pET22b-rhtA, содержащая ген Т7 РНК полимеразы под контролем промотора Plac (Novogene), была использована для трансформации штамма Е. coli BL21(DE3). Введение гена Т7 РНК полимеразы и получение меченного [35S]метионином белка осуществлялось, по существу, как было описано ранее (Tabor and Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1074-1078 (1985)), с незначительной модификацией. Модификация была следующая: экспрессия белка была индуцирована добавлением изопропил-β -D-тиогалактопиранозида (ИПТГ, конечная концентрация 2 мМ) к 5 мл культуры в логарифмической фазе роста на среде М9, содержащей смесь 19 аминокислот (конечная концентрация 0.005%). Мечение новосинтезированного белка осуществлялось путем добавления 50 μ Ci [35S]метионина к 5 мл культуры клеток. Клетки были собраны методом центрифугирования и использованы для фракционирования. Осадок ресуспендировали в разрушающем буфере (100 мМ Трис-НСl буфер, рН 7,5, содержащем 1 мМ ЭДТА, 2 мМ дитиотреитола и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида) и клетки разрушали ультразвуком. После удаления клеточного дебриса центрифугированием при 15000 g в течение 20 мин, мембранная фракция была получена ультрацентрифугированием при 180000 g в течение 180 мин. Полученный осадок (мембранная фракция) был ресуспендирован в разрушающем буфере, содержащем 1М KCl, в течение 40 мин при комнатной температуре и центрифугирован при 180000 g в течение 180 мин. Растворимые фракции супернатанта были осаждены путем инкубирования с трихлоруксусной кислотой (конечная концентрация - 10%) при 4° С в течение 30 мин, отцентрифугированы и отмыты ацетоном. Все осадки были ресуспендированы в одинаковом объеме буфера для нанесения на гель (Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)). Белки были проанализированы методом электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия (SDS) (Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)).
Распределение белка RhtA в клеточных фракциях показано на Фиг.4. Белок RhtA соосаждался с мембранными фракциями (Фиг.4, дорожки 4 и 6) и отсутствовал во фракции растворимых белков (Фиг.4, дорожка 5). Такое же распределение белка наблюдалось после обработки КСl мембранной фракции (Фиг.4, дорожки 6, 7). Эти данные подтверждают ту точки зрения, что белок RhtA является полностью мембранным белком. Электрофоретическая подвижность белка RhtA соответствует молекулярной массе примерно в 25 кДа вместо предсказанной массы в 31,3 кДа, что может быть результатом высокой гидрофобности белка RhtA. Белок YdeD показывает аналогичный характер подвижности в геле (Daβ ler et al., Mol. Microbiol. 36, 1101-1112 (2000)).
Пример 5. Влияние мутации rhtA23 и амплификации гена rhtA на устойчивость штамма Е. coli MG1655 к аналогам пуриновых оснований.
Штамм Е. coli MG1655rhtA23 был сконструирован путем внесения мутации rhtA23 из штамма ВКПМ В-3996 (патент США 5976843) в штамм Е. coli MG1655 методом трансдукции с использованием фага Р1. Трансдуктанты были отобраны на минимальной среде М9 (Miller, 1972), содержащей 10 мг/мл гомосерина. Таким образом была получена пара изогенных штаммов Е. coli MG1655rhtA+ и Е. coli MG1655rhtA23.
Кроме того, плазмиды pNPZ16 и pRHTA3, а также соответствующие векторы pBluescript KS+ и pAYCTER3 были введены в штамм Е. coli MG1655. Так были получены штаммы MG1655(pNPZ16), MG1655(pRHTA3), MG1655(pBluescript), MG1655(pAYCTER3). Затем была определена способность каждого из указанных штаммов расти в на минимальной агаризованной среде М9 с глюкозой, содержащей ступенчато увеличивающиеся концентрации аналога пуринового основания. Чашки были засеяны от 106 до 107 клеток ночной культуры, выращенной на минимальной среде, содержащей 100 мг/мл ампицилина в случае штаммов с плазмидами. Способность к росту определялась после 44 ч инкубации при 37° С. Результаты экспериментов представлены в Таблице 1.
Как видно из Таблицы 1, мутация rhtA23 и амплификация гена rhtA увеличивали устойчивость бактерий к 8-азааденину. На основании этого можно предположить, что ген rhtA вовлечен в процесс экскреции производных пуринов.
Пример 6. Влияние мутации rhtA23 на продукцию инозина штаммом Е. coli - продуцентом инозина.
Штамм AJ13732(pMWKQ) - продуцент инозина был использован в качестве родительского штамма для введения мутации rhtA23, как это описано в Примере 5. Так был получен штамм AJ13732rhtA23(pMWKQ). Каждый из штаммов выращивался при 37° С в течение 18 ч в L-бульоне, содержащем 100 мг/л ампицилина и 75 мг/л канамицина. 0.3 мл полученной культуры было перенесено в 3 мл питательной среды для ферментации, содержащей 100 мг/мл ампицилина и 75 мг/л канамицина, в пробирке 20× 200 мм и инкубировалось при 37° С в течение 72 ч на роторной качалке.
Состав среды для ферментации (г/л):
Глюкоза 40.0
(NH4)2SO4 16.0
К2НРO4 1.0
MgSO47H2O 1.0
FeSO47H2O 0.01
MnSO4 5H2O 0.01
Дрожжевой экстракт 8.0
СаСО3 30.0
Глюкоза и сульфат магния стерилизовали раздельно. СаСО3 стерилизовали при 180° С в течение 2 ч. рН поддерживался в районе 7,0. Антибиотик добавляли в питательную среду после стерилизации.
После выращивания количество инозина, накопленное в среде, определялось методом ВЭЖХ. Образец культуральной жидкости (500 мкл) был отцентрифугирован при 1500 об/мин в течение 5 мин, супернатант был разбавлен водой в 100 раз и проанализирован с помощью ВЭЖХ.
Условия для анализа с помощью ВЭЖХ.
Колонка: Luna С 18(2) 250× 3 мм, 5 u (Phenomenex, USA). Буфер: 2% v/v C2H5OH; 0,8% v/v триэтиламин, 0,5% v/v уксусная кислота (ледяная), рН 4,5. Температура: 30° С. Скорость потока: 0,3 мл/мин. Объем пробы: 5 мкл. УФ-детектор: 250 нм.
Время удерживания (мин):
Ксантозин 13.7
Инозин 9.6
Гипоксантин 5.2
Гуанозин 11.4
Аденозин 28.2
Результаты представлены в Таблице 2.
Как видно из Таблицы 2, мутация rhtA23 улучшает продукцию инозина штаммом AJ13732.
Пример 7. Влияние мутации rhtA23 на продукцию ксантозина штаммом Е. coli - продуцентом ксантозина.
Штамм, продуцирующий ксантозин, был получен из штамма AJ13732(pMWKQ) - продуцента инозина. С использованием трансдукции с помощью фага Р1 в штамм AJ13732(pMWKQ) была введена мутация guaA.:Tn10, которая инактивирует ген GMP синтетазы (guaA). Трансдуктанты были отобраны на среде LB, содержащей 20 мкг/мл тетрациклина. Среди них был найден штамм AJ13732 gw.4::Tn10(pMWKQ), способный к продукции ксантозина. Производный от этого штамма, содержащий мутацию rhtA23, был получен, как описано в Примере 5, с получением штамма AJ13732 guaA::Tn 10rhtA23(pMWKQ).
Каждый из штаммов AJ13732 gua4::Tn10(pMWKQ) и AJ13732 guaA::Tn10 rhtA23(pMWKQ) выращивался при 37° С в течение 18 ч в L-бульоне, содержащем 10 мг/л канамицина и 10 мг/л тетрациклина. 0,3 мл полученной культуры было перенесено в 3 мл питательной среды для ферментации (см. Пример 3), содержащей 75 мг/л канамицина и 10 мг/л тетрациклина, в пробирке 20× 200 мм и инкубировалось при 37° С в течение 48 ч на роторной качалке. После выращивания количество ксантозина, накопленное в среде, определялось методом ВЭЖХ, как описано выше. Результаты представлены в Таблице 3.
Как видно из Таблицы 3, мутация rhtA23 улучшает продукцию ксантозина штаммом AJ13732 guaA::Tn10(pMWKQ).
Пример 8. Влияние амплификации гена rhtA на продукцию инозина штаммом Е. coli - продуцентом инозина.
Штамм AJ13732(pMWKQ) - продуцент инозина был трансформирован вектором pAYCTER3 и плазмидой рRНТА3. Так были получены штаммы AJ13732(pMWKQ, pAYCTER3), AJ13732(pMWKQ, pRHTA3). Каждый из этих штаммов выращивался при 37° С в течение 18 ч в L-бульоне, содержащем 100 мг/л ампицилина и 75 мг/л канамицина. 0.3 мл полученной культуры было перенесено в 3 мл питательной среды для ферментации (см. Пример 3), содержащей 100 мг/л ампицилина и 75 мг/л канамицина, в пробирке 20× 200 мм и инкубировалось при 37° С в течение 48 ч на роторной качалке. После выращивания количество ксантозина, накопленное в среде, определялось методом ВЭЖХ, как описано выше. Результаты представлены в Таблице 4.
Как видно из Таблицы 4, амплификация гена rhtA улучшает продукцию инозина штаммом AJ13732(pMWKQ).
Пример 9. Влияние амплификации гена rhtA на продукцию ксантозина штаммом Е. coli - продуцентом ксантозина.
Штамм АJ13732 guaA::Tn10(pMWKQ) - продуцент ксантозина, описанный в Примере 7, был трансформирован плазмидой pRHTA3 или вектором pAYCTER3 с получением штаммов AJ13732 guaA::Tn10(pMWKQ, pRHTA3), AJ13732 guaA::Tn10(pMWKQ, pAYCTER3). Каждый из этих штаммов выращивался при 37° С в течение 18 ч в L-бульоне, содержащем 100 мг/л ампицилина и 75 мг/л канамицина. 0,3 мл полученной культуры было перенесено в 3 мл питательной среды для ферментации (см. Пример 3), содержащей 100 мг/л ампицилина и 75 мг/л канамицина, в пробирке 20× 200 мм и инкубировалось при 37° С в течение 48 ч на роторной качалке. После выращивания количество ксантозина, накопленное в среде, определялось методом ВЭЖХ, как описано выше. Результаты представлены в Таблице 5.
Как видно из Таблицы 5, амплификация гена rhtA улучшает продукцию ксантозина штаммом AJ13732 guaA::Tn10(pMWKQ).
Пример 10. Клонирование гена rhtA в вектор pLF14.
Основываясь на информации, полученной путем анализа геномной базы данных, были синтезированы 51-звенная затравка (SEQ ID NO:5) и 19-звенная затравка (SEQ ID NO:6).
Первая затравка содержит последовательность с 30 по 1 нуклеотид перед старт-кодоном гена рurЕ из В. subtilis и последовательность со старт-кодона по 21 нуклеотид гена rhtA из Е. coli. Последовательность с 30 по 1 нуклеотид перед старт-кодоном гена рurЕ содержит место связывания рибосомы из гена рurЕ вместе с соседними спейсерными участками. Вторая затравка является последовательностью, комплементарной последовательности с 122 по 105 нуклеотиды после стоп-кодона гена rhtA. ПЦР осуществляли при 94° С, 30 с; 55° С, 1 мин; 72° С, 2 мин; 30 циклов (Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) с использованием хромосомной ДНК из штамма Е. coli MG1655 в качестве матрицы. Полученный фрагмент ДНК, содержащий ген rhtA, слитый с местом связывания рибосомы из гена рur Е и его соседними участками из В. subtilis, был клонирован в вектор pGEM-T (Promega).
Затем указанная конструкция была переклонирована по сайтам SacI - SphI в мобилизуемый однорепликонный челночный вектор pLF14 (Shevelev et al., Plasmid, 43, 190-199, 2000), который может экспрессировать различные гены в клетках Bacillus под контролем промотора гена Каn. Полученная плазмида, pLF-RHTA (Фиг.5), была мобилизована из штамма Е. coli TG1 с помощью плазмиды RP4 в штамм В. subtilis 168. Будучи экспрессирован в клетках Bacillus, ген rhtA придавал им повышенную устойчивость к гомосерину в процессе роста на минимальной среде М9 (Таблица 6).
Культуры выращивались при 37° С в течение 44 часов на минимальной агаризованной среде, содержащей указанные концентрации гомосерина: + хороший рост, - отсутствие роста.
Пример-ссылка 1. Конструирование штамма В. subtilis KMBS 16 - продуцента инозина.
Штамм В. subtilis KMBS 16 - продуцент инозина, являющийся мутантом, содержащим инсерционно-делеционные мутации в генах purR, purA и deoD, был получен из штамма Bacillus subtilis 168 Marburg.
1) Конструирование мутанта В. subtilis, дефицитного по purR.
ПЦР осуществлялась при 94° С, 30 с; 55° С, 1 мин; 72° С, 1 мин; 30 циклов; (Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), с использованием хромосомной ДНК штамма В. subtilis 168 Marburg в качестве матрицы, и следующих олигонуклеотидных затравок №1 (SEQ ID NO:7) и №2 (SEQ ID NO:8), синтезированных в соответствии с последовательностью ДНК в геномном банке данных. Затравка №1 (28 звеньев) включает в себя последовательность с 246 по 228 нуклеотид перед старт-кодоном гена purR из В. subtilis (M. Weng, P.L. Nagy and H. Zalkin. Identification of the Bacillus subtilis pur operon repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995, 92:7455-7459), а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт НindIII, присоединенных к 5’-концу. Затравка №2 (28 звеньев) включает в себя последовательность с 57 по 75 нуклеотид после стоп-кодона гена purR, а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайтPstI, присоединенных к 5’-концу. Фрагмент, полученный в ходе ПЦР (0.9 т.п.о.) и обработанный HindIII и PstI, был вставлен по тем же сайтам рестрикции вектора pHSG398 (TaKaRa, Япония) с образованием плазмиды pHSG398BSPR. EcoRV - HincII фрагмент (0.3 т.п.о.) во внутренней части амплифицированного гена purR был удален из плазмиды pHSG398BSPR и замещен геном устойчивости к спектиномицину (1.2 т.п.о.) из Enterococcu faecalis, вырезанным из pDG1726 (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio).
Полученная плазмида pHSG398purR::spc была использована для трансформации компетентных клеток В. subtilis 168 Marburg, полученных методом Dubunau и Davidoff-Abelson (Dubnau, D. and R. Davidoff-Abelson. Fate of transforming DNA following uptake by competent Bacillus subtilis. J. Mol. Biol. 1971, 56:209-221). Двойные перекрестные мутанты были протестированы путем приготовления хромосомной ДНК из каждой колонии, устойчивой к спектиномицину, с последующей ПЦР, как описано выше. Одна из колоний, которая, как было подтверждено, является мутантом, дефицитным по гену purR, была названа KMBS4.
2) Конструирование мутанта В. subtilis, дефицитного по рurА.
ПЦР осуществлялась при 94° С, 30 с; 55° С, 1 мин; 72° С, 2 мин; 30 циклов (Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), с использованием хромосомной ДНК штамма В. sublilis 168 Marburg в качестве матрицы и следующих олигонуклеотидных затравок, №3 (SEQ ID NO:9) и №4 (SEQ ID NO:10), синтезированных в соответствии с последовательностью ДНК в геномном банке данных. Затравка №3 (29 звеньев) включает в себя последовательность с 137 по 118 нуклеотид перед старт-кодоном гена рurА из В. subtilis (P. 
and H. Zalikin. Cloning and sequence of Bacillus subtilis purA and guaA, involved in the conversion of IMP to AMP and GMP. J. Bacteriol. 1992, 174:1883-1890), а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт SolI, присоединенных к 5’-концу. Затравка №4 (29 звеньев) включает в себя последовательность с 51 по 70 нуклеотид после стоп-кодона гена риrА, а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт SphI, присоединенных к 5’-концу. Фрагмент, полученный в ходе ПЦР, (1.5 т.п.о.) и обработанный SalI и SphI, был вставлен по тем же сайтам рестрикции вектора pSTV28 (TaKaRa, Япония). Полученная плазмида pSTV28BSPA была расщеплена с помощью МluI и BglII, что привело к удалению внутреннего фрагмента длиной 0.4 т.п.о. из амплифицированного гена рurА, концы были затуплены с помощью фрагмента Кленова, затем в нее лигирован фрагмент гена устойчивости к эритромицину с затупленными концами (1.6 т.п.о.) из Staphylococcus anreus, вырезанный из pDG646 (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio).
Полученная плазмида pSTV28BSPA::erm была использована для трансформации компетентных клеток KMBS4, полученных методом Dubunau и Davidoff-Abelson, как описано выше. Двойные перекрестные мутанты были протестированы путем приготовления хромосомной ДНК из каждой колонии, устойчивой к эритромицину, с последующей ПЦР, как описано выше. Одна из колоний, которая, как было подтверждено, является мутантом, дефицитным по гену рurА, была названа KMBS13. Как и ожидалось, клетки KMBS13 были ауксотрофными по аденину.
3) Конструирование мутанта В. subtilis, дефицитного по deoD.
Для получения 5’-концевой части гена deoD и предшествующего ей участка из В. subtilis ПЦР осуществлялась при 94° С, 30 с; 55° С, 1 мин; 72° С, 1 мин; 30 циклов (Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), с использованием следующих олигонуклеотидных затравок, №5 (SEQ ID NO:11) и №6 (SEQ ID NО:12), синтезированных в соответствии с последовательностью ДНК в геномном банке данных. Затравка №5 (29 звеньев) включает в себя последовательность с 310 по 291 нуклеотид перед старт-кодоном гена deoD, а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт EcoRI, присоединенных к 5’-концу. Затравка №6 (28 звеньев) включает в себя последовательность с 39 по 57 нуклеотид после старт-кодона гена deoD, а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт ВаmHI, присоединенных к 5’-концу. Фрагмент, полученный в ходе ПЦР (0.4 т.п.о.) и обработанный EcoRI и BamHI, был вставлен по тем же сайтам рестрикции вектора pSTV28 (TaKaRa, Япония), что привело к получению плазмиды pSTV28DON.
Для получения 3’-концевой части гена deoD и последующего участка ПЦР осуществлялась при 94° С, 30 с; 55° С, 1 мин; 72° С, 1 мин; 30 циклов (Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), с использованием следующих олигонуклеотидных затравок, №7 (SEQ ID NO:13) и №8 (SEQ ID NO:14), синтезированных в соответствии с последовательностью ДНК в геномном банке данных. Затравка №7 (29 звеньев) включает в себя последовательность с 321 по 302 нуклеотид после стоп-кодона гена deoD, а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт HindIII, присоединенных к 5’-концу. Затравка №8 (28 звеньев) включает в себя последовательность с 24 по 42 нуклеотид перед стоп-кодоном гена deoD, а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт BamHI, присоединенных к 5’-концу. Фрагмент, полученный в ходе ПЦР (0.4 т.п.о.) и обработанный HindIII и BamHI, был вставлен по тем же сайтам рестрикции вектора pSTV28DON, что привело к получению плазмиды pSTV28DONC.
Для того чтобы амплифицировать ген устойчивости к канамицину из Streptococcus faecalis, ПЦР осуществлялась при 94° С, 30 с; 55° С, 1 мин; 72° С, 2 мин; 30 циклов (Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) с использованием ДНК-плазмиды pDG783 (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio) в качестве матрицы и следующих олигонуклеотидных затравок, №10 (SEQ ID NO:15) и №11 (SEQ ID NO:16), синтезированных в соответствии с последовательностью ДНК в геномном банке данных. Затравка №10 (33 звена) включает в себя последовательность с 513 по 490 нуклеотид перед старт-кодоном гена устойчивости к канамицину, а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт BamHI, присоединенных к 5’-концу. Затравка №11 (33 звеньев) включает в себя последовательность со 117 по 140 нуклеотид после стоп-кодона указанного гена, а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт ВаmHI, присоединенных к 5’-концу. Фрагмент, полученный в ходе ПЦР (1.5 т.п.о.) и обработанный ВаmHI, был вставлен по уникальному сайту рестрикции ВаmHII вектора pSTV28DONC. Полученная плазмида pSTV28deoD::kan была использована для трансформации компетентных клеток KMBS13, полученных методом Dubunau и Davidoff-Abelson, как описано выше. Двойные перекрестные мутанты были протестированы путем приготовления хромосомной ДНК из каждой колонии, устойчивой к канамицину, с последующей ПЦР, с использованием затравок №5 и №7, как описано выше. Одна из колоний, которая, как было подтверждено, является мутантом, дефицитным по гену deoD, (purR::spc purA::erm deoD::kan) была названа KMBS16.
Пример 11. Влияние амплификации гена rhtA на продукцию инозина штаммом В. subtilis - продуцентом инозина.
Плазмида pLF-RHTA и вектор pLFH были помещены в штамм В. subtilis KMBS16 - продуцент инозина. Так были получены штаммы В. subtilis KMBS16(pLF-RHTA) и В. subtilis KMBS16(pLF14). Каждый из этих штаммов выращивался при 37° С в течение 18 ч в L-бульоне, содержащем 10 мг/л хлорамфеникола, и 0,3 мл полученной культуры было перенесено в 3 мл питательной среды для ферментации Bacillus, содержащей 10 мг/л хлорамфеникола, в пробирке 20× 200 мм и инкубировалось при 37° С в течение 72 ч на роторной качалке.
Состав питательной среды для ферментации Bacillus (г/л):
Глюкоза 80.0
KH2PO4 1.0
MgSO4 0.4
FeSO4×7H2O 0.01
MnSO4×5H2O 0.01
Mameno-TN 1.35
DL-метионин 0.3
NH4Cl 32.0
Аденин 0.1
Триптофан 0.02
СаСО3 50.0
После выращивания количество инозина, накопленное в среде, определялось методом ВЭЖХ, как описано выше. Результаты представлены в Таблице 7.
Как видно из Таблицы 7, амплификация гена rhtA улучшает продукцию инозина штаммом В. subtilis KMBS16.
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения пуриновых нуклеозидов, таких как инозин и ксантозин, а также способ получения пуриновых нуклеотидов, таких как инозин-5'-фосфат, ксантозин-5'-фосфат и гуанозин-5'-фосфат, в качестве продуцентов используют штаммы бактерий, принадлежащих как к роду Escherichia, так и роду Bacillus, в которых продукция пуриновых нуклеозидов указанными бактериями увеличена за счет увеличения активности белка, кодируемого геном rhtA (ybiF). 8 н. и 9 з.п. ф-лы, 7 табл., 5 ил.
| WO 9903988, 28.01.1999 | |||
| Способ чистовой обработки шаров | 1982 |
|
SU1060428A1 |
| Способ получения пуринсодержащих соединений | 1977 |
|
SU675651A1 |
