ШТАММЫ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ SACCHAROMYCES SP. И PSEUDOMONAS SP., ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ БИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ, И АССОЦИАЦИЯ НА ИХ ОСНОВЕ Российский патент 2006 года по МПК C12N1/26 C12N1/20 C12N1/14 C12R1/38 C12R1/85 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды, водных стоков, а также для ликвидации аварийных разливов нефти.

Микроорганизмы природных экосистем являются важным звеном в самоочищении почв и водоемов от загрязнений, а также основой для разработки высокоактивных биопрепаратов для интенсификации этого процесса. Применение микроорганизмов в ассоциациях представляется более перспективным в связи с тем, что, обладая разными ферментными системами, они способны извлекать нефтепродукт из субстрата с большей эффективностью.

Известен штамм Rhodococcus species 56 Д, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов [1].

Недостатком данного штамма является медленная скорость роста и относительно низкий процент биодеструкции нефти (69,8%). Кроме того, использование монокультуры является менее эффективным в связи с ограниченностью спектра окисляемых углеводородов.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является консорциум штаммов дрожжей Candida maltosa для биодеградации нефтезагрязнений [2, прототип]. Консорциум утилизирует нефтезагрязнения при температуре до 41°С в широком диапазоне рН и может работать в засоленных экосистемах. При использовании консорциума для очистки воды содержание углеводородов нефти снижается на десятые сутки на 90%.

Недостатком данного штамма является относительно низкий показатель утилизации углеводородов за данный промежуток времени.

Технической задачей изобретения являлось получение новой ассоциации штаммов-нефтедеструкторов, характеризующейся высокой скоростью утилизации углеводородов за короткий промежуток времени в широком диапазоне рН среды и температур, в т.ч. пониженных (4-6°С); а также при повышенных концентрациях соли.

Поставленная задача решается применением штаммов Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. B-980 для утилизации углеводородов нефти.

Характеристика штамма Saccharomyces sp. Y-979. Штамм выделен из образца реликтового торфа, взятого на глубине 4-х метров (Васюганская низменность. Западная Сибирь, окрестность г.Нефтеюганск) на среде 8Е с нефтью (1.0%) в качестве единственного источника углерода, при температуре 23°С. Штамм хорошо растет на РПА и среде Сабуро, формирует белые, непрозрачные, блестящие, гладкие, пастообразные, выпуклые колонии с ровным краем. В жидкой среде образует равномерное помутнение, белый осадок и четко выраженное пристеночное кольцо. Диаметр колоний 2-3 мм. Клетки округлые, овальные, капсулированные, почки многосторонние. Размер клеток 4-6 мкм. Псевдомицелий, хламидоспор, баллистоспор не образует. Аски формируются из вегетативных клеток. Аскоспоры круглые по 1-4 в аске. Штамм У-979 является аэробом, факультативным анаэробом, его достоинством является способность к активному росту и нефтедеструкции в диапазоне температур от 4-6 до 35°С и рН среды 5.0-8.5 (оптимум роста достигается при температуре 23-28°С и рН среды 5.6-6.8). Штамм Y-979 не гидролизует крахмал, казеин, образует кислоту из лактозы, сахарозы, глюкозы; не сбраживает сорбит, мальтозу, рамнозу, манит; не разжижает желатин, способен к росту при концентрации NaCl до 10%; не обладает гемолитическими свойствами. Идентификация штамма проведена согласно руководству [3].

Характеристика штамма Pseudomonas sp. B-980. Штамм Pseudomonas sp. B-980 выделен при высеве на плотную среду 8Е с нефтью пробы воды озера Кротовая Ляга Новосибирской области. Штамм B-980 на плотных питательных средах образует белесые, полупрозрачные, блестящие, гладкие колонии с ровным краем; клетки штамма представляют собою грамотрицательные подвижные палочки размером 0.8×1.7-2 мкм. Штамм В-980 является аэробом, не гидролизует крахмал, казеин, не обладает протеолитической активностью, каталазоположительный, сбраживает глюкозу, лактозу, маннит, мальтозу, сахарозу, сорбит с газообразованием, не разжижает желатин. Обладает нитратной активностью, растет на РПА с концентрацией NaCl 5%; не обладает гемолитическими свойствами. Важной особенностью штамма В-980 является способность к росту и нефтедеструкции при диапазоне температуры от 4-6 до 35°С (оптимум роста - 22-30°С и значениях рН 6.5-7.5). Идентификация проведена согласно [4, 5].

Хранение штаммов осуществляется периодическими пересевами на косячках агаризованной минеральной среды 8Е с глюкозой (1%) и при низкотемпературном замораживании в 15% растворе глицерина [4]. Хранятся штаммы Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. В-980 в музее Научно Исследовательского Института, Коллекция Культур микроорганизмов Федерального Государственного Унитарного Предприятия Государственный Научный Центр Биотехнологии и Вирусологии "Вектор" (НИИ ККМ ФГУП ГНЦ ВБ "Вектор"). Справки о депонировании штаммов прилагаются.

Посевной материал получают при выращивании штаммов на жидкой или агаризованной среде 8Е.

Состав среды 8Е (г/л): (NH₄)₂HPO₄ - 1.5; КН₂РО₄ - 0.7; MgSO₄×7H₂O - 0.8; NaCl - 0.5; pH 7.2.

При выделении штаммов в качестве источника углерода к среде 8Е добавляют глюкозу (1%); для определения способности штаммов к деструкции - сырую нефть или нефтепродукт, добавленные по весу (до 0,5-2%).

Испытуемую культуру или ассоциацию микроорганизмов вносят в колбы со средой до концентрации 1×10⁷ кл/мл и инкубируют в течение 4-25 сут на термостатированной качалке при комнатной температуре.

Штаммы микроорганизмов-деструкторов Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. В-980, входящие в состав ассоциации, способны расти и утилизировать нефтепродукты в широком диапазоне температур (4-35°С), рН среды (4-8.5), повышенных концентрациях соли (NaCl до 7%). Соотношение штаммов в ассоциации 1:1.

Исследование способности к деструкции и биоэмульгации нефти штаммами Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. B-980 показывает, что штаммы Y-979 и В-980, использованные в опытах по отдельности, дают худшие результаты в сравнении с применением их для деструкции нефти совместно. Штамм В-980 с большей активностью эмульгирует пленку нефти, но отстает от штамма Y-979 по скорости роста. В случае штамма Y-979 наблюдается обратная картина: оптическая плотность среды была более 3.5 на третьи сутки, биоэмульгация также была интенсивной, но наблюдается неоднородность эмульсии, наличие небольших пристеночных фрагментов остаточной пленки нефти. Совместное использование штаммов позволяет ускорить и улучшить как процесс эмульгации, так и деструкции нефти (визуальный контроль оптической плотности среды и состояния пленки нефти в опытных и контрольных колбах, фиг.6). В опытах по деградации нефти эти штаммы использованы в ассоциации.

Стабильность используемых ассоциаций нефтедеструкторов контролируют микроскопически, высевая культуральную жидкость на плотную среду 8Е с глюкозой. Для количественных опытов отбирают ассоциации, где не наблюдают вытеснения одних штаммов другими. Наиболее стабильно сохраняются в условиях опыта сочетание штаммов Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. В-980. Посевной материал содержит штаммы Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. В-980 в соотношении 1:1 с небольшими колебаниями. Это же соотношение сохраняется в течение длительного времени культивирования. Однако следует заметить, что численность штамма В-980 уменьшается по сравнению с количеством клеток дрожжей при пониженных значениях рН примерно на треть, оставаясь при этом значительной.

Исследуют также наличие антагонистической активности штаммов ассоциации Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. В-980 относительно друг друга методом отсроченного антагонизма, [6]. Наличия зон лизиса или угнетения штаммов под воздействием друг друга не обнаружено.

Преимуществами ассоциации являются высокая степень деструкции углеводородов (до 93% за 4 сут) и способность расти на обедненной минеральной питательной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода нефть.

Исследованная ассоциация микроорганизмов-деструкторов предложена впервые, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии предлагаемой ассоциации критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

Фиг.1 - газовая хроматограмма хлороформного экстракта Васюганской нефти без добавления деструкторов (А) и после биодеструкции ассоциацией (Б) в течение 6 суток инкубирования при температуре 23°С и рН среды 5.0.

Фиг.2 - газовая хроматограмма хлороформного экстракта Васюганской нефти без добавления деструкторов (А) и после биодеструкции ассоциацией (Б) в течение 6 суток инкубирования при температуре 23°С, рН среды 7.0 и 5% концентрацией NaCl.

Фиг.3 - газовая хроматограмма хлороформного экстракта Васюганской нефти без добавления деструкторов (А) и после биодеструкции ассоциацией (Б) в течение 4 суток инкубирования при 23°С и рН среды 7.0.

Фиг.4 - газовая хроматограмма хлороформного экстракта Васюганской нефти без добавления деструкторов (А) и после биодеструкции ассоциацией (Б) в течение 4 суток инкубирования при температуре 4°С и pH среды 7.0.

Фиг.5 - газовая хроматограмма экстракта Васюганской нефти после биодеструкции ассоциацией (А) и без ее добавления (Б) в течение 20 суток при температуре 23°С и рН среды 7.0 (I - нафталин и его производные; II - антрацен и его производные).

Фиг.6 - визуальный контроль оптической плотности среды и состояния пленки нефти в опытных и контрольных колбах.

Далее следуют примеры конкретного применения заявляемой ассоциации.

Пример 1. Утилизация углеводородов при различных рН

Минеральную среду 8Е с разными значениями рН (5; 7; 8.5) разливают по 100 мл в качалочные колбы объемом 250 мл. Нефть вносят из расчета 1% (1 г). Суспензию клеток из ассоциации микроорганизмов вносят в колбы со средой до концентрации 1×10⁷ кл/мл и инкубируют в течение 6 сут на термостатированной качалке при комнатной температуре. Контролем служит минеральная среда 8Е с нефтью с разными значениями рН (5.0; 7.0; 8.5) без добавления штаммов микроорганизмов. Через 2 сут культивирования в опытных колбах наблюдают мощную биоэмульгацию, которая наиболее выражена при рН 7. Для остаточной нефти, содержащейся в среде с нормальным значением рН 7, анализ проводят на 4-ые сутки, для остальных - на 6-ые сутки.

Пробу культуральной жидкости после биодеструкции (15 мл), содержащую первоначально 30 мг нефти, количественно переносят в делительную воронку объемом 250 мл, экстрагируют хлороформом (2×50 мл, 2×40 мл, 1×10 мл). Хлороформные экстракты объединяют, упаривают на ротационном испарителе при температуре 30°С, количественно переносят хлороформом в мерную колбу объемом 50 мл, содержимое колбы доводят до риски хлороформом. Полученный образец используют для анализа.

Количественное определение содержания предельных углеводородов проводят методом капиллярной газовой хроматографии на приборе Varian 3600, оснащенном колонкой J & W Scientific DB-5, 30 м×0.22 мм, инжектором с делением потока (темп. 320°С), пламенно-ионизационным детектором (темп. 335°С), системой регистрации и обработки хроматографических данных (ChromStar, Bruker). В ходе анализа программируют изменение температуры колонки: 50°С - 2 мин, 50°С - 320°С - 15°С/мин, 320°С - 5 мин. Отнесение хроматографических пиков выполняют по времени удерживания с использованием калибровочного образца Boiling Point Calibration Sample #1, Hewlett Packard.

Штаммы, входящие в состав ассоциации, способны утилизировать нефть различных месторождений, отличающуюся фракционным составом. Степень деструкции изучали на примере легкой (Западная Сибирь: Меретояхинская), средней (Западная Сибирь: Сугмутская, Муравленковская, Спорышевская, Западно-Салымская, Холмогорская, Средне-Итурская, Романовская, Васюганская) и тяжелой нефти (Республика Коми: Усинская).

Деструкция н-алканов ассоциацией, включающей в свой состав штаммы Pseudomonas sp. B-980 и Saccharomyces sp. Y-979 (соотношение 1:1) исследована при трех значениях рН среды (5.0, 7.0, 8.5) и разной ее засоленности (0.5, 5.0. 7.0% NaCl). Для данной ассоциации оптимальным для утилизации н-алканов является рН 7, где степень деструкции достигает 93% за 4 сут. При рН 5 утилизация нефти составляет 87,07% (фиг.1), а при рН 8.5-68.7% (табл. 1) за 6 сут. Штаммы Pseudomonas sp. B-980 и Saccharomyces sp. Y-979, использованные индивидуально, утилизируют н-алканы с меньшей эффективностью

Таблица 1Утилизация углеводородов нефти в культуральной жидкости после биодеструкции ассоциацией штаммов микроорганизмов Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. B-980 при различных значениях рН средыУглеводородКол-во атомов углеродарН среды / количество утилизированных н-алканов (% от исходного количества)рН=5.0рН=7.0рН-8.5н-ДеканC10≈100≈100≈100н-УндеканС11≈100≈100≈100н-ДодеканС12≈100≈10099н-ТридеканС13≈1008983н-ТетрадеканС14819382н-ПентадеканС15688778н-ГексадеканС16959887н-ГептадеканС17748442н-ОктадеканС18667533н-НанодеканС19949586н-ЭйкозанС20978478н-ГенэйкозанС21878255н-ДокозанС22919883н-ТрикозанС23919790н-ТетракозанС24929482н-ПентакозанС25949647н-ГексакозанС26969466н-ГептакозанС27938661н-ОктакозанС28≈100≈10074н-НанокозанС29≈100≈100≈100н-ТриконтанС30≈100≈100≈100н-ГентриконтанС31≈100≈100≈100н-ДотриконтанС32≈100≈100≈100н-ТритриконтанС33≈100≈100≈100

Пример 2. Утилизация углеводородов при различных концентрациях соли (NaCl)

Минеральную среду 8Е с разными значениями концентрации NaCl (0,5; 5,0; 7,0%) разливают по 100 мл в качалочные колбы объемом 250 мл. Нефть вносят из расчета 1% (1 г). Суспензию клеток из ассоциации микроорганизмов вносят в колбы со средой до концентрации 1×10⁷ кл/мл и инкубируют в течение 6 сут на термостатированной качалке при комнатной температуре. Контролем служит минеральная среда 8Е с нефтью и разными значениями концентрации NaCl (0.5; 5.0; 7.0%) без штаммов микроорганизмов. Через 2 сут в опытных колбах наблюдают активную биоэмульгацию. Анализ остаточной нефти, предварительно экстрагируемой из среды хлороформом, проводят после 6 суток культивирования с помощью газового хроматографа Varian 3600. При повышенных концентрациях соли степень биодеструкции остается значительной: при 5% NaCl степень утилизации достигает 75.7% (фиг.2), при 7% NaCl - 70% (табл. 2).

Пример 3. Утилизация углеводородов при различных температурах

Минеральную среду 8Е разливают по 100 мл в качалочные колбы объемом 250 мл. Нефть двух различных месторождений (Васюганского и Усинского, отличающуюся более тяжелым фракционным составом) вносят в разные колбы из расчета 1% (1 г). Суспензию клеток ассоциации микроорганизмов вносят в колбы со средой до концентрации 1×10⁷ кл/мл и инкубируют в течение 6 суток на термостатированной качалке при комнатной температуре (23-24°С) и при пониженной (4-6°С). Контролем служит минеральная среда 8Е с нефтью без штаммов микроорганизмов. Уже через двое суток в опытных колбах наблюдают активную биоэмульгацию. Анализ остаточной нефти, предварительно экстрагируемой из среды хлороформом, проводят после 6 суток культивирования с помощью газового хроматографа Varian 3600. Утилизация углеводородов при 23-25°С Васюганской нефти составляет 93%, Усинской - 90.8%. При 4-6°С деструкция Васюганской нефти достигает 79.86%, Усинской - 62.4% за 6 сут (табл. 3, фиг.3, 4).

Таблица 2Утилизация н-алканов при различных значениях концентрации NaCl ассоциацией штаммов Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. B-980УглеводородКол-во атомов углеродаКонцентрация NaCl / количество утилизированных н-алканов (% от исходного количества)0,5% NaCl5% NaCl7% NaClн-ДеканC10100100100н-УндеканС11100100100н-ДодеканС1210078100н-ТридеканС13897444н-ТетрадеканС14937554н-ПентадеканС15877161н-ГексадеканС16989074н-ГептадеканС17845446н-ОктадеканС18754630н-НанодеканС19958694н-ЭйкозанС20849089н-ГенэйкозанС21828589н-ДокозанС22989595н-ТрикозанС23978392н-ТетракозанС24949384н-ПентакозанС25967673

н-ГексакозанС26947667н-ГептакозанС27867271н-ОктакозанС281007487н-НанокозанС291006465н-ТриконтанС301006356Н-ГентриконтанС311006949Н-ДотриконтанС32100100100н-ТритриконтанС33100100100Таблица 3Утилизация н-алканов при различных значениях температуры ассоциацией штаммов Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. B-980УглеводородКол-во атомов углеродаТемпература культивирования / количество утилизированных н-алканов (% от исходного количества)Васюганская нефтьУсинская нефть4-6°С23-25°С4-6°С23-25°Сн-ДеканC10100100100100н-УндеканС115810038100н-ДодеканС127510052100Н-ТридеканС1375895789Н-ТетрадеканС1496935293н-ПентадеканС1599876368н-ГексадеканС1696987698н-ГептадеканС1768846684Н-ОктадеканС1859751375Н-НанодеканС1994958795н-ЭйкозанС2096849294н-ГенэйкозанС2193829792н-ДокозанС2287989298н-ТрикозанС2386979797

н-ТетракозанС24919410094Н-ПентакозанС2586968096н-ГексакозанС2689947994н-ГептакозанС2787867186н-ОктакозанС288310055100н-НанокозанС297310044100н-ТриконтанС305310048100н-ГентриконтанС316310045100Н-ДотриконтанС324610033100н-ТритриконтанС3310010046100

Пример 4. Деструкция ди- и триароматических углеводородов (нафталина и антрацена с производными)

Минеральную среду 8Е разливают по 100 мл в качалочные колбы объемом 250 мл. Нефть Васюганского месторождения вносят в колбы из расчета 1% (1 г). Суспензию клеток из ассоциации микроорганизмов вносят в колбы со средой до концентрации 1×10⁷ кл/мл и инкубируют в течение 6 сут на термостатированной качалке при комнатной температуре (23-24°С). Контролем служит минеральная среда 8Е с нефтью без штаммов микроорганизмов. Через 2 сут в опытных колбах наблюдают мощную биоэмульгацию. На 20-ые сутки проводят анализ остаточной нефти, предварительно экстрагируемой из среды хлороформом, с помощью милихрома А - 02 (фиг.5). Утилизация нафталина и антрацена с производными составляет 50% за 20 сут.

В результате проведенных опытов можно констатировать весьма высокую степень биодеструкции углеводородов нефти как среднего, так и тяжелого фракционного состава ассоциацией штаммов Saccharomyces sp. Y-979 и Pseudomonas sp. B-980 (до 93% за 4 сут).

ЛИТЕРАТУРА

1. Патент РФ №2101352 "Штамм Rhodococcus sp. 56д, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов", C 12 P 1/20, опубликован 30.11.1998.

2. Патент РФ №2114174 "Консорциум дрожжей Candida maltosa для биодеградации загрязнений", С 12 Р 39/00, опубликован БИ №18, 98.

3. И.П.Бабьева, В.И.Голубев. "Методы выделения и идентификации дрожжей"/М.: Пищевая промышленность, 1976.

4. Методы общей бактериологии /под ред Ф.Герхарда и др. - М.: Мир, 1983. - С.528.

5. "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology". 8th ed., V.1-2. / Ed. John G. Holt, - Baltimore-London, Williams and Wilkins, 1986, 1105 p.

6. Лебедева М.Н. / Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии. Москва, Медицина, 1973. С.100-101.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды, водных стоков, а также для ликвидации аварийных разливов нефти. Штаммы, входящие в состав ассоциации, способны утилизировать нефть различных месторождений, отличающуюся фракционным составом. Штаммы микроорганизмов-деструкторов Saccharomyces sp. и Pseudomonas sp., входящие в состав ассоциации, способны расти и утилизировать нефтепродукты в широком диапазоне температур (4-35°С), рН среды (4-8,5), повышенных концентрациях соли (NaCl до 7%). Преимуществами ассоциации являются высокая степень деструкции углеводородов и способность расти на обедненной минеральной питательной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода нефть. 3 н.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл.

1. Штамм дрожжей Saccharomyces sp. Y-979 НИИ ККМ ГНЦ ВБ "Вектор" для биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды.2. Штамм бактерии Pseudomonas sp. B-980 НИИ ККМ ГНЦ ВБ "Вектор" для биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды.3. Ассоциация штаммов дрожжей Saccharomyces sp.Y-979 и бактерии Pseudomonas sp.B-980 НИИ ККМ ГНЦ ВБ "Вектор" для биоремедиации нефтезагрязненных объектов окружающей среды.