ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS ALCALIGENES E7, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12N1/20 C12R1/38 

Изобретение относится к области микробиологии и касается получения нового штамма бактерий, который может быть использован для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.

Известен штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa PAO, содержащий плазмиды Cam, Oct, Nah, Sal, которые утилизируют отдельные углеводороды из состава нефти (патент США N3813316, кл. 195 - 28, 1974 г.). Недостатком его является нестабильность и потеря плазмид из клеток бактерий.

Известны штаммы Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus (A.c. SU N 1493666 - A1, 1987 г), Flavobacterium tirrennicum (A. c. SU N 1409594, 1988 г.), которые могут разлагать углеводороды нефти. Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что они осуществляют деструкцию нефтепродуктов только в воде и не способны осуществлять очистку почвы от нефти.

Известны штаммы Acinetobacter sp. HB - 1 (патент RU N 2077579, 1994 г.) и Acinetobacter sp. JN - 2 (патент RU 2064017 1993). Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть только при высоких температурах.

Наиболее близким к предлагаемому является штамм бактерий Pseudomonas putida 36 (а.с. СССР N 1076446, C 12 N 15/00, 1984 г.), обладающий высокими характеристиками по биодеградации нефти и нефтепродуктов. Однако недостатком этого штамма является то, что он утилизирует нефтепродукты лишь на 30 сутки при сравнительно высокой температуре (28 - 30^oC).

Задачей изобретения является получение штамма бактерий, обладающего высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам в относительно короткие сроки в различных диапазонах температур, который может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтепродуктами и солями тяжелых металлов.

Предлагаемый штамм Pseudomonas alcaligenes E7 выделен из нефтезагрязненной почвы Архангельской области. Штамм депонирован Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов, коллекционный номер ВКПМ В - 7527.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Грамотрицательные подвижные палочки 2 - 3 x 0,6 мкм. На мясо-пептонном агаре (МПА) образуются плоские, прозрачные колонии диаметром до 5 мм. В мясо-пептонном бульоне (МПБ) растет в виде пленки и равномерного помутнения.

Культура растет на минеральной среде, используя в качестве единственного источника углерода нефть, нефтепродукты и отдельные углеводороды нефти.

Физиолого-биохимические признаки. Аэроб, оксидазоположительный, каталазоположительный, растет в температурном диапазоне от 8 до 41^oC, оптимум 28^oC. Источником углерода служат ацетат, цитрат, сукцинат, аланин, аргинин. Аргининдигидролаза есть, денитрификация отсутствует, восстанавливает нитраты. В дополнительных факторах роста не нуждается. Фенилаланин не дезаминирует, обладает слабой уреазной и лецитиназной активностью, растет на среде Симмонса. Гидролизует желатин, но не крахмал и поли- β- оксибутират.

Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный (проверка проведена на белых мышах).

Генетические особенности. Культура устойчива к пенициллину, рифампицину, олеандомицину. Устойчива к ионам тяжелых металлов: Mn(II), Pb, Zn, Mo, Fe - 100 мг/л, Cr(IV), Cr(VII) - 500 мкг/л, Hg - 5 мг/л. Устойчив к фенолу - 40 мг/л.

Условия хранения: в лиофилизированном виде в ампулах при 4^oC. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на минеральной среде 8E с нефтью и нефтепродуктами, а также на полноценной среде.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Pseudomonas alcaligenes E7 выращивают на минеральной среде 8E следующего состава, г/л: (NH₄)₂HPO₄, - 0,5; KH₂PO₄ - 0,7; NaCl - 0,5; MgSO₄ • 7H₂O - 0,8; дистиллированная вода - 1 л; pH 7,2. В качестве единственного источника углерода добавляют 1% ксенобиотика. В колбочке на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среде и отдельно в каждую колбочку 300 мг нефти, мазута и керосина. Колбочки засевают клетками предлагаемого штамма до концентрации 1•10⁷ кл/мл. Аналогично засевают колбочки с каждым отдельно нефтепродуктом клетками штамма P. putida 36. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтепродуктом и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторностях. Колбы культивируют на качалке при 200 об/мин, 28^oC в течение 10 дней. Биодеградацию определяют на газовом хромотографе. Данные эксперимента представлены в таблице 1 и показывают, что предлагаемый штамм уже на пятый день при 28^oC утилизирует нефть, мазут и керосин соответственно на 69,0%, 41,0%, 85,0%.

Пример 2. Предлагаемый штамм выращивают аналогично примеру 1, только культивирование проводят при 20^oC. Результаты представлены в таблице 1.

Пример 3. В колбочки на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среды 8E и 1% смеси углеводородов нефти (нафталин, тетрадекан, пентадекан, гексадецен, фенилдекан, пристан). Колбы инфицируют исследуемой культурой в концентрации 1•10⁷ кл/мл. Контрольную колбу оставляют неинфицированной. Культивирование проводят на качалке при 200 об/мин, 20^oC в течение 5 дней. Обработку результатов проводят на газовом хроматографе. Результаты показывают, что биодеградация указанных углеводородов прошла на 75,6%, 46,9%, 56,5%, 63,9%, 32,0% и 47,7% соответственно.

Пример 4. В колбы на 100 мл вносят по 30 мл минеральной среды E8, 300 мл нефти, 10 мг/л солей Mn, Pb, Zn, Mo, Fe, Hg и Cr - 50 мкг/л и клетки предлагаемого штамма до концентрации 1•10⁷ кл/мл. Контролем служит колба, в которую вносят нефть и клетки бактерий. Опыт проводят в трех повторностях. Культивируют колбы на качалке при 28^oC при 200 об/мин в течение 5 дней. Результаты опыта показывают, что в колбе с солями металлов и без них клетки предлагаемого штамма утилизируют нефть на 69%.

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он на пятые сутки утилизирует нефть, мазут и керосин при температуре 20 - 28^oC на 69 - 85%, а также углеводороды нефти. Штамм устойчив к ионам тяжелых металлов, что расширяет диапазон его применения при очистке территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

Выделен новый ютами бактерий Pseudomonas alcaligenes Е7 из нефтезагрязненной почвы Архангельской области, штамм депонирован в ВКПМ В-7527. Данный штамм утилизирует нефть, мазут, керосин, нафталин, пентадекан, тетрадекан, гексадецен, фенилдекан, пристан уже на 5-й день при температуре 20-30^oC. Штамм устойчив к фенолу, а также к ионам тяжелых металлов: Mn, Pb, Zn, Мо, Fe, Cr, Hg. Преимуществом данного штамма является эффективность утилизации нефти и нефтепродуктов (до 85%). 1 табл.

Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes Е7, депонирован в ВКПМ В-7527, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.