ШТАММ RHODOCOCCUS SPECIES 56Д, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологии и касается получения нового штамма бактерий, пригодного для очистки почвы, пресной и морской воды от нефти и нефтепродуктов в течение 7-14 суток, в широком диапазоне температур 12-30^oC.

Известен штамм Pseudomonas aeruginosa 123, несущий OCT, OAM, NAM плазмиды и используемый при биологической очистке воды от нефти и нефтепродуктов (авт. св. СССР 612958, кл.C 12 N 15/09).

Недостатком штамма является избирательность действия. Данный микроорганизм осуществляет только резорбцию нефтяной пленки и не способен к утилизации остаточной замазученности.

Широко применяется штамм Pseudomonas putida 36 (авт.св.СССР 1076446, кл. C 12 N 15/00), обладающий высокими характеристиками по биодеградации нефти и нефтепродуктов, однако этот штамм способен к утилизации нефти лишь при сравнительно высокой температуре 28-30^oC в течение длительного времени.

Наиболее близким к предлагаемому является штамм Rhodococcus erythropoeis BKM AC-1339D, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов [1] Однако этот штамм не используют для очистки загрязненной нефтепродуктами морской воды, а также не применяют в качестве биоэмульгатора нефти.

Предметом изобретения является получение штамма бактерий, обладающего биоэмульгирующей активностью и высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам в широком диапазоне температур 12-30^oC в относительно короткие сроки (7-14 суток).

Полученный штамм Rhodococcus species 56Д выделен из пробы или с территории нефтебазы, расположенной в Архангельской области. Штамм депонирован Центральной коллекцией микроорганизмов Государственного концерна "Биопрепарат". Регистрационный номер ЦКМ В-61Б.

Полученный штамм Rhodococcus sp 56д нетоксичен, развивается из посевного материала на минеральной среде, используя в качестве источника углерода углеводороды нефти и нефтепродуктов.

Полученный штамм характеризуется следующими морфологическими, культуральными и физиологическими признаками. В мазке видны грамположительные полиморфные палочки, при делении клеток наблюдается характерное расположение клеток под углом друг к другу. На мясопептонном агаре (МПА) через 48 ч появляются мелкие, шероховатые, нежно оранжевого цвета, пастообразной консистенции выпуклые колонки со складчатым центром. В мясопептонном бульоне (МПБ) наблюдаются легкое помутнение, осадок и образование пленки и пристеночного кольца при старении культуры.

Rhodococcus species 56д за исключением глюкозы не сбраживает и не окисляет углеводы. Использует в качестве источника углерода цитраты, малонаты, нитраты не восстанавливает, фенилаланин не дезаминирует. В дополнительных факторах роста микроорганизм не нуждается.

Предлагаемая культура каталозоположительна, оксидазоотрицательна, желатин не разжижает, обладает урезаной активностью, сероводород и индол не выделяет. Штамм является факультативным аэробом, развивается в широкотемпературном диапазоне от 10 до 37^oC с оптимумом 28^oC при pH 7,2.

В опытах на белых мышах штамм невирулентен и нетоксичен.

Культура хранится в лиофилизованном виде в ампулах при 4^oC. Жизнеспособность штамма можно поддерживать регулярным пересевом (1 раз в две недели) на МПА или МПБ, а также на минеральной среде 8E (NH₄)₂HPO₄ 1,5 г/л; KH₂PO₄ 0,7 г/л; NaCl 0,5 г/л; MgSO₄ 7 H₂O 0,8 г/л; pH 72), содержащий 0,1-0,5% нефти.

Способность предлагаемого штамма к биодеструкции нефти и нефтепродуктов изучали применительно к загрязненной морской и пресной воде, почве в широком диапазоне температур, о чем свидетельствуют следующие примеры.

Пример 1. Штамм Rhodococcus sp 56д выращивают в 250 мл колбах, содержащих 50 мл стерильной минеральной среды, приготовленной на водопроводной воде (содержащей 0,75 г/л двузамещенного фосфата аммония) или морской воде (3,5% морской соли). Стерильную нефть и нефтепродукты вносят по весу с точностью 0,05 мг, варьируя концентрацию субстрата от 0,5 до 1% Среды инфицируют двухсуточной культурой из расчета 10⁷ кл/мл и экспонируют колбы при 12^oC или 26^oC в течение 7-14 суток на качалке (80 об/мин). В качестве контроля используют неинфицированную колбу со средой нефтью или нефтепродуктами. По истечении срока инкубации долю утилизированного субстрата определяют весовым методом после экстракции нефтепродуктов хлороформом в опытной и контрольной колбах. Результаты опытов, проведенных при 26^oC и представленных в табл. 1, свидетельствуют о высокой эффективности очистки пресной (87,1%) и морской (75,1%) воды от нефтяного загрязнения. Очистка пресной воды от легких фракций нефти идет еще более эффективно и составляет для керосина 93,8% и дизельного топлива 98,8% Загрязнение мазутом снимается менее эффективно (52,8%). При понижении температуры до 12^oC эффективность очистки остается на достаточно высоком уровне применительно к таким субстратам как керосин 70,3% и дизельное топливо 65,5% но снижается для нефти (до 47,7%) и мазута 28,5% соответственно.

Пример 2. Опыт, имитирующий нефтяной розлив на поверхности воды, проводят в эксикаторах, наполненных 3 л пресной и морской воды. Размер нефтяного пятна составляет 490 см² 1 мм. Следует заметить, что толщина нефтяной пленки на колбочках (пример 1) не превышает 0,5 мм. Среду инфицируют двухсуточной культурой из расчета 1,8•10⁶ кл/мл и экспонируют при комнатной температуре 22^oC в течение 14 суток. По окончании эксперимента остатки субстрата экстрагируют хлороформом и определяют эффективность очистки нефтяного загрязнения. Как видно из табл. 1, эффективность очистки поверхности пресной и морской воды составила 68,85 и 69,2% соответственно.

Пример 3. Очистку замазученной почвы с помощью штамма Rhodococcus sp. 56д изучают следующим образом. В 100 мл колбы помещают по 20 г загрязненной почвы, увлажняют ее минеральной средой (0,75 г/л двузамещенного фосфата аммония), инфицируют двухсуточной культурой из расчета 10⁷ кл/г. В качестве контроля используют неинфицированные пробы. Колбы помещают в эксикатор с небольшим количеством воды на дне для поддержания влажной атмосферы и экспонируют при комнатной температуре (22^oC) в течение 14 суток. Долю утилизированного субстрата определяют весовым методом.

Концентрация нефтепродуктов в исходном образце почвы 0,5% а после очистки 0,18% Таким образом эффективность очистки почвы 67,5%
Пример 4. Способность штамма Rhodococcus sp. 56д к эмульгации углеводородов нефти изучают в следующих опытах. Штамм выращивают в 250 мл колбах, содержащих 25 мл стерильной среды. Состав среды: 4,8 г K₂HPO₄ 3 H₂O 1,5 г KH₂PO₄; 1 г (NH₄)SO₄ цитрата натрия; 2 г глюкозы, 0,1 г дрожжевого экстракта; 2 мг CaCl₂ 6 H₂O 0,4 мг MnCl₂ 4H₂O; 0,2 мг Na₂MnO₄ 2H₂O; 0,2 MgSO₄ 7H₂O на 1000 мл дистиллированной воды; pH 7,2.

Среду инфицируют агаровой культурой из расчета 10⁷ кл/мл, колбы экспонируют при 25^oC в течение 5 суток при дополнительной аэрации на качалке (100 об/мин). Наличие эмульгирующей активности определяют по методике, основанной на материалах статьи "A drop collapsing test for screening surfactant-producing microorganisms" (D.K.Jain, D.L.Collins-Thompson, H.Lee and J.T.Trevors Journal of microbiological methods. N 13, p. 271-279-1991). Культуральную жидкость (кж), дважды освобожденную от клеток, центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге типа G 2-21, фирма "Бекман", к 0,4 мл кж добавляют 3,5 мл 0,02 М трис буфера pH 7,0 и 0,08 мл гексадекана (C₁₆), смесь встряхивают вручную 10 с. По истечении 10 и 30 мин замеряют оптическую плотность (ОД) нижнего слоя при 540 нм. Контролем служит образец трис HCl буфера с гексадеканом. Разница между значениями ОД опытного и контрольного образцов указывает на наличие эмульгирующей активности.

Результаты опыта (табл.2) свидетельствуют об образовании стойкой эмульсии.

Таким образом предлагаемый штамм Rhodococcus sp. 56д демонстрирует высокую биодеструктирующую активность в отношении нефти и нефтепродуктов в условиях загрязнения почвы, пресной и морской воды, в широком диапазоне температуры (12-30^oC) в сравнительно короткие сроки (7-14 суток).

Согласно данным, представленным в табл.3, предлагаемый штамм по эффективности биодеструкции нефти и дизельного топлива не уступает своему аналогу Rhodococcus erythropoeis BKM AC-1339D.

Сопоставить способность к биодеструкции мазута и керосина не представляется возможным ввиду отсутствия в литературе данных.

Следует отметить, что патентуемый штамм в отличие от аналога пригоден для эффективной очистки от нефтепродуктов морской воды.

Кроме того, предлагаемый штамм Rhodococcus sp. 56д обнаруживает высокую эмульгирующую активность по отношению к углеводородам. Последнее обстоятельство выгодно отличает предлагаемый штамм от уже известных биодеструкторов нефти и позволяет расширить сферу его применения. Микроорганизм с биоэмульгирующей активностью может применяться при очистке загрязненных нефтепродуктами резервуаров, при добыче нефти для усиления отдачи пластов, а также в очистных сооружениях и при очистке промстоков.

Использование: микробиология, очистка почвы, пресной и морской воды от нефти и нефтепродуктов. Сущность изобретения: штамм бактерий Rhodococcus species 56Д выделен из пробы ила с территории нефтебазы, расположенной в Архангельской области, полученный штамм нетоксичен, развивается из посевного материала на минеральной среде, используя в качестве источника углерода углеводороды нефти и нефтепродуктов. 3 табл.

Штамм Rhodococcus species ЦКМ В-61Б (Центральная коллекция микроорганизмов Государственного концерна "Биопрепарат"), используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.