НОВЫЕ ПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ МАННАН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЛЕКТИНА ПРИ ЛЕЧЕНИИ ИММУНОКОМПРОМИСНЫХ ИНДИВИДУУМОВ Российский патент 2006 года по МПК A61K38/17 G01N33/48 A61P37/04 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к использованию субъединиц и олигомеров маннан-свзывающего лектина в процессе профилактики и/или лечения иммунокомпромиссных состояний индивидуумов.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Известно несколько групп лектинов, т.е. углеводород-связывающих белков. Одна группа это - лектины типа С. Лектины типа С содержат кальций-зависимые области распознавания углеводородов [1] (C-type CRD - carbohydrate recognition domain). Маннан-связывающий лектин, известный также как манноза-связывающий лектин, маннан-связывающий белок или манноза-связывающий белок, принадлежит к подгруппе лектинов типа С, названных коллектинами, так как эти растворимые белки состоят из субъединиц, представляющих три CRD, прикрепленных к коллагеновой ножке [2]. Маннан-связывающий лектин взаимодействует с углеводородами, представленными широким диапазоном микроорганизмов, и собранные данные показывают, что он играет важную роль в естественной иммунной защите [3]. При осуществлении связи с углеводородным маннан-связывающим лектином возможна активация комплементарной системы.

Комплементарная система может быть активирована тремя разными путями: классическим путем, альтернативным путем и описываемым в настоящей работе третьим путем - путем маннан-связывающего лектина, который осуществляется путем связывания маннан-связывающего лектина с углеводородами, поставляемыми микроорганизмами. Компоненты альтернативного пути и пути маннан-связывающего лектина являются частями генетически детерминированной иммунной защиты, которая также называется естественной или неклональной иммунной защитой, в то время как классический путь включает объединение с антителами специфической иммунной защиты [4].

Белок маннан-связывающего лектина человека состоит из идентичных полипептидных цепей молекулярной массой по 32 кДа каждая, общим числом до 18, в состав каждой из которых входит N-концевой сегмент из 21 аминокислоты, включая три остатка цистеина, за которыми следует 7 повторов коллагенового звена Gly-X-Y, прерываемых остатками Gln, за которыми следуют другие повторы из 12 звеньев Gly-X-Y. Небольшая область из 34 остатков соединяет С-концевой домен Са²⁺-зависимого лектина из 93 аминокислот с коллагеновой частью молекулы [28].

Коллагеновая область из трех полипептидных цепей объединяется в субъединицу, которая стабилизирована ковалентно с помощью дисульфидных связей. Отдельные субъединицы объединяются как с помощью дисульфидных связей, так и с помощью нековалентных взаимодействий [27].

Однако положение этих дисульфидных связей не совсем понятно. Анализ методом SDS-PAGE в среде маннан-связывающего лектина, не обладающей восстановительной способностью, показал зоны с молекулярной массой больше 200 кДа, предположительно представляющих блоки из 3, 4, 5 и даже 6 объединенных субъединиц [27].

Действительное число субъединиц в естественном белке маннан-связывающего лектина человека до сих пор оставалось проблематичным. В работе авторов Lipscombe и др. (1955 г.) при ультрацентрифугировании были получены данные, на основе которых можно предположить, что 25% маннан-связывающего лектина сыворотки человека состоят из 2-3 субъединиц и только небольшая доля состоит из 6 субъединиц. С помощью относительного количественного анализа, выполненного денситометрией вестерн-блотов, полученных хемилюминистцентным способом [27] с использованием метода SDS-PAGE на фракциях из ионообменной хроматографии, было найдено, что преобладающие виды цепей из субъединиц, ковалентно связанных маннан-связывающих лектинов, состояли из тетрамерных структур, в то время как комплемент активировался только пентамерными или гексамерными комплексами. В отличие от этого, анализ методом гельпроникающей хроматографии показал, что размер маннан-связывающего лектина сравним с размером комплекса Cl. Анализ методом гельпроникающей хроматографии может выполняться при условиях, предусматривающих исследования значимости слабых взаимодействий белка с белком при образовании молекул маннан-связывающего лектина. Содержание маннан-связывающего лектина во фракциях гельпроникающей хроматографии может определяться способами стандартного анализа маннан-связывающего лектина.

Маннан-связывающий лектин синтезируется в печени с помощью гепатоцитов и секретируется в кровь. Он соединяется с углеводородными структурами на бактерии, дрожжах, паразитных простейших и вирусах и проявляет антибактериальную активность путем уничтожения микроорганизмов с помощью активации компонентов концевого, лизирующего комплемента или путем стимулирования фагоцитоза (опсонизации). Структура «Sertiform» маннан-связывающего лектина абсолютно схожа с букетоподобной структурой Clq иммуноглобулин-связывающего субкомпонента первого компонента классического пути [3]. Clq объединяется с двумя протеазами серина Clr и Cls до образования комплекса Cl. Точно так же маннан-связывающий лектин объединяется с двумя протеазами серина MASP-1 [5] и MASP-2 [6] и с дополнительным белком, обозначаемым Map 19 [7]. Молекулярные структуры MASP-1 и MASP-2 идентичны молекулярным структурам Clr и Cls [6]. Связывание маннан-связывающего лектина с углеводородами вызывает активацию MASP-1 и MASP-2. Затем путем расщепления комплементов С4 и С2 протеаза серина MASP-2 вырабатывает конвертазу С3, С4bС2b. В отчетах предполагается, что MASP-1 может непосредственно активировать С3. Нет данных о стехиометрии и последовательности активации комплекса маннан-связывающий лектин/(протеаза, ассоциированная с маннан-связывающим лектином) (MASP - mannan-binding lectin associated proteases). Маннан-связывающий лектин также характерен и для других животных, например для грызунов, крупного рогатого скота, кур и обезьян.

Концентрация маннан-связывающего лектина в сыворотке человека является в значительной степени генетически детерминированной, однако, во время реакций острой фазы возрастает до пороговой величины [8]. При дефиците маннан-связывающего лектина [9] происходят три мутации, вызывающие структурные изменения, и две мутации в области промотора. Дефицит маннан-связывающего лектина связан с предрасположенностью ко множеству инфекций. При обследовании пяти взрослых индивидуумов с необычными и сильными инфекциями было обнаружено, что трое из них гомозиготны для структурных мутаций маннан-связывающего лектина и двое гетерозиготны [10]. Обследование 229 детей из Датского национального госпиталя по причине не-ВИЧ иммунодефицита показало десятикратное увеличение частоты гомозиготности для структурных аллеломорф мутанта маннан-связывающего лектина по сравнению с контрольной группой [11]. Аллотипирование 617 повторно госпитализированных детей в госпитале Св. Марии в Лондоне показало значительное увеличение частоты гомозиготности и гетерозиготности для аллотипов мутантов у инфицированных детей по сравнению с неинфицированными [12].

С маннан-связывающим лектином можно связывать широкий диапазон олигосахаридов. Как целевые сахара обычно не выделяются на поверхности клеток млекопитающих, так и маннан-связывающий лектин обычно не распознает самодетерминанты, но, в частности, хорошо подходит для взаимодействий с поверхностями микробных клеток, представляющих повторяющиеся углеводородные детерминанты. Ин-витро было показано, что маннан-связывающий лектин распознает дрожжи (Candida albicans и Cryptococcus neoformans), вирусы (ВИЧ-1, ВИЧ-2, ВПГ-2 (вирус простого герпеса) и различные виды гриппа типа А) и целый ряд бактерий. В случае каких-либо бактерий связывание с маннан-связывающим лектином ухудшается присутствием капсулы бактерии [13]. Однако даже инкапсулированная бактерия (Neisseria meningitidis) может показать сильную фиксацию маннан-связывающего лектина [14].

Микроорганизмы, которые инфицируют индивидуумов с дефицитом маннан-связывающего лектина, представлены различными типами организмов бактериального, вирусного и грибкового происхождения [12, 15-17]. Этот дефицит также оказывает влияние и на привычные выкидыши [18]. В действительности маннан-связывающий лектин может быть основной молекулой защиты от большинства бактерий и, таким образом, обеспечивать непатогенность многих бактерий.

Несмотря на то, что имеются данные по защитным действиям маннан-связывающего лектина, существуют также и наблюдения, на основе которых можно предположить, что инфицирование некоторыми микроорганизмами, особенно межклеточными патогенными организмами, происходит значительно чаще у индивидуумов с достатком, чем у индивидуумов с дефицитом маннан-связывающего лектина [19, 20]. Это согласуется с результатами экспериментов на животных, в которых в печени мышей с предварительной инъекцией маннан-связывающего лектина человека [21] было обнаружено повышенное содержание ВПГ-2.

Маннан-связывающий лектин клинического качества был получен из плазмы донорской крови и продемонстрировал безопасность для вливания крови [22]. При производстве рекомбинантного маннан-связывающего лектина были получены предположительно те же структура и активность, что и у нативного маннан-связывающего лектина (заявка на патент РА 1999 00668/С5/КН).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении рассмотрены способы применения маннан-связывающего лектина, очищенного от природных примесей или от материалов, получаемых путем рекомбинантных технологий, или с помощью любой другой клеточной линии, вырабатывающей маннан-связывающий лектин, для профилактики и/или лечения инфекций. Это состояние может сочетаться с терапевтическим лечением, например, с использованием цитотоксической терапии. Маннан-связывающий лектин может вводиться перед началом терапии или после нее и в течение любого промежутка времени, который считается подходящим.

Настоящее изобретение также относится к лечению индивидуумов с нормальным уровнем маннан-связывающего лектина, так как вероятно, что на этих индивидуумов введение маннан-связывающего лектина окажет благоприятное воздействие перед любой токсической обработкой клеток.

Таким образом, один из аспектов настоящего изобретения относится к лечению и/или профилактике инфекций у индивидуумов, страдающих от иммунокомпромиссных заболеваний, или к лечению индивидуумов, о которых известно, что они могут заразиться иммунокомпромиссными болезнями. Примерами такого лечения могут быть, например, химиотерапия и радиационная терапия, как, например, рентгенотерапия.

Химиотерапия и радиационная терапия предлагаются как часть лечения нескольких форм рака, направленного либо на замедление развития болезни, либо на обращение этого развития при применении терапии. Химиотерапия и радиационная терапия являются иммунокомпромиссными, так как при этом погибают клетки иммунной системы, что приводит к состоянию иммуносупрессии, которое характеризуется нейтропенией.

Антимикробная активность маннан-связывающего лектина проявляется, в основном, посредством его опсонизирующей активности (приготовление микроорганизмов для фагоцитоза). Эта активность зависит от активации комплемента после связывания маннан-связывающего лектина с поверхностью микроба и отложения комплементов С4b и С3b на микроорганизме. Маннан-связывающий лектин может также способствовать непосредственному уничтожению микроорганизма с помощью комплемента путем активации терминального литического пути комплемента и введения в мембрану мембраноатакующего комплекса. Этот механизм считается наименее важным. Многие микроорганизмы типа грамположительной бактерии, например, Streptococcus pneumonia, резистентны к мембраноатакующему комплексу, но могут уничтожаться с помощью опсонофагоцитоза. Опсонофагоцитоз считался главным эффекторным механизмом выведения микроорганизмов с помощью маннан-связывающего лектина, однако, неожиданно было обнаружено, что терапия с применением маннан-связывающего лектина может оказать благоприятное влияние на больных с дефицитом наиболее важных патогенных клеток, т.е. нейтрофилов.

Важность нейтропении при риске серьезных инфекций у индивидуумов с раком, принимающих цитотоксическую химиотерапию, была понята около 30 лет назад. Таким образом, инфекции возникали очень часто у гематологических и других раковых индивидуумов, подверженных химиотерапии и другим иммунокомпромиссным терапевтическим вмешательствам. Одновременно с применением интенсивной химиотерапии возрастают и проблемы инфекций, и теперь серьезно встает вопрос о поддерживающей терапии [24]. Поэтому гематологические и онкологические отделения используют все ресурсы для борьбы с инфекциями. Эта борьба постоянно становится все более трудной из-за появления мультирезистентных штаммов бактерий.

Индивидуумы, лишенные важных клеточных компонентов иммунной системы во время или после иммунокомпромиссных состояний, зависят от эффективной генетически детерминированной гуморальной иммунной системы типа системы комплемента, например, во время периодов нейтропении. Никакие достаточно точные и надежные прогностические факторы не способны в настоящее время предсказать возросший риск серьезных инфекций у индивидуумов, подвергаемых химиотерапии, радиационной терапии, или иммунокомпромиссному лечению [24].

Таким образом, иммунокомпромиссное состояние, возникающее из-за проведения терапии, вероятно, подвергает индивидуума повышенному риску инфекции. В соответствием с настоящим изобретением можно выполнять профилактику инфекции у индивидуума, находящегося в иммунокомпромиссном состоянии перед или во время терапии, вызывающей такое состояние. Путем профилактической терапии с помощью маннан-связывающего лектина перед или после терапии, вызывающей такое состояние, можно предотвратить последующую инфекцию или снизить риск заражения инфекцией из-за иммунокомпромиссного состояния. При заражении индивидуума инфекцией, например, при проведении терапии, приводящей к иммунокомпромиссному состоянию, можно также лечить инфекцию путем введения индивидууму состава по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также направлено на терапию состояний, связанных с подобными дефицитами, путем введения маннан-связывающего лектина. Кроме того, настоящее изобретение направлено также на использования величины концентрации маннан-связывающего лектина в плазме для прогнозирования риска возникновения инфекций у индивидуумов, проходящих, например, курс химиотерапии.

Другой аспект настоящего изобретения относится к использованию состава, включающего, по крайней мере, одну субъединицу маннан-связывающего лектина, или, по крайней мере, один олигомер, включающий, по крайней мере, одну субъединицу маннан-связывающего лектина при производстве профилактических или терапевтических препаратов от инфекций у индивидуумов с начальными уровнями содержания маннан-связывающего лектина в плазме, превышающими 50 нг/мл. В частности, индивидуум может быть предрасположен к дефициту маннан-связывающего лектина или приобрести такой дефицит, что приводит к повышенному риску инфекционных заболеваний. Таким образом, настоящее изобретение также относится к терапии инфекций у индивидуумов, страдающих от дефицита маннан-связывающего лектина, включая любой дефицит при выработке маннан-связывающего лектина и/или при функционировании маннан-связывающего лектина.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу оценки вероятности возникновения любой инфекции с явно выраженными клиническими симптомами у индивидуума, проходящего курс химиотерапии или любую другую форму иммунокомпромиссного лечения, при этом указанный способ включает этап измерения концентрации маннан-связывающего лектина в плазме или в сыворотке, взятой у индивидуума, и оценки вероятности на основе измеренной концентрации.

В настоящем контексте термин «иммунокомпромиссный» используется в его нормальном значении, т.е. относится к индивидууму, не способному вызвать адекватную иммунную реакцию из-за первичной или вторичной недостаточности, спровоцированной или не спровоцированной, в одном или большем числе элементов нормальной иммунной защитной системы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

До сих пор маннан-связывающий лектин применялся для лечения состояний, связанных с дефицитом маннан-связывающего лектина, который произвольно определялся уровнем его содержания в сыворотке ниже 50 нг/мл, или чаще всего уровнем содержания ниже 10 нг/мл, что часто соответствует чувствительности способов анализа пробы маннан-связывающего лектина, и поэтому этот уровень может устанавливаться как уровень, для которого, по существу, нельзя обнаружить содержание маннан-связывающего лектина ранее применяемыми способами.

В настоящем изобретении показано, что можно предотвратить инфекции и/или вылечить их у иммунокомпромиссных индивидуумов независимо от уровня содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке. В частности, инфекции у иммунокомпромиссных индивидуумов могут быть предотвращены путем введения маннан-связывающего лектина индивидуумам с уровнем содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке выше 50 нг/мл. Кроме того, индивидуумам с уровнем содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке выше 75 нг/мл может быть показано лечение, так же как и индивидуумам с уровнем содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке выше 100 нг/мл, и индивидуумам с уровнем содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке выше 150 нг/мл.

Кроме того, лечение инфекций с помощью маннан-связывающего лектина может проводиться путем введения этим индивидуумам маннан-связывающего лектина в сочетании с соответствующими антибиотиками, антивирусными или антигрибковыми препаратами.

В частности при риске возникновения иммунокомпромиссных состояний в результате проведенного курса лечения проводится профилактическое лечение маннан-связывающим лектином перед, во время и возможно после курса лечения для того, чтобы предотвратить болезни, связанные с возникновением иммунокомпромиссных состояний типа инфекций.

В общем, все иммунокомпромиссные или потенциально иммунокомпромиссные индивидуумы должны проходить лечение с применением маннан-связывающего лектина независимо от конкретного уровня содержания маннан-связывающего лектина у них в сыворотке. Это связано с тем, что инфекция может приводить к снижению уровня содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке, и поэтому изначальное увеличение уровня содержания маннан-связывающего лектина понизит риск снижения уровня содержания маннан-связывающего лектина ниже порога дефицита, и таким образом иммунная защита этих пациентов может усилиться путем введения рекомбинантного или природного маннан-связывающего лектина плазмы. В частности, при введении маннан-связывающего лектина можно предотвратить проникновение инфекции в организм индивидуума с уровнем содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке выше 50 нг/мл. Кроме того, индивидуумам с уровнем содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке выше 75 нг/мл может быть показано лечение, так же как и индивидуумам с уровнем содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке выше 100 нг/мл, и индивидуумам с уровнем содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке выше 150 нг/мл.

Авторы настоящего изобретения, в частности, показали, что терапия маннан-связывающим лектином в случае иммунокомпромиссных состояний оказывает благоприятное воздействие на индивидуумов с уровнем содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке ниже 500 нг/мл. Поэтому, в частности, такая терапия оказывает благоприятное воздействие на индивидуумов с уровнем содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке ниже 400 нг/мл, а также на индивидуумов с уровнем содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке ниже 300 нг/мл, а также на индивидуумов с уровнем содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке ниже 250 нг/мл, а также на индивидуумов с уровнем содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке ниже 200 нг/мл.

Таким образом, в предпочтительном варианте настоящего изобретения рассмотрен способ применения маннан-связывающего лектина при изготовлении лекарственных препаратов для индивидуумов с уровнем содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке в диапазоне от 50 до 500 нг/мл, так же как и в диапазоне от 100 до 500 нг/мл, для лечения и/или профилактики инфекций, в частности, в случае возникновения у индивидуума иммунокомпромиссных состояний.

Иммунокомпромиссное состояние может возникать у индивидуума в результате прохождения курса лечения с применением химиотерапии или другой иммуносупрессивной терапии, а также может провоцироваться лечением с применением стероидов, циклофосфамида, азатиоприна, метотриксата, циклоспорина, и/или рапамицина, в частности, в случае лечения рака.

Кроме того, иммунокомпромиссные состояния могут возникать в результате приобретенного иммунодефицита, типа СПИД или лейкоза, в частности, нейтропении или других вторичных иммунодефицитов.

Кроме того, терапия с применением маннан-связывающего лектина в случае профилактики инфекций, в частности хронических инфекций, оказывает благоприятное воздействие на индивидуумов с уровнем содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке выше 50 нг/мл и ниже 500 нг/мл.

Одна группа состоит из индивидуумов с низким уровнем содержания функционального маннан-связывающего лектина, которым показано лечение маннан-связывающим лектином для профилактики и/или лечения инфекций независимо от уровня содержания маннан-связывающего лектина как такового. Это вызвано тем, что для некоторых мутаций маннан-связывающего лектина было обнаружено, что хотя субъединицы и олигомеры маннан-связывающего лектина и экспрессируют в сыворотке, их функциональная активность низка. Функциональная активность маннан-связывающего лектина может быть оценена по его способности образовывать комплексы (маннан-связывающий лектин)/MASP, приводящие к активации системы комплементов. При расщеплении комплемента С4 комплексом (маннан-связывающий лектин)/MASP выделяется эфир тиола, и комплемент С4 образует ковалентную связь с ближайшими нуклеофильными группами. Таким образом, значительная часть комплемента С4b образует связи с лункой, покрытой пластиком, и может быть обнаружена антителом против комплемента С4.

Количественный анализ TRIFMA, используемый для определения функциональной активности маннан-связывающего лектина, включает следующие этапы: 1) нанесение слоя маннана на микротитровальные лунки из расчета 1 мг маннана на 100 мл буферного раствора; 2) блокировка с помощью Tween-20; 3) нанесение проб, например препаратов из разбавленного раствора маннан-связывающего лектина; 4) нанесение сыворотки с дефицитом маннан-связывающего лектина (это приводит к образованию комплекса (маннан-связывающий лектин)/MASP); в другом случае перед нанесением на поверхность микротитровальных лунок маннан-связывающий лектин и сыворотка с дефицитом маннан-связывающего лектина могут смешиваться; 5) нанесение фактора комплемента С4 концентрацией 5 мг/мл; 6) выдержка в течение одного часа при 37°С; 7) нанесение антитела против комплемента С4, меченого Eu; 8) нанесение усиливающего раствора; 9) считывание Eu с помощью временного флуоресцентного анализатора. Между каждыми двумя этапами пластина выдерживается при комнатной температуре и промывается, за исключением этапов 8 и 9.

Оценка с помощью метода ELISA может быть выполнена таким же образом, например, путем нанесения меченного биотином против комплемента С4 на этапе 7; 8) нанесения авидина, меченного щелочной фосфатазой; 9) нанесения субстрата; 10) считывания интенсивности цветов.

Функциональность может быть выражена удельной активностью маннан-связывающего лектина в виде единиц активности маннан-связывающего лектина на 1 нг маннан-связывающего лектина. Нефункциональный маннан-связывающий лектин может определяться как маннан-связывающий лектин с удельной активностью, составляющей менее 50% удельной активности маннан-связывающего лектина плазмы или менее 25% удельной активности маннан-связывающего лектина плазмы, при этом маннан-связывающий лектин плазмы отбирается у индивидуума, не страдающего какой-либо мутацией маннан-связывающего лектина. В частности, данный маннан-связывающий лектин плазмы относится к пулу плазмы LJ 6.57 28/04/97.

Таким образом, настоящее изобретение относится также к профилактике и/или лечению инфекции у индивидуумов с мутацией гена маннан-связывающего лектина, приводящей к снижению экспрессии маннан-связывающего лектина и/или экспрессии нефункционального маннан-связывающего лектина.

В частности такие мутации гена маннан-связывающего лектина могут приводить к изменению аминокислоты номер 52 (нумерация включает лидерный пептид маннан-связывающего лектина) - от аргинина до цистеина, аминокислоты номер 54 - от глицина до аспарагиновой кислоты, или аминокислоты номер 75 - от глицина до глутаминовой кислоты.

Кроме того, эти мутации в области промотора гена маннан-связывающего лектина могут приводить к понижению уровней содержания маннан-связывающего лектина.

Последовательность маннан-связывающего лектина можно найти в swiss.prot в дополнении №11226.

Состав маннан-связывающего лектина, применяемый для приготовления лекарственных препаратов на основе маннан-связывающего лектина, можно получить из любого доступного источника маннан-связывающего лектина. В качестве источника маннан-связывающего лектина может применяться природный маннан-связывающий лектин, при этом маннан-связывающие лектины вырабатываются нативным организмом хозяина, т.е. маннан-связывающий лектин вырабатывается клеткой, нормально экспрессирующей маннан-связывающий лектин. Один обычно применяемый способ получения состава маннан-связывающего лектина включает извлечение маннан-связывающего лектина из жидкостей человека, например из сыворотки или плазмы, хотя маннан-связывающий лектин можно выращивать из культур гепатоцитов.

В другим аспекте изобретения олигомеры маннан-связывающего лектина вырабатываются организмом хозяина, который ненативно экспрессирует полипепдит маннан-связывающего лектина, например, с помощью рекомбинантной технологии.

В первом варианте источником маннан-связывающего лектина может быть сыворотка, из которой получают состав маннан-связывающего лектина путем очистки от сыворотки, плазмы, молочных продуктов, молозива или тому подобного с помощью подходящих способов очистки, например аффинной хроматографии с использованием матриц, полученных из углеводородов, типа манноза- или маннан-связанных матриц. Этот способ описан в документе WO 99/64453, в котором за процессом очистки следует этап удаления вируса для того, чтобы удалить возбудителей инфекционной болезни из источника маннан-связывающего лектина, так как одной из главных проблем, связанных с белками, очищенными от жидкостей тела, является риск введения вместе с необходимым белком возбудителей инфекционных болезней. В списке литературы дается ссылка на WO 99/64453.

Желательно, чтобы состав маннан-связывающего лектина, применяемый для изготовления лекарственных препаратов на основе маннан-связывающего лектина, содержал олигомеры маннан-связывающего лектина, имеющие распределение размеров молекул, идентичное распределению размеров молекул маннан-связывающего лектина в сыворотке, например, чтобы кривая распределения размеров молекул, по крайней мере, на 50% совпадала с кривой распределения размеров молекул маннан-связывающего лектина в сыворотке. Это означает, что анализ методом SDS-PAGE и/или с помощью вестерн-блоттинга должен показать, что средняя молекулярная масса, по крайней мере, 50% олигомеров превышает 200 кДа.

В более предпочтительном варианте кривая распределения размеров молекул, по крайней мере, на 75% совпадает с кривой распределения размеров молекул маннан-связывающего лектина в сыворотке, еще лучше, чтобы кривая распределения размеров молекул, по крайней мере, на 90% совпадала с кривой распределения размеров молекул маннан-связывающего лектина в сыворотке, но лучше всего, чтобы кривая распределения размеров молекул, по крайней мере, на 95% совпадала с кривой распределения размеров молекул маннан-связывающего лектина в сыворотке.

Матрица может быть получена от любого углеводорода или смеси углеводородов, с которыми связан маннан-связывающий лектин, и для которых связывание высших олигомеров маннан-связывающего лектина является предпочтительным. Желательно, чтобы углеводородная матрица была матрицей, полученной от гексозы, типа манноза- или азот-ацетил-глюкозаминной матрицы, но самой лучшей является маннозная матрица.

Избирательность углеводородной матрицы обеспечивается тем, что матрица как таковая, т.е. непроизводная матрица, не имеет сходства с полипептидами маннан-связывающего лектина, в частности не имеет сходства с тримерами или более мелкими олигомерами маннан-связывающего лектина. Это обеспечивается тогда, когда матрица свободна от углеводородов. В частности, матрица не должна содержать сефарозу. Желательно, чтобы матрица состояла из полимерных материалов, не содержащих углеводородов, типа гранул Fractogel®TSK.

Матрица может иметь любую форму, подходящую для хроматографии, в большинстве случаев в виде гранул типа пластмассовых шариков.

После нанесения источника маннан-связывающего лектина колонка промывается, предпочтительно, с использованием буферных растворов, не проводящих к денатурации, состав, значение рН и ионная сила которых обеспечивают отсутствие белков без элюирования высших олигомеров маннан-связывающего лектина. В качестве буферного раствора может использоваться трис-забуференный солевой раствор. Выполняется элюирование маннан-связывающего лектина с помощью селективных десорбирующих веществ, способных к эффективному элюированию высших олигомеров маннан-связывающего лектина типа трис-забуференного солевого раствора, содержащих десорбирующее вещество типа ЭДТК (например, 5 мМ ЭДТК) или маннозы (например, 50 мМ маннозы), и затем олигомеры маннан-связывающего лектина собираются. Такой способ очитки описан в одновременно рассматриваемой международной заявке под названием «Рекомбинантный маннан-связывающий лектин человека», поданной в тот же день, что и настоящая заявка.

В предпочтительном варианте изобретения состав маннан-связывающего лектина клинического качества получают из источника маннан-связывающего лектина, производимого по рекомбинантной технологии, по которой источником маннан-связывающего лектина является культурная среда, выращенная из клеток, вырабатывающих маннан-связывающий лектин.

Таким образом, настоящее изобретение охватывает маннан-связывающий лектин, получаемый по технологии рекомбинантного маннан-связывающего лектина, включающей следующие этапы:

- приготовление структуры генной экспрессии, включающей последовательность ДНК, кодирующей полипептид маннан-связывающего лектина или его функциональный эквивалент;

- преобразование с помощью данной структуры культуры клетки-хозяина;

- выращивание культуры клетки-хозяина для получения таким образом экспрессии и выделение полипептида в культурную среду;

- получение культурной среды, включающей рекомбинантные маннан-связывающие лектины человека.

Затем для очистки маннан-связывающих лектинов культурная среда, включающая полипептиды рекомбинантных маннан-связывающих лектинов человека, может обрабатываться, как описано выше.

Желательно, чтобы в качестве полипептида маннан-связывающего лектина использовался полипептид маннан-связывающего лектина млекопитающего, еще лучше - полипептид маннан-связывающего лектина человека. Структуру экспрессии гена можно получить с помощью известных специалистам традиционных способов, описанных, например, в патенте США №5270199.

В другом варианте настоящего изобретения структура экспрессии гена приготавливается способом, описанным в датской заявке №PA 1999 00668 или в одновременно рассматриваемой международной заявке под названием «Рекомбинантный маннан-связывающий лектин человека», поданной в тот же день, что и настоящая заявка.

Желательно, чтобы экспрессия выполнялась, например, в клетках млекопитающего, при этом приготовление по настоящему изобретению основано на использовании вектора экспрессии, включающего последовательность (последовательности) интрона из гена маннан-связывающего лектина и, по крайней мере, одну последовательность экзона. Применительно к трансгенным животным термин «система экспрессии» в данном контексте относится к животным, которые были генетически модифицированны и содержат и экспрессируют ген маннан-связывающего лектина человека, или его фрагменты, или мимики.

Помимо способа очистки желательно, чтобы структура экспрессии гена и клетка хозяина также благоприятствовали получению высших олигомеров, что оказалось возможным при использовании структуры экспрессии гена, включающей, по крайней мере, одну последовательность интрона из гена маннан-связывающего лектина человека или его функционального эквивалента.

В частности, состав маннан-связывающего лектина применяется для лечения и/или профилактики инфекций, связанных с иммунокомпромиссным состоянием индивидуума. Любая микробная инфекция может быть вылечена и/или предотвращена с помощью маннан-связывающего лектина, т.е. любая инфекция, вызванная микробами.

Таким образом, состав маннан-связывающего лектина может применяться для профилактики и/или лечения инфекции иммунокомпромиссного индивидуума, вызванной грибком, дрожжами, простейшими и/или бактериями.

Кроме того, состав маннан-связывающего лектина может применяться для лечения инфекции, вызванной разновидностями микробов, резистентными, по крайней мере, к антибиотикам. Более важно обеспечить профилактику и/или лечение инфекций, вызванных мультирезистнтными разновидностями бактерий.

Иммунокомпромиссные индивидуумы могут страдать от инфекций, вызванных патогенными разновидностями бактерий, например Streptococcus pneumonia, и разновидности Salmonella и Staphylococcal.

Однако хорошо известно, что, в частности, иммунокомпромиссные индивидуумы также часто страдают от инфекций, вызванных разновидностями бактерий, которые обычно не являются патогенными, т.е. оппортунистически патогенные организмы; например, разновидности бактерий Е.coli. и многие из их разновидностей резистентны к обычному лечению антибиотиками.

Инфекция, связанная с иммунокомпромиссным состоянием, может также быть вирусной инфекцией, вызванной ретровирусом.

Кроме того, иммунокомпрмиссное состояние может быть причиной инфекции, вызванной ретровирусом ВИЧ. Однако обычно причиной вирусных инфекций лечение и/или профилактика которых проводятся в соответствии с настоящим изобретением является не ретровирус, а, например, вирус ДНК.

Лекарственный препарат можно получить при использовании элюанта, полученного с помощью аффинной хроматографии. Желательно, однако, чтобы элюант перед использованием подвергался очистке.

Помимо олигомеров маннан-связывающего лектина лекарственные препараты могут включать фармацевтически допустимые вещества-носители и/или транспортные средства. В частности, для стабилизации белков маннан-связывающего лектина могут дополнительно использоваться стабилизирующие препараты. В качестве стабилизирующего препарата можно использовать тиоспирт, сахариды, белки и/или аминокислоты. Примерами стабилизирующих препаратов могут служить мальтоза или альбумин.

В зависимости от вида ввода препарата к лекарственным препаратам могут добавляться другие традиционные добавки. В одном из вариантов изобретения лекарственные препараты применяются в виде инъекции. При этом могут применяться традиционные вещества-носители, например изотоническая соль.

В другом примере настоящего изобретения лекарственный препарат применяют при вдыхании, например, в виде порошка для ингаляции, или крема, или жидкости для локального нанесения.

Способы доставки могут быть разными, например внутривенно, внутримышечно, подкожно или внутрикожно. Кроме того, настоящим изобретением предусматривается применение через легкие или локально.

Состав маннан-связывающего лектина можно также вводить одновременно, последовательно с другой терапией или отдельно от нее, при этом другая терапия, например химиотерапия, может вызывать иммунокомпромиссное состоянию индивидуума. Лекарственные препараты могут вводиться в течение периода, предшествующего началу химиотерапии или во время, по крайней мере, какой-то части химиотерапии.

Состав маннан-связывающего лектина вводится соответствующими дозами, в частности производятся повторы через некоторые интервалы, например раз или два в неделю, перед началом химиотерапии, и этот курс проводится с интервалами, например, один раз в неделю, по крайней мере, во время части химиотерапии, но желательно во время всего периода химиотерапии.

Обычно одна доза составляет от 1 до 100 мг, или от 2 до 10 мг, желательно от 5 до 10 мг в зависимости от индивидуума, проходящего курс терапии, из расчета, например, 0,1 мг/кг массы тела.

Состав маннан-связывающего лектина может вводиться совместно с другими препаратами, например антигрибковыми, антидрожжевыми, антибактериальными и/или антивирусными препаратами.

В качестве антивирусных препаратов могут применяться препараты, способные подавлять и/или уничтожать вирус.

Настоящее изобретение также относится к способу применения меры уровня содержания маннан-связывающего лектина в качестве прогностического маркера риска инфицирования индивидуума, показывающего необходимость терапии. В частности, уровень содержания маннан-связывающего лектина ниже 500 нг/мл является прогностическим маркером, указывающим на необходимость терапии с применением маннан-связывающего лектина, в частности, для иммунокомпромиссного индивидуума или индивидуума, склонного к иммунокомпромиссному состоянию.

Прогностический маркер может применяться при любой инфекции, но особенно при сепсисе или пневмонии индивидуумов, проходящих иммунокомпромиссную цитотоксическую терапию.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу применения состава маннан-связывающего лектина для профилактики и/или снижения риска инфицирования индивидуума, при этом данный способ включает следующие этапы введения состава маннан-связывающего лектина индивидууму:

i) определение уровня содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке индивидуума;

ii) оценка вероятности возникновения инфекции у индивидуума с явно выраженными клиническими симптомами.

Уровень содержания маннан-связывающего лектина измеряется в сыворотке или плазме и может определяться методом TRIFMA (time resolved immunofluorescent assay), ELSA, RIA или нефелометрией.

Кроме того, уровень содержания маннан-связывающего лектина можно определить путем анализа генов маннан-связывающего лектина на генотипы, как описано выше для определения мутаций маннан-связывающего лектина, приводящих к понижению уровня содержания маннан-связывающего лектина.

Теперь можно считать, что рассмотрены и объяснены все аспекты настоящего изобретения. Ниже приводятся фигуры 1 и 2, которые иллюстрируют предпочтительные варианты настоящего изобретения.

ОПИСАНИЯ ФИГУР

На фигуре 1 изображено распределение концентраций маннан-связывающего лектина в плазме пациентов, больных лейкозом, которые подразделяются на пациентов с явно выраженными клиническими симптомами и инфицированных пациентов с неявно выраженными клиническими симптомами.

На фигуре 2 изображено распределение концентраций маннан-связывающего лектина в плазме пациентов, больных множественной миеломой, которые подразделяются на пациентов с явно выраженными клиническими симптомами и инфицированных пациентов с неявно выраженными клиническими симптомами.

ПРИМЕР

Следующий пример демонстрирует результаты исследования влияния дефицита маннан-связывающего лектина на возникновение инфекций в группе гематологических индивидуумов, проходящих химиотерапию, с явно выраженными клиническими симптомами.

ИССЛЕДОВАНИЕ НАСЕЛЕНИЯ

Исследовались последовательные группы пациентов отделения гематологии Университета Артура в Дании. Основная масса этих пациентов принимала химиотерапию. Среди пациентов было 7 человек с острым миеломным лейкозом, 17 с множественной миеломой, 11 с эритроцитозом, 13 с лимфомой не-Ходжкина, 1 с лимфомой Беркитта, 1 с макроглобулинемией Валденштрема, 5 с хроническим лимфоцитарным лейкозом, 3 с моноклональной гаммапатией неопределенного значения, 5 с лимфомой Ходжкина, 2 с хроническим миеломным лейкозом, 1 с острым лимфоцитарным лейкозом, 1 с аплазической анемией и 1 с миелофиброзом. Что касается группы пациентов с множественной миеломой, то все они принимали химиотерапию. Применялось три различных курса терапии; VAD: винкристин (0,4 мг на 24 часа) и доксорубицин (Адриамицин) (9 мг на 1 м² на 24 часа) при непрерывном вливании в течение 4 суток и дексаметазон (40 мг р.о.) в течение 4 суток с 1-го по 4-й день, с 9-го по 12-й день и с 17-го по 20 день каждого 28-дневного цикла; NOP: митоксантрон (10 мг на 1 м²) и винкристин (1,4 мг на 1 м²) при непрерывном вливании один раз и преднизон (2×50 мг, р.о.) каждый день каждого цикла; МР: мелфалан (0,25 мг/кг/сутки) вливанием в течение 4 суток и преднизон (2×50 мг, р.о.) в течение 4 суток.

Пациенты с инфекцией с явно выраженными клиническими симптомами (инфекция с явно выраженными клиническими симптомами определялась как бактериемия или пневмония) идентифицировались с помощью ретроспективных компьютерных исследований базы данных по пациентам. У 4-х пациентов из группы пациентов с множественной миеломой и с инфекцией с явно выраженными клиническими симптомам была пневмококковая пневмония, у 3-х - неспецифическая пневмония, у 1-го - пневмония, вызванная Staphylococus aureus.

Перед началом химиотерапии кровь откачивалась в вакуумные стеклянные трубки, содержащие ЭДТК (концентрация на заключительном этапе составляла 10 мМ). Плазма расслаивалась и хранилась при - 80°С до анализа. Таким же образом были получены пробы плазмы от здоровых доноров. Во время отбора проб крови пациенты не были инфицированы.

АНАЛИЗ НА МАННАН-СВЯЗЫВАЮЩИЙ ЛЕКТИН

Концентрация маннан-связывающего лектина определялась с помощью метода TRIFMA (time resolved immenofluorescent assay). Микротитровальные лунки (fluoroNunc, Nunc, Kamstrup, Дания) покрывались антителом против маннан-связывающего лектина человека из расчета 500 нг антитела (Mab 131-1, Институт сыворотки, Копенгаген, Дания) и 100 мкл забуференного фосфатного соляного раствора (0,14 М NaCl, 10 мМ фосфата, рН 7,4) и выдерживались в течение ночи при комнатной температуре. После промывки буферным раствором, содержащим Tween (трис-забуференный солевой раствор, 0,14 М NaCl, 10 мМ Tris/HCl, 7,5 мМ NaN₃, рН 7,4 с 0,05% Tween 20), в забуференный солевой раствор, содержащий Tween с избыточным NaCl до 0,5 М и 10 мМ ЭДТК, добавляются пробы (плазма 1/20) и калибратор.

После выдержки в течение ночи при 4°С и промывки в забуференный солевой раствор, содержащий Tween с 25 мкМ ЭДТК, добавлялось развиваемое антитело, меченное европием (12,5 нг Mab, 131-1, меченный хелатом, содержащим Eu, изотиоцианатобензоил- диэтилен-триамин-тетрауксусная кислота, в соответствии с техусловиями изготовителя - Wallac, Турку, Финляндия).

После выдержки в течение 2 ч и промывки добавлялся раствор, усиливающий флуоресценцию (Wallac), и с помощью флуорометра с временным разрешением (Delfia 1232, Wallac) происходило считывание пластины. Градуировочная кривая строилась с использованием разбавления плазмы, которая сохранялась расслоенной при -80°С. Концентрация маннан-связывающего лектина в этой плазме (3,6 мкг/мл) определялась путем сравнения с глубоко очищенным маннан-связывающим лектином, количество которого определялось с помощью количественного аминокислотного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Число индивидуумов с дефицитом маннан-связывающего лектина одинаково как среди гематологических пациентов, так и нормальных людей.

Существенно пониженный уровень содержания маннан-связывающего лектина наблюдался у гематологических пациентов с инфекцией с явно выраженными клиническими симптомами по сравнению с пациентами без инфекции с явно выраженными клиническими симптомами (фигура 1). Та же картина наблюдалась и у пациентов с множественной миеломой (фигура 2).

ОБСУЖДЕНИЕ

Путем определения случайного уровня дефицита (например, 50 нг/мл [18]) или с использованием наличия аллельных мутаций маннан-связывающего лектина по обеим хромосомам, как показано для дефицита в работах [11, 12], изучалась корреляция между дефицитом маннан-связывающего лектина и частотой инфекций. В исследовании пациенты сами определяли уровень, при котором клинические симптомы становились явными при уровне содержания маннан-связывающего лектина 500 нг на 1 мл. В разных группах пациентов был разный уровень содержания маннан-связывающего лектина, так же как и иммунологические параметры.

Из результатов, приведенных на фигурах 1 и 2, видно, что пациенты с содержанием маннан-связывающего лектина в плазме менее 500 нг/мл значительно сильнее подвержены инфекциям после химиотерапии. Этой группе пациентов во время курса химиотерапии должна быть предложена заместительная терапия с применением маннан-связывающего лектина. Этот курс можно начинать перед курсом химиотерапии и продолжать до тех пор, пока не нормализуются иммунологические параметры. Маннан-связывающий лектин должен готовиться из плазмы крови человека или по рекомбинантной технологии.

Очевидна явная польза от терапии с применением маннан-связывающего лектина для пациентов с формами рака, проходящих цитотоксическую терапию (химиотерапию или рентгенотерапию).

Из неопубликованных результатов исследований видно снижение содержания маннан-связывающего лектина после септицемии, и терапия с применением маннан-связывающего лектина может, таким образом, положительно изменять этот уровень у пациентов и впервые обеспечить нормальные уровни содержания маннан-связывающего лектина.

Продолжительность жизни пациентов с множественной миеломой составляет от нескольких месяцев до многих лет. Были предприняты попытки спрогнозировать параметры выживаемости для раковых больных, проходящих химиотерапию.

Представленные результаты исследований показывают, что содержание маннан-связывающего лектина является определяющим фактором при прогнозировании сепсиса после химиотерапии. Таким образом, как для прогнозирования выживаемости пациентов, проходящих химиотерапию, так и для пациентов, проходящих другие виды цитотоксической терапии, очень важно знать измеренные значения содержания маннан-связывающего лектина. Так как содержание маннан-связывающего лектина в плазме определяется генотипами генов маннан-связывающего лектина, то для оценки содержания маннан-связывающего лектина может косвенным образом применяться анализ генов маннан-связывающего лектина у индивидуумов.

В соответствии с литературными данными два исследования включали измерения содержания маннан-связывающего лектина у больных с опухолью. Авторы Aittoniemi и др. анализировали пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом на связь между дефицитом маннан-связывающего лектина и инфекциями [25]. Только шесть из 28 пациентов принимали химиотерапию, трое вместе с хлорамбуцил-[преднизолоном] и трое с хлорамбуцил-[преднизолоном] и цитофосфамид-(гидроксидаунорубицин)-онковин-преднизолоном. Дефицит маннан-связывающего лектина определялся как содержание маннан-связывающего лектина от предела обнаружения (<20 нг/мл) применяемого анализа на маннан-связывающий лектин. Только один из 28 пациентов был включен в группу с дефицитом маннан-связывающего лектина.

Связь между уровнем содержания маннан-связывающего лектина и уровнем инфекции у пациентов, принимающих химиотерапию, не анализировалась. Таким образом, на основе данного исследования нельзя делать какие-либо заключения относительно пунктов формулы настоящей заявки.

Авторы Lehrnbecher и др. проверили возможность использования уровней содержания интерлейкина-6, интерлейкина-8, С-реактивного белка крови, растворимого Фц-гамма рецептора типа III, или маннан-связывающего лектина в качестве индикатора серьезных инфекций у фебральных детей с опухолью и нейтропенией [26]. Всего было исследовано 56 детей с подтвержденной злокачественностью и нейтропенией, вызванной химиотерапией. В работе не были представлены измеренные уровни содержания маннан-связывающего лектина. Было только отмечено, что «уровни содержания маннан-связывающего лектина нельзя было использовать для того, чтобы отделить угрожающую жизни инфекцию от фебрального приступа без идентифицируемого источника или вероятных, связанных с катетером, бактериемий».

Изучаемая группа отличалась от той, которая представлена в настоящей заявке, все больные были детьми и 27 из них были включены по причине твердой опухоли, а не из-за лейкоза. Оставшиеся 29 больных лейкозом самостоятельно не анализировались. Не имея реальных данных, невозможно сравнивать эти исследования.

При терапии пациентов с нейтропенией и лихорадкой были использованы другие биологические и иммунологические препараты. Внутривенный иммуноглобулин не оказал благоприятного воздействия на профилактику лихорадки или инфекции у пациентов с нейтропенией, но может оказывать умеренное воздействие на пациентов с дефицитом антител. Гамма-интерферон может оказывать благоприятное воздействие на пациентов с некоторыми нейтрофильными недостаточностями, но это еще не до конца проверено. Фактор роста клеток (гранулоцитарный и гранулоцитарно-макрофагный колониестимулирующий фактор) может сократить продолжительность нейтропении и таким образом необходимость использования антибиотиков.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Weis Wl, Taylor ME and Drickamer К (1998). The C-type lectin superfamily in the immune system. Immunological Reviews 163: 19-34.

2. Holmskov, U., Malhotra, R., Sim, R.B., and Jensenius, J.C (1994). Collectins: collagenous C-type lectins of the innate immune defense system. Immunol. Today 15: 67-74.

3. Turner, M.W. (1996). Mannose-binding lectin: the pluripotent molecule of the innate immune system. Immunol. Today 17: 532-540.

4 Janeway CA, Travers P, Walport M and Capra JD (1999). Immunobiology, the immune system in health and disease. Fourth Edition, Churchill Livingstone.

5. Matsushita, M. and Fujita, Т (1992). Activation of the classical complement pathway by mannose-binding protein in association with a novel Cis-like serine protease. J.Exp.Med. 176: 1497-1502.

6. Thiel S, Vorup-Jensen T, Stover CM, Schwaeble W, Laursen SB, Pouisen K, Willis AC, Eggleton P, Hansen S, Holmskov U, Reid KB and Jensenius JC (1997). A second serine protease associated with mannan-binding lectin that activates complement. Nature, 386 (6624): 506-510,

7. Stover CM, Thiel S, Thelen M, Lynch NJ, Vorup-Jensen T, Jensenius JC and Schwaeble WJ (1999). Two constituents of the initiation complex of the mannan-binding lectin activation pathway of complement are encoded by a single structure gene. J. Immunol 162: 3481-3490.

8. Thiel S, Holmskov U, Hviid L, Laursen SB and Jensenius JC (1992). The concentration of the C-type lectin, mannan-binding protein, in human plasma increases during an acute phase response, Clin Exp Immunol 90: 31-35.

9. Madsen, H.O., Garred, P., Kurtzhals, J A., Lamm, L.U., Ryder, L.P., Thiel, S., and Svejgaard, A. (1994). A new frequent allele is the missing link in the structural polymorphism of the human mannan-binding protein. Immunogenetics 40: 37-44.

10. Summerfield JA, Ryder S, Sumiya M, Thursz M, Gorchein A, Monteil MA and Turner MW (1995). Mannose binding protein gene mutations associated with unusual and severe infections in adults. Lancet 345: 886-889.

11. Garred P, Madsen НО, Hofmann В and Svejgaard A (1995). Increased frequency of homozygosity of abnormal mannan binding protein alleles in patients with suspected immunodeficiency. Lancet 346: 941-943.

12. Summerfield JA, Sumiya M, Levin M and Turner MW (1997). Association of mutations in mannose-binding protein gene with childhood infection in consecutive hospital series. B/bMedJ 314: 1229-1232.

13 van Emmerik, LC, Kuijper, EJ, Fijen, CAP, Dankert, J, and Thiel, S (1994). Binding of mannan-binding protein to various bacterial pathogens of meningitis. Clin.Exp.lmmunol. 97: 411-416.

14. Jack DL, Dodds AW, Anwar N, Ison CA, Law A, Frosch M, Turner MW and Klein NJ (1998). Activation of complement by Mannose-binding lectin on isogenic mutants of Neissena meningitidis seroproup B. JImmuncil 160: 1346-1353.

15. Miller, M.E., Seals, J, Kaye, R. and Levitsky, L.C. (1968). A familial, plasma-associated defect ofphagocytosis. A new case of recurrent bacterial infections. The.Lancet. 60-63.

16. Super, M., Thiel, S., Lu, J., Levinsky, R.J., and Turner, M.W. (1989). Association of low levels of mannan-binding protein with a common defect of opsonisation. Lancet 2: 1236-1239.

17. Nielsen, S.L, Andersen, P.L, Koch, С., Jensenius, J.C., and Thiel, S. (1995). The level of the serum opsonin, mannan-binding protein in HIV-1 antibody-positive patients, din. Exp. Immunol. 100: 219-222.

18. Christiansen, O.B., Kilpatrick, D.C., Souter, V., Vanning, K., Thiel, S., Jensenius, J.C. (1999). Mannan-binding lectin deficiency is associated with unexplained recurrent miscarriage. Scand. J. Immunol., 49, 193-196.

19. Garred, P, Harboe, M, Oettinger, Т, Koch, С, and Svejgaard, A (1994). Dual role of mannanbinding protein in infections: Another case of heterosis ? Eur.J. Immunogen. 21: 125-131.

20. Hoal-Van Helden EG, Epstein J, Victor TC, Hon D, Lewis LA, Beyers N, Zura-kowski D, EzekowitzAB, Van Helden PD (1999). Mannose-binding protein В allele confers protection against tuberculous meningitis. PediatrRes 45: 459-64.

21. Fischer, PB, Ellerman-Eriksen, S, Thiel, S, Jensenius, JC, and Mogensen, SC (1994). Mannan-binding protein and conglutinin mediate enhancement of herpes simplex virus type-2 infection in mice. Scand J Immunol 39: 439-445.

22. Valdimarsson H, Stefansson M, Vikingsdottir T, Arason GJ, Koch C, Thiel S and Jensenius JC (1998). Reconstitution ofopsonizing activity by infusion of mannanbinding lectin (MBL)... .

24. Pizzo, PA (1993), Management of fever in patients with cancer and treatment-induced neutropenia, N Eng J Med, 328, 1323-1332.

25. Aittoniemi, J., Miettinen, A., Laine, S., Sinisalo, M., Laippala, P., Vilpo, L, Vilpo, J. (1999), Opsonising immunogiobulins and mannan-binding lectin in chronic lym-phocytic leukemia, Leuk Lymphoma Jul; 34 (34): 3815.

26. Lehrnbecher T, Venzon D, de Haas M, Chanock SJ, Kuhl J. (1999). Assessment of measuring circulating levels of interleukin6, interleukin8, Creactive protein, soluble Fc gamma receptor type 111, and mannosebinding protein in febrile children with cancer and neutropenia. Clin Infect Dis, Aug; 29 (2): 4149.

27. Lu, J., Thiel, S, Wiedemann, H., TimpI, R. & K.B.M. Reid (1990). Binding of the pentamer/hexamer forms of mannan-binding protein to zymosan activates the pro-enzyme Clr2ClS2 complex, of the classical pathway of complement without involvement ofClq. J. Immunol. 144: 2287-2294.

28. Sastry, К., Herman, G.A-, Day, L, Deignan, E., Bruns, G., Morton, C.C. & R.A.B. Ezekowitz (1989). The human mannose-binding protein gene. J. Exp. Med. 170: 1175-1189.

29. Lipscombe, R.J., Sumiya, M., Summerfield, J.A. & M.W. Turner (1995). Distinct physicochemical characteristics of human mannose-binding protein expressed by individuals of differing genotype. Immunology 85: 660-667.

Изобретение относится к использованию субъединиц и олигомеров маннан-связывающего лектина в процессе профилактики и/или лечения иммунокомпромиссных состояний млекопитающиего, которое, по крайней мере, обладает одним из следующих признаков: подвержено риску приобретения сниженного иммунитета в результате прохождения курса лечения или уровень содержания маннан-связывающего лектина (MBL) в сыворотке которого превышает 50 ng/ml и меньше, чем 500 ng/ml. При этом млекопитающему вводят терапевтически эффективную дозу медицинского препарата, включающего, по крайней мере, одну субъединицу или, по крайней мере, один олигомер MBL, который включает в себя одну субъединицу MBL. Способ позволяет снизить возможность развития инфекций у млекопитающего, подверженного риску снижения иммунитета, а также воздействовать на инфекционные агенты, резистентные к обычной терапии, у млекопитающих с указанным уровнем MBL в сыворотке крови. 42 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ лечения и/или профилактики инфекции у млекопитающего, которое, по крайней мере, обладает одним из следующих признаков: подвержено риску приобретения сниженного иммунитета в результате прохождения курса лечения, и/или уровень содержания маннан-связывающего лектина (MBL) в сыворотке которого превышает 50 ng/ml и меньше, чем 500 ng/ml, при этом млекопитающему вводят терапевтически эффективную дозу медицинского препарата, включающего, по крайней мере, одну субъединицу или, по крайней мере, один олигомер MBL, который включает в себя одну субъединицу MBL.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что медицинский препарат содержит, по крайней мере, один олигомер, включающий, по крайней мере, одну субъединицу маннан-связывающего лектина.3. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанный олигомер выбран предпочтительно из группы олигомеров, состоящих из тетрамеров, пентамеров и гексамеров.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что млекопитающее имеет сниженный иммунитет, и уровень содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке которого превышает 50 ng/ml.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что млекопитающее подвержено риску приобретения пониженного иммунитета в результате проведения курса лечения и уровень содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке которого превышает 50 ng/ml.6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное снижение иммунитета является нейтропенией.7. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное снижение иммунитета является аутоиммунной нейтропенией.8. Способ по п.1, отличающийся тем, что инфекция в основе своей имеет микробиологический характер.9. Способ по п.8, отличающийся тем, что возбудителями микробиологического инфицирования являются грибки.10. Способ по п.8, отличающийся тем, что возбудителями микробиологического инфицирования являются дрожжи.11. Способ по п.8, отличающийся тем, что возбудителями микробиологического инфицирования являются бактерии.12. Способ по п.11, отличающийся тем, что бактерии устойчивы, по крайней мере, к одному антибиотику.13. Способ по п.11, отличающийся тем, что бактерии мультиустойчивы к воздействию многих антибиотических медикаментов.14. Способ по п.11, отличающийся тем, что бактерии являются патогенными.15. Способ по п.1, отличающийся тем, что инфицирование имеет вирусный характер.16. Способ по п.15, отличающийся тем, что вирус является ретровирусом.17. Способ по п.16, отличающийся тем, что ретровирусом является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).18. Способ по п.1, отличающийся тем, что субъединица или олигомер маннан-связывающего лектина продуцирован в организме-хозяине.19. Способ по п.18, отличающийся тем, что организмом-хозяином является человеческая клетка, экспрессирующая единицу или олигомер маннан-связывающего лектина естественным путем.20. Способ по п.1, отличающийся тем, что субъединица или олигомер маннан-связывающего лектина продуцирован организмом-хозяином, не экспрессирующим полипептид маннан-связывающего лектина естественным путем.21. Способ по п.1, отличающийся тем, что субъединица или олигомер маннан-связывающего лектина продуцирован способом, включающим, по крайней мере, одним из этапов получение рекомбинантной ДНК ин витро.22. Способ по п.20, отличающийся тем, что получение субъединицы или олигомера маннан-связывающего лектина контролируется контролирующей экспрессию последовательностью, неприродно связанной с последовательностью, экспрессирующей полипептид маннан-связывающего лектина.23. Способ по п.18, отличающийся тем, что субъединица или олигомер маннан-связывающего лектина выделен из нативного организма-хозяина.24. Способ по п.20, отличающийся тем, что субъединица или олигомер маннан-связывающего лектина выделен из нативного организма-хозяина.25. Способ по п.23, отличающийся тем, что субъединица или олигомер маннан-связывающего лектина выделен способом, включающим, по крайней мере, одним из этапов применение аффинной хроматографии.26. Способ по п.24, отличающийся тем, что субъединица или олигомер маннан-связывающего лектина выделен способом, включающим, по крайней мере, одним из этапов применение аффинной хроматографии.27. Способ по п.26, отличающийся тем, что на этапе аффинной хроматографии выделяют тетрамеры, пентамеры, гексамеры MBL или их смесь из смеси, которая помимо них включает дополнительный олигомер MBL и/или его субъединицу.28. Способ по п.26, отличающийся тем, что субъединица или олигомер маннан-связывающего лектина или их смесь свободны от любых примесей, естественно связанных с маннан-связывающим пектином, когда он продуцирован в организме-хозяине.29. Способ по п.1, отличающийся тем, что субъединица маннан-связывающего лектина млекопитающего является субъединицей маннан-связывающего лектина человека.30. Способ по п.1, отличающийся тем, что медицинский препарат вводят млекопитающему, при этом он имеет более высокий результат терапевтического воздействия у млекопитающего со сниженным иммунитетом.31. Способ по п.1, отличающийся тем, что медицинский препарат вводят млекопитающему одновременно, сразу после или раздельно с курсом лечения, при этом указанный курс лечения оказался результативным у млекопитающего со сниженным иммунитетом.32. Способ по п.30, отличающийся тем, что медицинский препарат вводят млекопитающему перед, в течение или после указанного курса лечения.33. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное лечение - это профилактическое лечение.34. Способ по п.30, отличающийся тем, что указанный курс лечения - это химиотерапия.35. Способ по п.30, отличающийся тем, что указанный курс лечения - это радиационная терапия.36. Способ по п.1, отличающийся тем, что медицинский препарат является регулятором (бустер) сыворотки с уровнем содержания маннан-связывающего лектина у млекопитающего ниже предопределенного минимального уровня содержания маннан-связывающего лектина, равного 50 ng/ml.37. Способ по п.1, отличающийся тем, что уровень содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке млекопитающего превышает 75 ng/ml.38. Способ по п.1, отличающийся тем, что уровень содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке млекопитающего ниже 400 ng/ml.39. Способ по п.1, отличающийся тем, что уровень содержания маннан-связывающего лектина в сыворотке или плазме млекопитающего определен количественным анализом.40. Способ по п.39, отличающийся тем, что анализ включает, по крайней мере, ELISA, TRIFMA, RIA или нефелометрию.41. Способ по п.19, отличающийся тем, что получение субъединицы или олигомера маннан-связывающего лектина контролируется контролирующей экспрессию последовательностью, неприродно связанной с последовательностью, экспрессирующей полипептид маннан-связывающего лектина.42. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный медицинский препарат дополнительно содержит антимикробный препарат, эффективный против указанной инфекции.43. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед введением указанного медицинского препарата у указанного млекопитающего измеряют уровень содержания MBL в сыворотке, и его величина была выше 50 ng/ml.