СПОСОБ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2008 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения функциональной активности пектинового пути системы комплемента в сыворотке крови человека.

Система комплемента является частью врожденной иммунной системы и включает более 30 функционально связанных между собой сывороточных и мембранных белков, активирующихся по каскадному механизму. Эта система играет ключевую роль как в клиренсе иммунных комплексов, так и в иммунном ответе на инфекционные агенты, чужеродные антигены, опухолевые и вирус-инфицированные клетки. При активации комплемента, кроме того, генерируются биологически активные фрагменты, которые опосредуют воспалительные реакции, включающие лейкоцитарный хемотаксис, активацию макрофагов, нейтрофилов и тромбоцитов, тучных и эндотелиальных клеток, повышение сосудистой проницаемости и т.д. [Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология: Пер. с англ. М.: Мир, 2000-592 с.].

Система комплемента может активироваться тремя путями: классическим, альтернативным и пектиновым, отличающимися способом образования С3-конвертаз. Субстратом С3-конвертаз трех путей активации системы комплемента является компонент С3, при расщеплении которого образуются С3а и С3b. Присоединение дополнительных молекул С3b к С3-конвертазам приводит к образованию С5-конвертаз, которые запускают реакцию формирования мембраноатакующего комплекса (МАК).

Классический путь является Ca²⁺/Mg²⁺-зависимым каскадом, который в норме запускается иммунными комплексами путем активации С1, первого компонента комплемента, включающего одну молекулу C1q и по две молекулы С1 г и С1s субкомпонентов. Активация С1 компонента в результате связывания C1q-субкомпонента с Fc-фрагментом иммуноглобулинов иммунного комплекса и образования активных протеиназ С1r и С Is инициирует ферментативный каскад комплемента, приводящий к образованию С3-конвертазы классического пути (С4b, С2а) [Muller-Eberhard H.J. Complement // Ann. Rev. Biochem. - 1975. - V.44. - P.697-724].

Альтернативный путь является Mg²⁺-зависимым и активируется полисахаридами клеточных стенок дрожжей и бактерий и рядом биополимерных материалов. Фактор В, связываясь с иммобилизованными на поверхности активатора молекулами С3b, расщепляется фактором D, образуя С3-конвертазу альтернативного пути (С3b, Bb) [Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология: Пер. с англ. М.: Мир, 2000. - 592 с].

Лектиновый путь активации системы комплемента запускается при взаимодействии маннан-связывающего лектина (МСЛ) с углеводными структурами на поверхности бактерий, дрожжей, простейших, вирусов и апоптозных клеток (манноза, N-ацетилглюкозамин, фукоза, глюкоза), приводящем к активации МСЛ-ассоциированных сериновых протеаз 1, 2 и 3 (МАСП-1, МАСП-2), которые генерируют С3-конвертазу (С4b, С2а). Кроме того, МСЛ после связывания с патогенами способен напрямую запускать процесс фагоцитоза [Petersen et al. An assay for the mannan-binding lectin pathway of complement activation // J. Immunol. Methods. - 2001. - V.257. - P.107-116].

Дефицит МСЛ был описан как "общий опсонический дефект" [Miller et al. A familial, plasma-assotiated defect of phagocytosis // Lancet. - 1968. - P.60-63]. Общий опсонический дефект встречается у 5-8% относительно здоровых индивидуумов, который проявляется при оперативных вмешательствах и в послеродовом периоде. У детей раннего возраста дефицит МСЛ клинически проявляется воспалительными заболеваниями органов дыхания, которые могут перейти в сепсис или синдром системной воспалительной реакции [Turner M.W. The role of mannose-binding lectin in health and disease // Mol. Immunol. - 2003. - V.40. - P.423-429]. Дефицит МСЛ может быть как функциональным, так и абсолютным.

В настоящее время разработаны несколько способов определения содержания МСЛ в плазме крови. В тесте "МСЛ-антиген" в лунки иммунологической плашки с сорбированными анти-МСЛ антителами, добавляют разведенную плазму и количество связанного МСЛ определяют Eu-меченными анти-МСЛ антителами. "Тест МСЛ-антиген" является высокочувствительным в отношении общего содержания (2 нг МСЛ/мл), однако исследования сывороток более чем 10000 пациентов не выявили дефицита МСЛ [Thiel et al. Assay for the functional activity of the mannan-binding lectin pathway of complement activation // Immunobiol. - 2002. - V.205. - P.446-454]. Этот метод позволяет измерять общее содержание, но не функциональную активность МСЛ в сыворотках крови.

Известен способ оценки состояния иммунной системы организма человека путем определения активности комплекса маннан-связывающего пектина с МАСП-1 и 2 (МСЛ/МАСП), при котором в качестве лиганда используют дрожжевой маннан, сорбированный в лунках иммунологических плашек. Исследуемую плазму инкубируют в плашках в буфере, предотвращающем связывание C1q компонента классического пути активации комплемента, и после связывания комплекса МСЛ/МАСП с маннаном добавляют препарат очищенного компонента С4, после чего определяют количество иммобилизованных молекул С4b биотинилированными анти-С4 антителами. На завершающем этапе тестирования используют Eu-меченый стрептавидин [Thiel et al. Assay for the functional activity of the mannan-binding lectin pathway of complement activation // Immunobiol. - 2002. - V.205. - P.446-454]. Этим способом определяют только функционально активный МСЛ. Недостатком данного метода является длительность процедуры исследования, многостадийность и необходимость использования очищенного дорогостоящего препарата компонента С4 в качестве субстрата МАСП, что ограничивает его использование в рутинных исследованиях.

Наиболее близким техническим решением является способ оценки состояния иммунной системы организма человека по пектиновому пути на основе определения активности комплекса МСЛ/МАСП путем измерения потребления комплемента по продуктам его активации - С3а и С4а в плазме крови, содержащей этилендиаминотетрауксусную кислоту (ЭДТА) in vitro, по разности этих показателей до и после инкубации в течение 30 мин при 37°С [Hugli Т.Е., et at. US Patent №6,297,024-2001]. Недостатком данного способа являются трудоемкость и длительность процедуры исследования (2,5 часа), использование дорогостоящих и малодоступных для рутинных исследований моноклональных анти-С3а и анти-С4а антител.

Техническим результатом предлагаемого способа является расширение арсенала способов оценки состояния иммунной системы организма человека, упрощение, сокращение длительности процедуры исследования, а также его удешевление.

Этот результат достигается тем, что исследуемую сыворотку инкубируют 0 и 30 мин в буфере, содержащем ЭДТА, после чего добавляют эритроциты барана, сенсибилизированные антителами кролика, оттитрованное количество раствора Са²⁺ и Mg²⁺ для нейтрализации ЭДТА, дополнительно инкубируют, а показатели потребления комплемента определяют по степени лизиса эритроцитов. Показатели потребления комплемента до 30% оценивают как сниженную реакцию иммунной системы организма человека, от 30% до 70% как нормальную, а свыше 70% как повышенную.

Способ оценки состояния иммунной системы организма человека осуществляют следующим образом. Способ включает забор крови, приготовление сыворотки, проведение гемолитического теста и расчет функциональной активности пектинового пути.

Гемолитический тест проводят с использованием стандартизованных эритроцитов барана (1,5×10⁸ кл/мл), сенсибилизированных антителами кролика (ЕА), в вероналовом солевом буфере, содержащем 0,5 мМ MgCl₂ и 0,15 мМ CaCl₂ (VBS²⁺) и в вероналовом буфере, содержащем 10 мМ ЭДТА (VBSE), по стандартному методу [Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Меньшиков В.В., Делеторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др.: Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - 368 с.].

Пример 1. Определение потребления комплемента в сыворотках крови здоровых испытуемых при предварительной инкубации в условиях вероналового солевого буфера с добавлением 10 мМ ЭДТА (VBSE). 20 мкл сыворотки, разведенной 1:9, инкубируют в общем объеме 290 мкл, доведенном буфером VBSE, в течение 0 и 30 мин при 37°С. После инкубации в пробы добавляют по 200 мкл эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика (ЕА) и 10 мкл оттитрованного количества раствора Са²⁺ и Mg²⁺ для нейтрализации ЭДТА и продолжают инкубацию в течение 30 мин при 37°С. Реакцию останавливают добавлением 2,5 мл холодного раствора 0,15 М Nad, суспензию центрифугируют и определяют степень лизиса ЕА по величине оптического поглощения гемоглобина в супернатанте при длине волны 412 нм (A₄₁₂). Степень лизиса эритроцитов (У) определяют по формуле:

где Н, R и X - величины оптической плотности А₄₁₂ в геополитических системах при полном лизисе, в контроле спонтанного лизиса ЕА и в опытной пробе соответственно.

Потребление комплемента (ПК) в сыворотках определяют как разность показателей до и после инкубации по формуле:

где У(0') - степень лизиса ЕА до инкубации сыворотки, У(30') - степень лизиса ЕА после инкубации сыворотки в течение 30 мин в условиях буфера VBSE. Полученные данные приведены ниже (фиг.1).

Как видно на фиг.1, потребление комплемента в сыворотках крови контрольной группы колебалось от 30 до 70%. Потребление комплемента на уровне от 30 до 70% у здоровых испытуемых контрольной группы нами принято за показатель, который характеризует нормальное состояние иммунной системы организма человека.

Пример 2. Определение потребления комплемента в сыворотках больных с хроническим алкоголизмом. Были тестированы сыворотки 8 больных с хроническим алкоголизмом предлагаемым вышеописанным способом. Результаты представлены на фиг.2.

Как видно на фиг.2, у двух больных не определяется потребление комплемента, у трех показатель потребления комплемента ниже 30%, у двух в пределах нормальных величин (от 30% до 70%) и у одного больного выше 70%. Полученные результаты свидетельствуют о снижении реакции иммунной системы у 63% больных с хроническим алкоголизмом.

Пример 3. Определение потребления комплемента в сыворотках больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Были тестированы сыворотки 17 больных с заболеваниями сердечно-сосудистой системы предлагаемым вышеописанным способом.

Проведенные исследования показали, что у всех больных с сердечно-осудистыми заболеваниями наблюдается либо сниженное потребление комплемента либо полное его отсутствие (82% больных). Отсутствие потребления комплемента свидетельствует о функциональном иммунодефиците пектинового пути активации системы комплемента, который сопровождается нарушением опсонизации, фагоцитоза патогенов и апоптозных клеток в организме человека.

Пример 4. Определение потребления комплемента в сыворотках крови женщин с воспалительными заболеваниями матки и придатков. Предлагаемым вышеописанным способом были тестированы сыворотки 15 женщин с воспалительными заболеваниями матки и придатков. Результаты представлены на фиг.3.

Как видно на фиг.3, у 8 из 15 (73%) исследованных сывороток потребление комплемента колебалось от 76 до 97% (выше 70%), что свидетельствует об адекватной повышенной реакции иммунной системы организма на воспалительный процесс.

Преимущества предлагаемого способа перед известными заключаются в упрощении процесса, сокращении длительности процедуры исследования с 2 час 30 мин до 1 час 20 мин, а также его удешевлении. Данный способ оценки состояния иммунной системы организма человека позволяет выявлять доклинические состояния иммунодефицита, проводить углубленное исследование патогенеза аутоиммунных заболеваний, дает возможность их ранней профилактики и позволяет контролировать эффективность проводимой терапии.

Фиг.1Показатели потребления комплемента в сыворотках крови здоровых испытуемых (контрольная группа) до и после инкубации№сывороткиДо инкубации У(0'), %После инкубации У(30'), %ПК, % разность У(0') и У(30')110068322100623831005545410043575100574361003565710048528100307091003862101007030

Фиг.2Показатели потребления комплемента в сыворотках крови больных с хроническим алкоголизмом до и после инкубации№сывороткиДо инкубации У(0'), %После инкубации У(30'), %ПК, % разность У(0') и У(30')110059412100435731001000410094651007921610088127100100081001387

Фиг.3Показатели потребления комплемента в сыворотках крови женщин с воспалительными заболеваниями матки и придатков№сывороткиДо инкубации У(0'), %После инкубации У(30'), %ПК, % (разность У(0') и У(30')11001387210016843100595410025755100217961008927100188281002377910039710100247611100881212100287213100928141008515151008218

Изобретение относится к медицине, а именно к области клинической иммунологии. У пациентов определяют активность комплекса маннан-связывающего лектина с ассоциированными сериновыми протеазами путем измерения потребления комплемента сыворотки крови до и после инкубации в буферном растворе с добавлением этилендиаминотетрауксусной кислоты in vitro, которую нейтрализуют оттитрованным раствором Са²⁺ и Mg²⁺,^{добавляют эритроциты барана, сенсибилизированные антителами кролика, и повторно инкубируют. Показатели потребления комплемента определяют по степени лизиса эритроцитов: до 30% оценивают как сниженную реакцию иммунной системы организма человека, от 30% до 70% как нормальную, свыше 70% как повышенную. Использование простого и быстрого в осуществлении способа позволяет выявлять доклинические состояния иммунодефицита, проводить углубленное исследование патогенеза аутоиммунных заболеваний, дает возможность их ранней профилактики и позволяет контролировать эффективность проводимой терапии. 3 ил.}

Способ оценки состояния иммунной системы организма человека по лектиновому пути на основе определения активности комплекса маннан-связывающего лектина с ассоциированными сериновыми протеазами путем измерения потребления комплемента сыворотки крови в буферном растворе с добавлением этилендиаминотетрауксусной кислоты in vitro пo разности этих показателей до и после инкубации в течение 30 мин при 37°С, отличающийся тем, что в исследуемую сыворотку крови добавляют эритроциты барана, сенсибилизированные антителами кролика, и оттитрованное количество раствора Са²⁺ и Mg²⁺ дополнительно инкубируют, показатели потребления комплемента определяют по степени лизиса эритроцитов, при наличии показателей потребления комплемента до 30% оценивают как сниженную реакцию иммунной системы организма человека, от 30 до 70% как нормальную, свыше 70% как повышенную.