СПОСОБ ВЫБОРА МЕТОДА ЛЕЧЕНИЯ ТРОМБОЦИТОПАТИИ ПРИ МЕТАБОЛИЧЕСКОМ СИНДРОМЕ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/86 G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, к области кардиологии и гематологии, а именно к гемостазу, и может быть использовано для выбора способа коррекции тромбоцитопатии при метаболическом синдроме.

Известен способ диагностики тромбоцитопатий (Шитикова А.С. Алгоритм диагностики тромбоцитопатии высвобождения. // Казанский медицинский журнал, 1990, №3. - С.206-212), который позволяет достаточно полно диагносцировать тромбоцитопатию у различного контингента больных. Имеется способ Ермолаевой Т.А. и соавт. (1992) (Ермолаева Т.А., Головина О.Г., Морозова Т.В., Пономаренко В.М., Лубо-Лесинченко И.Ф. Программа клинико-лабораторного обследования больных тромбоцитопатиями. // Методические рекомендации. СПБ.: 1992. - 25 с.), позволяющий выявлять нарушения тромбоцитарных функций и судить о механизмах их развития при различных патологических состояниях. Однако в данных способах не предусматривается статистическая обработка всех полученных результатов с выражением общего агрегационного процесса одним числом и последующим назначением лечебного подхода в зависимости от полученных данных. На сегодняшний день аналогов способа дифференциального подхода к коррекции тромбоцитопатии у больных метаболическим синдромом не существует.

Целью изобретения является повышение адекватности выбора метода коррекции тромбоцитопатии у больных метаболическим синдромом с эффективным контролем терапии в динамике лечения.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что для исследования тромбоцитарного гемостаза у больных с метаболическим синдромом из локтевой вены берется кровь в несколько пробирок для исследования адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов, агрегации тромбоцитов (AT) на стекле с АДФ, коллагеном, тромбином, ристомицином, перекисью водорода, адреналином и различными их сочетаниями, определением внутрисосудистой активности тромбоцитов (ВАТ) и их ретрактильной функции с последующей обработкой полученных данных системным многофакторным анализом.

По полученным значениям общего агрегационного процесса каждому конкретному больному возможно индивидуальное назначение необходимого лечения тромбоцитопатии (гипокалорийная диета, физические тренировки, метформин или их сочетания).

Способ отличается тем, что с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, оборудования, затрат сил и времени методов возможна постановка диагноза тромбоцитопатии больным метаболическим синдромом с последующим вычислением общего агрегационного потенциала, по значению которого назначается соответствующее лечение, достаточное для купирования тромбоцитопатии в каждом конкретном случае. При повторных обследованиях возможно вновь определять общий агрегационный потенциал с целью контроля адекватности проводимого лечения.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Взятие крови производят в утренние часы после 14 часового голодания. Кровь берут из локтевой вены через толстую иглу самотеком в три пробирки. В первую 2 мл крови в 8 мл забуференного 0,125% раствора глутаральдегида с последующим исследованием ВАТ. Во вторую пробирку с цитратом натрия в соотношении 9:1 берут 5 мл крови для оценки агрегации тромбоцитов. В третью сухую пробирку берут 5 мл крови для определения ретракции. В последней пробирке сразу же определяется количество тромбоцитов в венозной крови. Одновременно с определением длительности кровотечения по Шитиковой А.С. (1975) производится подсчет числа тромбоцитов в капиллярной крови. Для этого точно на 20-й секунде после укола пальца до его погружения в физиологический раствор набирают одну мерную пипетку для подсчета тромбоцитов. Определяя процент задержавшихся на ранке тромбоцитов по сравнению с венозной кровью, судят об адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов.

Оценка ВАТ осуществляется следующим способом (Шитикова А.С. и соавт. Метод определения внутрисосудистой активности тромбоцитов и его значение в клинической практике. // Клиническая лабораторная диагностика, 1997, №2. - С.23-35). Из иглы, введенной в локтевую вену, сливают 2-3 мл крови на вату и следующие 2 мл наливают в силиконированную центрифужную пробирку с 8 мл раствора 0,125% глутаральдегида. Эту пробирку заполняют в первую очередь до всех других проб, набираемых для исследования системы гемостаза. Полученную кровь сразу же центрифугируют 6 мин при 1000 об/мин. В случае неполного осаждения эритроцитов (супернатант розового цвета) отбирают 2 мл надосадочной жидкости в другую пробирку и центрифугируют в том же режиме в течение 1 минуты. Супернатант разводят раствором глутаральдегида в четыре раза (0,1 мл + 0,3 мл раствора), перемешивают пипеткой и заполняют камеру Горяева, которую помещают на 20 мин в увлажненную чашку Петри.

С целью определения абсолютного содержания тромбоцитов в 10⁹/л крови в заполненной камере Горяева в пяти больших квадратах подсчитывают число всех единичных кровяных пластинок вне зависимости от их формы. Полученную величину для вычисления содержания тромбоцитов в 10⁹/л крови нужно умножить на 5×4×10×5×10⁶=1×10⁹, где первые две цифры - поправки на произведенные в ходе исследования разведения крови, вторые две цифры - поправки, связанные с высотой камеры Горяева (0,1 мм) и с площадью, на которой подсчитывались кровяные пластинки (5 больших квадратов = 1/5 мм²), 10⁶ - коэффициент пересчета 1 мм³ в 1 л. Определив абсолютное содержание тромбоцитов в исследуемой крови, переводят относительные величины отдельных форм тромбоцитов (в %) в абсолютное их содержание в 10⁹/л. крови. Абсолютные величины при патологии могут более адекватно отражать изменения в определяемом распределении форм.

В этом же препарате подсчитывают число агрегатов разного размера (т.е. содержащих по 2, 3, 4, 5 и т.д. кровяных пластинок), приходящихся на 500 свободных тромбоцитов. Результат оценивают по распределению агрегатов разного размера, приходящихся на 100 свободных тромбоцитов. Для облегчения анализа распределительной агрегатограммы полученные результаты могут быть суммированы в виде двух величин: 1) числа агрегатов малого размера, содержащих по 2-3 тромбоцита, и 2) числа агрегатов среднего и большого размера, содержащих по 4 и более тромбоцитов. Изменение этих величин в патологических условиях более наглядно выявляет повышение процесса внутрисосудистой активации кровяных пластинок.

Оценка степени агрегации осуществляется также и по относительному числу всех тромбоцитов, вовлеченных в агрегационную реакцию. Последнее может быть выявлено по процентному отношению числа агрегировавших тромбоцитов к общему их числу в препарате (т.е. к сумме свободно лежащих клеток и вовлеченных в агрегацию) по формуле:

где х, y, z и т.д. - число агрегатов соответствующего размера, приходящееся на 500 свободных тромбоцитов. Эта формула не может быть применена в том случае, когда в препарате имеются необратимые, оптически гомогенные агрегаты или настолько большие, что в них невозможно подсчитать число клеток. В этом случае ограничиваются данными распределения агрегатов разного размера.

Оценка AT осуществляется следующим способом (Шитикова А.С. В кн.: Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. Под ред. Н.Н.Петрищева, Л.П.Папаян. СПб.: 1999. С.49-52).

Кровь забирают с цитратом натрия 3,8% в соотношении 9:1, центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин для получения богатой тромбоцитами плазмы (БТП). Часть плазмы отбирают, а оставшуюся центрифугируют при 3000 об/мин, в течение 20 мин, получая бедную тромбоцитами плазму (БеТП). БТП стандартизируют по числу тромбоцитов путем разбавления исходной БТП аутологичным образцом БеТП (до 200·10⁹/л). Концентрация кровяных пластинок в исходной БТП подсчитывается в камере Горяева (в 50 больших квадратах). Объемы смешиваемых БТП и БеТП определяют по формуле:

V_БеТП - объем бедной тромбоцитами плазмы,

V_БТП - объем богатой тромбоцитами плазмы,

N - счетная концентрация тромбоцитов в исходной БТП (клеток/мкл).

Из отобранного объема стандартизированной плазмы на предметное стекло наносят 0,02 мл плазмы и разными пипетками по 0,02 мл р-ра индуктора. В качестве агонистов возможно применение АДФ, коллагена, тромбина, адреналина, ристомицина, перекиси водорода в общепринятых концентрациях, а также сочетание индукторов (АДФ + коллаген, АДФ + тромбин, коллаген + тромбин, АДФ + адреналин, АДФ + коллаген + адреналин и т.д.) в концентрациях ниже общепринятых (АДФ - 10^-6 М, коллаген - разведение основной суспензией 1:4, тромбин - 0,09 ед/мл, адреналин 2,5×10^-7 М), но достаточных для возникновения агрегации тромбоцитов при взаимопотенциирующем влиянии индукторов. Стеклянной палочкой смешивают плазму с индукторами и включают секундомер. Смесь перемешивают так, чтобы жидкость занимала окружность диаметром около 2 см.

Покачивая стекло круговыми движениями в проходящем свете осветителя, на черном фоне следят через лупу за возникновением агрегатов. При появлении отчетливых агрегатов, просветлении раствора и прилипании части агрегатов к стеклу секундомер отключают, фиксируя время агрегации тромбоцитов.

Реакцию повторяют 2-3 раза с каждым индуктором, находя среднее арифметическое значение.

Оценивается также ретрактильная функция (З.С.Баркаган, А.П.Момот. Основы диагностики нарушений гемостаза. М.: Ньюдиамед-АО. - 1999. - 224 с.). В градуированную центрифужную пробирку помещают 5 мл крови. В нее погружают стеклянную палочку с шероховатой поверхностью, укрепленную вертикально при помощи пробки, закрывающей пробирку. Пробирку устанавливают на водяной бане при t=37°С. Через один час после свертывания стеклянную палочку удаляют вместе со сгустком. Определяют объем оставшейся сыворотки и выражают его в процентах. Ретракцию считают нормальной, если она находится в пределах 48-60%.

Длительность кровотечения оценивают по (Шитикова А.С. // Лабор. дело. - 1975. - №10. - С.597-602). В две пластиковые бакпечатки разового пользования наливают по 5 мл стерильного физиологического раствора пипеткой, предназначенной только для этой цели.

Предплечье обследуемого свободно лежит на столе. На плечо накладывают манжетку тонометра и нагнетают воздух до 40 мм рт.ст. Это давление сохраняется в течение всего времени исследования.

Обрабатывают спиртом концевую фалангу IV пальца и общепринятым способом с помощью скарификатора разового пользования производят укол в подушечку концевой фаланги точно на глубину 3,5 мм и одновременно включают секундомер.

Кончик пальца с нанесенной ранкой погружают в верхнюю часть раствора, наблюдают в проходящем свете за вытекающим столбиком крови и в момент полного прекращения кровотечения выключают секундомер. В случае большой кровопотери и сильного окрашивания кровью раствора палец перед концом кровотечения переносят в другой стаканчик для точного установления момента его завершения.

С помощью пипеток на 5 и 0,2 мл (маркированных "для крови" и не используемых для другой цели) оценивают интенсивность кровотечения путем измерения добавочного объема жидкости сверх налитых 5 мл.

Определение времени кровотечения необходимо повторить два раза, но одномоментно не более двух раз, т.к. после третьего укола длительность начинает увеличиваться. Диагностическое значение имеет наибольшая из установленных величин. При значительном увеличении времени кровотечения исследование следует прекратить на 10-15 минут, а при большой кровопотере - и раньше.

Пределы нормальных колебаний длительности кровотечения составляют у взрослых мужчин 70-196 с (X=118 с), у женщин 87-208 с (X=135 с). Объем кровопотери - 0,01-0,40 мл.

Адгезивно-агрегационная активность тромбоцитов оценивается по Шитиковой А.С. (В кн.: Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. Под ред. Н.Н.Петрищева, Л.П.Папаян. СП.б.: 1999. - С.40-41).

Немедленно после поступления венозной крови в сухую силиконированную или пластиковую пробирку в ней определяют число тромбоцитов. При этом с целью повышения точности метода набирают две мерные микропипетки и приготавливают два разведения в 1,5% растворе оксалата аммония.

Подсчет числа тромбоцитов в капиллярной крови проводится одновременно с определением длительности кровотечения. Для этого точно на 20 секунде после укола в палец до его погружения в физиологический раствор хлорида натрия набирают одну мерную пипетку для подсчета количества тромбоцитов. Поскольку длительность кровотечения определяют дважды, то и при нанесении второй ранки указанную процедуру повторяют. На 20-й секунде капля должна выступать самостоятельно, и только, если этого не происходит, допускается легкое надавливание на концевую фалангу пальца.

Определение процента тромбоцитов, задержавшихся на раневой поверхности за счет их адгезивно-агрегационной активности, проводится по формуле: (А-Б)/А×100%, где А - число тромбоцитов в венозной крови ×10⁹/л, Б - число тромбоцитов в капиллярной крови ×10⁹/л.

Пределы нормальных колебаний адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов у взрослых здоровых людей составляют 28-48% (Х=37%).

Для определения весомости всех полученных параметров и вычисления общего агрегационного потенциала обследованных применяется системный многофакторный анализ, позволяющий перевести исследуемые многомерные количественные характеристики с несопоставимыми абсолютными значениями в сопоставимые относительные величины (Углова М.В., Углов Б.А., Архипов В.В., Горшкова Т.В., Петунина Н.А., Оль Т.Л., Прохуровская М.А., Шубин С.И. Применение методов морфометрии и статистического анализа в морфологических исследованиях. Куйбышев, 1982. - 47 с.). Метод дает возможность выразить весь агрегационный процесс единым интегральным показателем. Расчет производился по формулам:

- исследуемый параметр, - нормативный параметр, - относительная разность.

P_i - весовой коэффициент (коэффициент влияния), а - постоянный множитель (в наших исследованиях а=0,1), σ_j - среднеквадротическое отклонение значения в относительных единицах.

- дисперсия исследуемого параметра X_i, n_i - количество наблюдений при определении X_i, - дисперсия нормативного параметра Х₀, n₀ - количество наблюдений при определении Х₀.

- величина, интегрально характеризующая исследуемый процесс в заданный срок (в относительных единицах).

Сочетанное применение описанных методов с последующей обработкой полученных результатов системным многофакторным анализом с определением общего агрегационного потенциала () позволяет адекватно проверить коррекцию тромбоцитопатии у больных метаболическим синдромом. Так, при значении от 0,050 до 0,150 коррекция возможна с помощью гипокалорийной диеты, при значении от 0,151 до 0,250 лечение должно проводиться низкокалорийной диетой и физическими нагрузками, при уровне от 0,251 до 0,350 необходимо назначать препарат метформин, в случае если более 0,350 коррекция тромбоцитопатии может быть осуществлена сочетанием гипокалорийной диеты, физических тренировок и метформином.

Внедрение данного способа выбора терапии тромбоцитопатии у больных метаболическим синдромом в практику лечебных учреждений позволит решить ряд насущных социально-экономических проблем современности. Своевременное и адекватное назначение эффективного в каждом конкретном случае способа лечения тромбоцитопатии у больных метаболическим синдромом позволит своевременно корригировать тромбофиллию, сократить у этих пациентов сроки временной нетрудоспособности, профилактировать инсульты и инфаркты, уменьшив число выходов на инвалидность и снизив смертность среди данного контингента больных.

Пример 1. Больная С. 53 года (протокол №014), страдающая артериальной гипертонией с метаболическим синдромом на протяжении 4 лет обследована во время профилактического осмотра по месту жительства. У больной была взята кровь в три пробирки и исследована по изложенной выше схеме с оценкой ВАТ, агрегационной активности тромбоцитов с рядом индукторов и ретракции кровяного сгустка с оценкой адгезивной способности тромбоцитов и вычислением общего агрегационного потенциала.

У больной была диагносцирована тромбоцитопатия с повышением адгезивно-агрегационной активности (40,0%), агрегации тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 38,2 с, коллаген 30,6 с, тромбин 50,1 с, Н₂O₂ 44,8 с, адреналин 88,6 с, АДФ + адреналин 31,2 с, АДФ + коллаген 24,3 с, адреналин + коллаген 25,4 с, АДФ + тромбин 22,3 с, коллаген + тромбин 20,1 с, АДФ + коллаген + адреналин 17,4 с), усилением ВАТ (дискоциты 70%, диско-эхиноциты 20%, сфероциты 7%, сферо-эхиноциты 2%, биополярные формы 1%) и сохранением ретракции. Общий агрегационный потенциал составил . Назначенная больной индивидуально подобранная гипокалорийная диета (1532,7 ккал) способствовала полной коррекции оцениваемых параметров тромбоцитарного гемостаза в течение 12 нед с приближением к нулевому значению общего агрегационного потенциала .

Больной было рекомендовано соблюдать гипокалорийную диету и далее для поддержания достигнутого эффекта.

Пример 2. Больной А., 49 лет (протокол №17), страдающий артериальной гипертонией с метаболическим синдромом на протяжении 8 лет. Обследован на дому. У больного была взята кровь в три пробирки и исследована по изложенной выше схеме с оценкой ВАТ, агрегационной активности тромбоцитов с рядом индукторов и ретракции кровяного сгустка с оценкой адгезивной способности тромбоцитов и вычислением общего агрегационного потенциала.

У больного была диагносцирована тромбоцитопатия с повышением адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов (45,3%) их агрегации под влиянием ряда индукторов (АДФ 35,1 с, коллаген 27,2 с, тромбин 45,1 с, Н₂О₂ 39,6 с, адреналин 78,3 с, АДФ + адреналин 26,5 с, АДФ + коллаген 24,2 с, адреналин + коллаген 20,0 с, АДФ + тромбин 20,1 с, коллаген + тромбин 18,6 с, АДФ + коллаген + адреналин 16,2 с) и усиления ВАТ (дискоциты 62%, диско-эхиноциты 25%, сфероциты 9%, сферо-эхиноциты 2%, биополярные формы 2%) и нормальной ретракцией с определением общего агрегационного потенциала, который составил .

Больному назначен комплекс немедикаментозного лечения, состоящий из индивидуально подобранных гипокалорийной диеты (1873,8 ккал), рациональных дозированных физических нагрузок. Это позволило нормализовать у него исследованные параметры тромбоцитарного через 4 мес лечения, устранив тромбоцитопатию и обеспечив нормализацию общего агрегационного потенциала до 0,009. Дальнейшее соблюдение пациентом данных ему рекомендаций исключило рецидивирование тромбофиллической тромбоцитопатии.

Пример 3. Больная М. 63 года (протокол №027), страдающая артериальной гипертонией с метаболическим синдромом на протяжении 11 лет обследована во время профилактического осмотра по месту жительства. У больной была взята кровь в три пробирки и исследована по изложенной схеме с оценкой ВАТ, агрегационной активности тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 30,0 с, коллаген 24,0 с, тромбин 41,0 с, Н₂О₂ 30,2 с, адреналин 74,2 с, АДФ + адреналин 23,2 с, АДФ + коллаген 20,6 с, адреналин + коллаген 17,1 с, АДФ + тромбин 17,4 с, коллаген + тромбин 16,0 с, АДФ + коллаген + адреналин 14,5 с) и усиления ВАТ (дискоциты 57%, диско-эхиноциты 27%, сфероциты 12%, сферо-эхиноциты 2%, биополярные формы 2%) и нормальной ретракцией с определением общего агрегационного потенциала, который составил . Назначенный больной метформин 500 мг 2 раза в день способствовал нормализации оцениваемых параметров в течение 4 мес с приближением к нормальным показателям общего агрегационного потенциала

Больной было рекомендовано соблюдать прием препарата в дальнейшем, что позволило поддержать в нормальных границах исследуемые параметры тромбоцитарного гемостаза.

Пример 4. Больной З. 55 лет (протокол №127), страдающая артериальной гипертонией с метаболическим синдромом на протяжении 10 лет. Обследован во время плановой госпитализации. У больного была взята кровь в три пробирки и исследована по изложенной схеме с оценкой ВАТ, агрегационной активности тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 25,0 с, коллаген 21,2 с, тромбин 36,2 с, Н₂О₂ 30,0 с, адреналин 69,4 с, АДФ + адреналин 20,0 с, АДФ + коллаген 15,6 с, адреналин + коллаген 11,2 с, АДФ + тромбин 15,4 с, коллаген + тромбин 13,0 с, АДФ + коллаген + адреналин 11,9 с) и усиления ВАТ (дискоциты 54%, диско-эхиноциты 28%, сфероциты 14%, сферо-эхиноциты 2%, биополярные формы 2%) и нормальной ретракцией с определением общего агрегационного потенциала, который составил .

Больному назначен комплекс лечения, состоящий из индивидуально подобранной гипокалорийной диеты (1964,1 ккал), рациональных дозированных физических нагрузок и препарата метформин 500 мг 2 раза в день. Это позволило нормализовать у него исследованные параметры тромбоцитарного гемостаза через 4 мес лечения, установив тромбоцитопатию с приближением к нулевому значению агрегационного потенциала . Дальнейшее соблюдение пациентом данных рекомендаций исключило рецидивирование тромбофиллической тромбоцитопатии.

Изобретение относится к медицине, а именно к области кардиологии и гематологии. Сущность способа: определяют длительность кровотечения, адгезивно-агрегационную способность тромбоцитов, их агрегационную функцию на стекле с рядом индукторов и их сочетаний, внутрисосудистую активность кровяных пластинок и ретракцию кровяного сгустка. Обрабатывают результаты исследования с помощью системного многофакторного анализа, переводя каждый из определяемых показателей в сопоставимые относительные величины, на основании которых с учетом весового коэффициента, определяемого для каждого показателя на основании среднеквадратичного отклонения для данного показателя и постоянного множителя, равного 0,1, рассчитывают значение общего агрегационного потенциала, по значению которого производят выбор метода лечения тромбоцитопатии. При значении общего агрегационного потенциала в интервале 0,050-0,150 назначают гипокалорийную диету; при значении 0,151-0,250 назначают гипокалорийную диету в сочетании с физическими нагрузками; при значении 0,251-0,350 назначают препарат метморфин; при значении свыше 0,350 назначают сочетание гипокалорийной диеты, физических нагрузок и метморфина. Использование способа позволяет повысить адекватность выбора метода коррекции тромбоцитопатии у больных метаболическим синдромом.

Способ выбора метода лечения тромбоцитопатии больных метаболическим синдромом, отличающийся тем, что определяют длительность кровотечения, адгезивно-агрегационную способность тромбоцитов, их агрегационную функцию на стекле с рядом индукторов и их сочетаний, внутрисосудистую активность кровяных пластинок и ретракцию кровяного сгустка и обрабатывают результаты исследования с помощью системного многофакторного анализа, переводя каждый из определяемых показателей в сопоставимые относительные величины, на основании которых с учетом весового коэффициента, определяемого для каждого показателя на основании среднеквадратичного отклонения для данного показателя и постоянного множителя, равного 0,1, рассчитывают значение общего агрегационного потенциала - , по значению которого производят выбор метода лечения тромбоцитопатии: при значении в интервале 0,050-0,150 назначают гипокалорийную диету; при значении в интервале 0,151-0,250 назначают гипокалорийную диету в сочетании с физическими нагрузками; при значении в интервале 0,251-0,350 назначают препарат метморфин; при значении свыше 0,350 назначают сочетание гипокалорийной диеты, физических нагрузок и метморфина.