СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2006 года по МПК A61K31/717 A61K36/15 A61P31/04 

Изобретение относится к медицине и фармакологии, а именно к средствам антибактериальной терапии, и может быть использовано в клинической практике для профилактики и лечения заболеваний, вызываемых патогенными микробами.

Препараты на основе коллоидного металлического серебра находят широкое применение в медицине как антисептические средства наружного применения. В известных препаратах коллоидного серебра (колларгол и протаргол) стабилизатором высокодисперсных частиц серебра служат белковые полимеры казеин и желатин [М.Д.Машковский. Лекарственные средства. Т.2, Новая волна, М., 2000]. Эти препараты из-за наличия в их составе белков непостоянного состава обладают аллергическим действием и не поддаются строгой стандартизации. В настоящее время в связи с развитием явления антибиотико-резистентности микробов вновь наблюдается усиление интереса к препаратам серебра.

Так, получены соединения серебра с гистидином, триптофаном и аргинином по реакции комплексообразования [А.С.Казаченко, Е.В.Леглер, О.В.Перьянова и др., Хим.-фарм. журн., 34(5), 34-35, 2000, Е.В.Леглер, А.С.Казаченко, В.И.Казбанов и др., Хим.-фарм. журн., 35(9), 35-36, 2001] с содержанием серебра 40-50%. Эти соединения проявляют антимикробную активность в отношении Staphyllococcus aureus, Candida albigans, Bacillus subtilis и некоторых других бактерий. Однако указанные производные обладают и недостатками:

- плохо растворимы в воде (0,1%),

- нерастворимы в щелочах, кислотах, органических растворителях и растворяются только в растворах аммиака и хлорида натрия,

- наличие аминокислот в составе может вызывать побочные негативные воздействия,

- серебро в них связано с органическим лигандом в виде комплекса.

Взаимодействием полиакриловой кислоты с нитратом серебра получены ее серебряные производные (аргакрил) [М.Г.Воронков, А.С.Коган, Л.М.Антоник и др. Антибактериальные и гемостатические свойства серебряных солей полиакриловой кислоты. Хим.-фарм. журн., 36, № 2. 2002. С.27-29, Патент РФ №2220982], содержащие от 1 до 10% серебра. Они подавляют рост Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphyllococcus aureus и некоторых других грамположительных и грамотрицательных бактерий. При этом серебряные соли полиакриловой кислоты имеют:

- чрезвычайно высокую молекулярную массу - 3-10 миллионов,

- высокую вязкость,

- размеры частиц неизвестны.

Известно средство, содержащее наноструктурные металлические и бинарные металлические (серебро, медь, железо, никель, кадмий) частицы, полученное путем восстановления ионов металла в системе обратных мицелл, включающее приготовление обратно-мицеллярной дисперсии восстановителя на основе раствора поверхностно-активного вещества в неполярном растворителе [Егорова Е.М., Ревина А.А., Кондратьева B.C. Способ получения наноструктурных металлических частиц. Патент РФ № 2147487]. В качестве восстановителя используют вещество из группы флавоноидов, в качестве поверхностно-активного вещества - бис-2-этилгексилсульфосукцинат натрия, а в качестве неполярного растворителя применяют вещество из группы предельных углеводородов (гексан-декан и др.). Средство, полученное этим способом, позволяет увеличить скорость формирования наноструктурных металлических частиц и продлить срок их жизни до 100 дней. Недостатки этого средства заключаются в том, что:

- размерность частиц в патенте не определена,

- частицы существуют только в растворе,

- способ получения является достаточно сложным, многостадийным и дорогостоящим,

- процесс получения требует применения большого набора реагентов и органических растворителей.

Известны комплексы анионных полисахаридов с серебром [GB 2392913. Cullen В.М., Addison D., Greenhaigh D., Essler A.A complex of an anionic polysaccharide with silver.], представляющие из себя соли, сформированные из катиона серебра и анионных полисахаридов - альгинатов, гиалоуронатов, пектинов, производных целлюлозы и др. Также известны покрытия для ран, содержащие в качестве антисептика, наряду с другими, и коллоидное серебро или соль серебра, а из полисахаридов растительного происхождения используются альгинаты, пектины, производные целлюлозы [Патент RU 2193896. Гаврилюк Б.К., Гаврилюк В.Б. Покрытие для ран. 10.12.2002], а также покрытия, включающие в виде полисахаридного компонента гиалуронан, а в качестве антибиотика - ионы серебра [US 2002/0068093. Trogolo J.A., Johnston J.B., Pastecki E.A., Pervin E., Stahl A., Hyman M. Bi-laminar, hyaluronan coatings with silver-based anti-microbial properties. 06.06.2002]. Все эти бактерицидные комплексы содержат серебро в ионном виде, но в последнее время предпочтение отдается наиболее эффективным серебросодержащим ультрадисперсным и коллоидным системам, обеспечивающим более высокую бактерицидную активность [Благитко Е.М., Бурмистров В.А., Колесников А.П., Михайлов Ю.И., Родионов П.П. Серебро в медицине. Новосибирск: Наука-центр, 2004, 256 с.].

Наиболее близким из ультрадисперсных систем к предлагаемому средству является препарат повиаргол, получаемый путем химической диспергации металлического серебра в присутствии гидрофильного синтетического полимера - поливинилпирролидона, который нетоксичен и широко используется в медицине в качестве плазмозаменителя крови и детоксикатора. Повиаргол [Патент РФ №2088234. 1997. БИ №24. Водорастворимая бактерицидная композиция и способ ее получения. В.В.Копейкин, Е.Ф.Панарин, Ю.Г.Сантурян, З.А.Пашникова, Е.Ф.Прохода, Т.И.Будникова. Государственный реестр лекарственных средств России, рег. №97/167/7] содержит в своем составе нанокластеры нуль-валентного металлического серебра с размерами 2-4 нм. Препарат легко растворяется в воде с образованием коллоидного раствора, сохраняющего агрегативную устойчивость в течение 2 недель-6 месяцев. Препарат разрешен к серийному производству и медицинскому применению в качестве бактерицидного средства. Однако способ получения этого средства:

- трудоемок и требует больших энергозатрат, поскольку технология производства предусматривает распылительную сушку,

- имеет ограничение сырьевой базы,

- синтетический полимер увеличивает стоимость препарата,

- препарат быстро выводится почками (80% за 4 часа).

Целью предлагаемого изобретения является создание средства, содержащего высокодисперсные водорастворимые наноразмерные частицы серебра, стабилизированные природным полисахаридом арабиногалактаном, обладающие антимикробной активностью.

К природным веществам защитного действия, повышающим устойчивость гидрофобных коллоидных систем, относятся не только лиофильные высокомолекулярные соединения пептидной природы, но и углеводной. Полисахариды в целом обладают несколько более слабым защитным действием, чем белки, однако они имеют ряд преимуществ, поскольку не денатурируются при повышенной температуре, в условиях повышенной кислотности среды и в органических растворителях. Наши исследования показали, что полисахарид арабиногалактан (водорастворимая гемицеллюлоза лиственницы) является эффективным стабилизатором металлических и металлооксидных систем [Александрова Г.П., Медведева С.А., Гищенко Л.А., Дубровина В.И. Металлопроизводные арабиногалактана, способ получения металлопроизводных арабиногалактана. RU 2194715. 20.12.2002], а следовательно, может быть использован для получения высокодисперсных препаратов серебра.

Поставленная цель достигается синтезом на основе арабиногалактана, выделенного из древесины лиственницы сибирской, препарата, содержащего серебро, и установлением его антимикробного действия. Сущность настоящего изобретения состоит в получении и стабилизации наночастиц серебра в щелочном растворе природного полисахарида арабиногалактана, являющегося стабилизатором наноструктур, а также в том, что синтезированное серебросодержащее производное арабиногалактана обладает антимикробной активностью.

Достоинствами предлагаемого нами стабилизатора являются его природное происхождение, доступность (содержание в лиственнице до 15%), нетоксичность, невысокая молекулярная масса (12000), очень хорошая водорастворимость (50%).

Техническим результатом настоящего изобретения является получение стабильных водорастворимых структур, содержащих наноразмерные частицы серебра, увеличение времени жизни наноструктурных частиц и возможность получения образца в твердом порошкообразном виде.

Принципиальным отличием настоящего изобретения от выше рассмотренных, в том числе RU 2194715 от 20.12.2002 является использование природного полисахарида арабиногалактана одновременно в качестве реакционной дисперсионной среды и восстановителя ионов серебра до нуль-валентного состояния.

Цель изобретения достигается тем, что водные растворы солей серебра с содержанием от 0,0011 до 0,40 г (от 0,007 до 2 ммоль) добавляют к водному раствору арабиногалактана при интенсивном перемешивании и оставляют при комнатной температуре в течение 30-90 мин. После этого приливают 30%-ный гидроксид аммония или натрия до рН 10-11. Полученные смеси выдерживают при температуре 20-90°С в течение 5-60 мин. Раствор фильтруют и целевые продукты выделяют высаживанием фильтрата в этанол, осадок отфильтровывают и сушат в вакууме. Содержание серебра в полученных образцах, определенное методом атомно-абсорбционного анализа, в зависимости от условий реакции варьирует в пределах 3,3-19,9%. По данным рентгено-дифракционного анализа серебро находится в нуль-валентном состоянии, и размер его наночастиц составляет 7-13 нм.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение:

Пример 1.

2,0 мл водного раствора с содержанием 0,400 г нитрата серебра добавляли к 2,0 мл водного концентрированного (50%-ного) раствора арабиногалактана при интенсивном перемешивании и оставляли при комнатной температуре в течение 30 мин. Далее к полученному раствору добавляли 30%-ный гидроксид аммония до рН 11, нагревали до 90°С в течение 15 мин, затем фильтровали. Выделение и очистку продукта проводили высаживанием фильтрата в этанол в соотношении 1:4 с дальнейшим отделением осадка и высушиванием. Выход продукта составил 0,980 г, содержание в нем серебра 19,9%.

Пример 2.

2,0 мл водного раствора с содержанием 0,176 г нитрата серебра добавляли к 2,0 мл водного 50%-ного раствора арабиногалактана при интенсивном перемешивании и оставляли при комнатной температуре в течение 30 мин. Обработку полученного раствора 30% гидроксидом натрия, выделение и очистку препарата проводили так же, как описано в примере 1. Выход полученного производного составил 1,050 г, содержание в нем серебра 9,70%.

Пример 3.

2,0 мл водного раствора с содержанием 0,0011 г нитрата серебра добавляли к 2,0 мл водного 1% раствора арабиногалактана при интенсивном перемешивании и оставляли при комнатной температуре в течение 30 мин. Далее проводили обработку полученной смеси 30% гидроксидом натрия, полученную смесь выдерживали при 20°С в течение 15 мин, затем фильтровали. Выделение и очистку препарата проводили так же, как описано в примере 1. Выход полученного производного составил 0,019 г, содержание в нем серебра 3,31%.

Целевые продукты легко выделяются в виде порошков темно-коричневого цвета, которые хорошо растворимы в воде, нерастворимы в спирте, ацетоне, эфире. Они агрегативно устойчивы в течение длительного времени (в растворе 4 недели), не теряют своих свойств при долговременном хранении (в сухом виде 12 мес.) и легко могут быть вновь переведены в раствор. Сухие препараты можно использовать в качестве компонентов бактерицидных покрытий.

Определение антимикробной активности серебряного производного арабиногалактана с содержанием серебра 9,7% проводили методом серийных разведений в объеме 1 мл на музейных тест-культурах Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphyllococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida albigans.

Пример 4.

В пробирки вносили 0,1 мл взвеси испытуемых тест-культур (1000 клеток в 1 мл), по 10 мл тиогликолевой среды или среды Сабуро и по 0,1-1,0 мл 0,1-1,0% раствора исследуемого вещества. Контролем служили питательные среды, в которые вносили 1 мл дистиллированной воды вместо исследуемых растворов. Посевы инкубировали в тиогликолевой среде при 35°С в течение 48 ч, в среде Сабуро при 20-25°С в течение 72 ч. Учет результатов проводили по наличию и характеру роста культур на питательной среде.

Установлено, что серебряное производное арабиногалактана обладает высокой антимикробной активностью в отношении грамотрицательных энтеробактерий и грамположительных кокков (таблица).

Таблица
Антимикробная активность серебряного производного арабиногалактана
(содержание серебра 9,7%)№ ппТест-культураМинимальная бактерицидная   концентрация, мкг/мл1Escherichia coli1,02Salmonella typhimurium1,03Candida albigans10,04Bacillus subtilis50,05Staphyllococcus aureus100,0

Предлагаемое средство обладает достоинствами прототипа и характеризуется следующими преимуществами:

- серебросодержащие частицы арабиногалактана могут иметь содержание серебра до 20%,

- выход препарата по серебру составляет 77,4-96,3% от количества взятого для реакции серебра,

- серебросодержащие производные сформированы в виде наноразмерных частиц 10-30 нм,

- серебросодержащие частицы являются водорастворимыми, а также могут быть выделены в твердом виде,

- они агрегативно устойчивы и сохраняют свои свойства в течение 12 месяцев,

- серебро в коллоидных частицах находится в нуль-валентном состоянии,

- природный водорастворимый полисахарид арабиногалактан используется одновременно в качестве стабилизатора и восстановителя,

- процесс получения средства прост в техническом исполнении и не требует большого набора химических реагентов.

Серебропроизводные арабиногалактана обладают антимикробными свойствами и могут иметь широкий спектр применения. Например, производные с различным содержанием серебра могут быть использованы в медицине как антисептические средства наружного применения, как альтернативный антибиотикам лекарственный препарат, а также в качестве компонентов бактерицидных покрытий.

Изобретение относится к фармакологии и касается средства, представляющего собой водорастворимое соединение серебра на основе природного полисахарида арабиногалактана, и представляет собой водорастворимые частицы с размером 10-30 нм и проявляет антимикробное действие в отношении патогенных микробов Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphyllococcus aureus. Bacillus subtilis, Candida albigans. Изобретение обеспечивает получение средства как альтернативное антибиотикам лекарственное средство. 1 табл.

Средство, обладающее антимикробным действием, содержащее серебро и стабилизатор, отличающееся тем, что в качестве стабилизатора используют арабиногалактан, при этом средство представляет собой водорастворимые частицы с размером 10-30 нм.