СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ОНКОЛОГИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ МОЧЕПОЛОВОЙ СИСТЕМЫ Российский патент 2006 года по МПК C12Q1/68 

Способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям мочеполовой системы, включающий исследование гена GР3а путем выделения ДНК методом полимеразной цепной реакции.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для выявления групп пациентов с высоким риском развития рака простаты и мочевого пузыря, в том числе к инвазивным и метастатическим формам заболевания.

Рак предстательной железы и мочевого пузыря - часто встречающиеся злокачественные новообразования у мужчин. В России в 1996 году было впервые выявлено 8,3 тыс. случаев заболевания раком предстательной железы, что на 52% больше, чем в 1989 году, и ххх случаев рака мочевого пузыря. По темпу прироста заболеваемости рак предстательной железы находится на втором месте, уступая раку кожи. Смертность от рака простаты заболевания составляет 7,7 на 100000 населения, а от рака мочевого пузыря ххх на 100000 населения. В западных странах рак предстательной железы занимает первое-второе место по заболеваемости и смертности среди мужского населения. В США рак предстательной железы является наиболее частым злокачественным новообразованием, составляя 30% от всех впервые диагностированных онкологических заболеваний у мужчин и обуславливает 13% онко-зависимой смертности. Например, в 2001 году выявлено около 198100 новых случаев рака простаты. Эти данные свидетельствуют об улучшении диагностики рака простаты, что, безусловно, связано с широким внедрением простат-специфического антигена (ПСА) в клиническую практику. Однако, несмотря на улучшение ранней диагностики у 10-20% пациентов в США и около 40% в России при первичном обследовании имеются метастазы в кости. Большинство смертных случаев все еще обусловлено распространенным метастатическим процессом, устойчивым к лечению, несмотря на улучшение оперативной техники, местной и системной химио- и лучевой терапии.

По нашему мнению, современный подход к лечению рака простаты и, особенно, метастатической и гормоно-рефрактерной его форм должен базироваться на глубоких знаниях молекулярных и генетических основ этиологии и патогенеза злокачественного процесса.

В этом ключе актуальным направлением генетических исследований является изучение интегринов-протеинов, ответственных за связь между клетками и межклеточным матриксом. Возможно, что нарушение баланса между клетками и межклеточным матриксом, вследствие какого-либо повреждения или особенностей интегринов приводит к нарушению апоптоза, развитию злокачественного образования, его инвазии и метастазированию. Ген GPIIIa кодирует β-субъединицу типа III, подтипа а интегринового рецептора.

В настоящее время установлена центральная роль интегринов в развитии некоторых злокачественных опухолей человека. В первую очередь это относится к различным формам меланомы и некоторых других злокачественных опухолей кожи. Также вероятна, но до сих пор не изучена роль интегринов в процессе развития, инвазии и метастазирования рака предстательной железы и мочевого пузыря.

В связи с этим, предложен способ определеления генетической предрасположенности к онкологическим заболеваниям мочеполовой системы, включающий выделение и исследование гена GP3a и его аллелей. Фактором такой генетической предрасположенности является наличие у исследуемого пациента аллеля PL-A2 гена GP3a.

Ранее данная конкретная задача не решалась, то есть способа-аналога нет.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Исследуют кровь с выделением ДНК

2. Исследуют аллели гена GP3a

3. При выявлении в результате анализа аллеля PL-A2 гена гликопротеина GP3a вероятность развития любых форм рака простаты и мочевого пузыря на 50%, а инвазивных и метастатических форм рака, требующих активного лечения, существенно (более чем в 3 раза) выше, чем в популяции.

Для указанного способа был разработан новый способ выделения и исследования гена GP3a. Известен способ выделения и исследования этого гена, который основывается на выделении ДНК для ПЦР из клеток периферической крови (van Goor ML, Gomez Garcia E, Brouwers GJ, Leebeek FW, Koudstaal PJ, Dippel DW. PLA1/A2 polymorphism of the platelet glycoprotein receptor IIb/IIIa in young patients with cryptogenic TIA or ischemic stroke. Thromb Res. 2002 Oct 1; 108(1):63-5). Этот способ характеризуется существенно увеличенным временем анализа, повышенными затратами на реактивы и, кроме того, делает неизбежной стадию пробоподготовки, на которой существует высокий риск взаимной контаминации проб, то есть такая работа может проводиться только в специально оборудованных лабораториях.

Технический результат изобретения заключается в создании более быстрого, дешевого и доступного способа полимеразной цепной реакции с одновременно большей его достоверностью и надежностью.

В предлагаемом способе, во-первых, в качестве ДНК-матрицы используется не раствор ДНК, а сухая капля крови на бумажном носителе, в качестве носителя используется бумага Ватман ЗММ (Ватман, Англия). Это усовершенствование метода существенно удешевляет подготовку проб и делает ее более защищенной от контаминации. Оно позволяет использовать данный способ для широкомасштабных скрининговых определений генотипа пациентов, в том числе обследований пациентов в регионах, включающих пересылку препаратов "сухая капля" при комнатной температуре.

Во-вторых, предложены оригинальные олигонуклеотидные праймеры для полимеразной цепной реакции 5'gctccaatgtacggggtaaa и 5'ctcctcagacctccaccttg, которые позволяют синтезировать специфический ДНК-продукт длиной 384 нуклеотидных пары. Этот продукт при расщеплении рестриктазой MspI образует фрагменты ДНК длиной 290 и 80 нуклеотидных пар в случае аллеля PL-A1 и фрагменты длиной 170, 120 и 80 нуклеотидных пар в случае аллеля PL-A2. Анализ продуктов реакции проводится методом стандартного электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле, что не представляет затруднений для стандартной диагностической лаборатории.

Способ осуществляют следующим образом:

1. На подушечке безымянного пальца пациента скарификатором делают прокол кожи и выдавливают каплю крови 50-100 мкл.

2. Каплю крови переносят на квадратик (2×2 см) хроматографической бумаги Ватман 3 ММ и высушивают на воздухе.

3. Фрагмент сухой капли размером 2×3 мм вносят в стандартную смесь для полимеразной цепной реакции объемом 50 мкл.

4. Проводят полимеразную цепную реакцию продолжительностью 35 циклов в следующем режиме:

денатурация ДНК при температуре 94°С - 40 сек;

отжиг праймеров при температуре 60°С - 30 сек;

полимеризация при температуре 72°С - 90 сек.

5. Обрабатывают продукт полимеразной цепной реакции рестриктазой MspI в соответствии с инструкцией для данного фермента.

6. Анализируют длину фрагментов ДНК методом стандартного электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле.

Для подтверждения действенности предлагаемого метода приведем следующий пример.

С использованием данного способа проведено обследование 40 больных раком предстательной железы и 20 больных раком мочевого пузыря. Установлено, что частота рака предстательной железы в группе носителей аллеля PL-A2 гена GP3a в 2 раза выше, чем в среднем в популяции, где она составляет 15%. При этом у больных инвазивным раком простаты и мочевого пузыря частота носительства аллеля PL-A2 гена GP3a в 3-4 раза, а метастатическим - в 6-8 раз выше, чем в популяции.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. Способ позволяет повысить быстро и с большой достоверностью и надежностью определять предрасположенность к онкологическим заболеваниям мочеполовой системы. Проводят исследование гена GP3a, при этом при обнаружения в нем сочетания аллелей PL-A1 и PL-A2, устанавливают предрасположенность к онкологическим заболеваниям, в том числе к инвазивным и метастатическим формам. А исследования гена GP3a осуществляют путем выделения ДНК методом полимеразной цепной реакции, причем ген исследуют в сухой капле крови на бумажном носителе и в качестве праймеров для полимеразной цепной реакции используют 5'gctccaatgtacggggtaaa и 5'ctcctcagacctccaccttg, синтезируют ДНК-продукт длиной 384 нуклеотидных пары, который расщепляют рестриктазой Mspl, образуя фрагменты ДНК, при этом идентифицируют аллель PL-A1 по фрагментам длиной 290 и 80 нуклеотидных пар, а аллель PL-A2 по фрагментам длиной 175, 120 и 80 нуклеотидных пар. 2 н.п. ф-лы.

1. Способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям мочеполовой системы, включающий исследование гена GP3a, при этом при обнаружении в нем сочетания аллелей PL-A1 и PL-A2 устанавливают предрасположенность к онкологическим заболеваниям, в том числе к инвазивным и метастатическим формам.2. Способ исследования гена GP3a путем выделения ДНК методом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что ген исследуют в сухой капле крови на бумажном носителе, а в качестве праймеров для полимеразной цепной реакции используют 5'gctccaatgtacggggtaaa и 5'ctcctcagacctccaccttg, синтезируют ДНК-продукт длиной 384 нуклеотидных пары, который расщепляют рестриктазой Mspl, образуя фрагменты ДНК, при этом идентифицируют аллель PL-A1 по фрагментам длиной 290 и 80 нуклеотидных пар, а аллель PL-A2 по фрагментам длиной 175, 120 и 80 нуклеотидных пар.