ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ НОРМАЛИЗАЦИИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА, ПРОБИОТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ НОРМАЛИЗАЦИИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА (ВАРИАНТЫ), И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ, СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ ШТАММА БАКТЕРИЙ Escherichia coli И ПИЩЕВОЙ ПРОДУКТ Российский патент 2006 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A23L1/221 A23L1/29 C12R1/19 

Область изобретения и предпосылки к созданию изобретения

Настоящее изобретение относится к (i) непатогенному, пробиотическому микроорганизму и к его применению в качестве пробиотического/терапевтического агента; (ii) препарату, содержащему водный раствор летучей фракции (VF), выделенной из экстракта, по крайней мере, одного растительного материала, и к его применению в качестве терапевтического агента; (iii) способу промышленного производства препарата из растительного материала; (iv) пробиотической композиции, содержащей непатогенный, пробиотический микроорганизм согласно изобретению и/или другой пробиотический микроорганизм(ы) и препарат согласно изобретению, и к ее применению в качестве пробиотического/терапевтического агента; (v) композиции для промышленного применения, содержащей препарат согласно изобретению и микроорганизм(ы), имеющий промышленное применение; и (vi) промышленным способам и аппаратам, в которых используют последнюю композицию.

В нормальных условиях микрофлора желудочно-кишечного тракта имеет большое значение для здоровья и благополучия индивидуума. Хорошо известно, что микрофлора представляет собой сложную и разнообразную популяцию микроорганизмов, которые могут оказывать как благоприятное, так и вредное воздействие на индивидуума. В условиях нормальной беременности плод in utero является стерильным, но при прохождении через влагалище во время родов плод приобретает микроорганизмы, что приводит к образованию кишечной микрофолоры. Конечная природная кишечная микрофлора, которая стабилизирована в кишечнике, представляет собой очень сложное собрание свыше тысячи различных типов микроорганизмов, состоящих приблизительно из 400 различных типов бактерий [Fuller R. J.Applied Bacteriology 66:365-378 (1989)]. Состав кишечной микрофлоры определяется как хозяином, так и микробными факторами, и хотя существует много бактерий, которые могут выживать и развиваться в ЖК тракте, имеется много бактерий, которые не могут выживать и развиваться в желудочно-кишечном (ЖК) тракте. Кроме того, выжившие организмы должны избегать действия перистальтики, которая способствует выведению бактерий с пищей. Сохранение бактерий может быть достигнуто иммобилизацией их посредством прикрепления к стенке кишки и/или путем размножения со скоростью, которая превосходит скорость выведения при перистальтике.

Вообще, присутствие кишечной микрофлоры является симбиотическим, поскольку микрофлора не только помогает в распаде некоторой неперевариваемой пищи, она также защищает индивидуума от инфекций, вызванных патогенами. Это последнее явление описано под такими названиями как «бактериальный антагонизм», «интерференция бактерий», «барьерный эффект», «устойчивость к образованию колоний», «конкурентное исключение» и многое другое.

Защитная микрофлора кишечника является очень устойчивой. Однако она является менее эффективной у молодых, пожилых и больных с повышенным риском. Кроме того, на нее могут влиять определенные факторы питания и факторы окружающей среды, самыми значимыми из них являются чрезмерная гигиена, терапия антибиотиками и стресс.

В условиях, при которых на баланс кишечной микрофлоры оказано отрицательное воздействие, пробиотики приобретают решающее значение в восстановлении кишечной микрофлоры и способствуют восстановлению организма индивидуального хозяина до нормы.

Пробиотики представляют собой класс микроорганизмов, определенных как живые микробные организмы, которые благоприятно воздействуют на животное-хозяина и человека-хозяина. Благоприятные воздействия включают в себя улучшение микробного баланса кишечной микрофлоры или улучшение качества природной микрофлоры. Благоприятный эффект пробиотиков может быть опосредован прямым антагонистическим воздействием по отношению к специфическим группам организмов, приводящим к уменьшению числа таких групп, воздействием на их метаболизм или стимуляцией иммунитета. Пробиотики могут подавлять численность жизнеспособного нежелательного организма путем продуцирования антибактериальных соединений, путем конкуренции за питательные вещества или за участки адгезии. Кроме того, они могут изменять микробный метаболизм путем увеличения или уменьшения ферментативной активности или они могут стимулировать иммунную систему путем увеличения уровня антител или увеличения активности макрофагов.

Международная публикация WO95/16461 описывает пробиотическую композицию анаэробных бактерий, эффективную при регулировании или ингибировании образования колоний Salmonella у одомашненных животных. Пробиотическая композиция включает в себя популяции или культуры 29, в основном, биологически чистых бактерий, включая E.coli. Однако угнетение патогена посредством пробиотической композиции, описанной в указанной РСТ публикации, требует комбинированного действия большого ряда бактериальных штаммов.

Международная публикация WO97/35596 описывает введение свежеприготовленной пробиотической смеси, полученной путем смешивания порошка, содержащего Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus и Bifidobacterium infantis, с жидкостью. Авторы показывают, что смесь является эффективной в профилактике инфекционной диареи или диареи, вызванной терапией антибиотиками у человека. Лиофилизированные живые бактерии находятся, однако, в анабиотическом состоянии. Необходимость увлажнить микроорганизм до введения с целью восстановления его жизнеспособности является недостатком, так как многие бактерии в норме не переживают регидратацию. Кроме того, выжившие организмы сразу не становятся метаболически активными и не могут выжить в чрезвычайно кислых условиях желудка. Кроме того, в условиях введения организмов реципиенту, страдающему от диареи, скорость удаления из кишечника может превысить скорость восстановления жизнеспособности, что приводит к незначительному благоприятному эффекту или совсем не приводит к таковому.

Защита жизнеспособности и сохранение активности пробиотических организмов с помощью их композиций является темой многочисленных публикаций. Международная публикация WO98/26787 описывает увеличение постоянной популяции микроорганизмов, продуцирующих молочную кислоту, предпочтительно Lactobaccillii, в ЖК тракте животного путем обеспечения β-глюканом, возможно, в комбинации с пребиотическими и/или пробиотическими микроорганизмами.

Международная публикация WO97/34591 также описывает увеличение постоянной популяции микроорганизмов или угнетение нежелаемой постоянной популяции у выбранного участка ЖК тракта индивидуума путем обеспечения индивидуума выбранным модифицированным или немодифицированным крахмалом или его смесями, которые действуют как носитель для одного или более пробиотических микроорганизмов и как питательная или поддерживающая среда для микроорганизмов. Пробиотические элементы связываются с носителем так, чтобы защитить микроорганизмы при прохождении к толстой кишке или другим областям ЖК тракта.

Микроорганизмы применяют в ряде промышленных способов. Данные способы можно разделить на непрерывные способы и периодические способы. В непрерывных способах, таких как непрерывная аэробная или анаэробная ферментация, применяемых для получения ряда продуктов ферментации, включая, например, этанол и метанол, ферментируемый сырой материал непрерывно подают на линию и продукт ферментации непрерывно извлекают из линии, контролируя так, что популяция микроорганизма в линии поддерживается на протяжении всего способа. В периодических способах, таких как, но не ограниченных ими, периодическая аэробная или анаэробная ферментация, биодеградация нефти, например, в нефтяных разливах и тому подобное, ферментируемый сырой материал смешивают с популяцией микроорганизма(ов) для проведения ферментации. В некоторых случаях желательно как в способе непрерывной ферментации, так и в способе периодической ферментации начать или возобновить способ при наличии большой и жизнеспособной популяции соответствующего микроорганизма(ов). Например, при биодеградации нефти целесообразно начать способ с большой, насколько возможно, популяции микроорганизмов Pseudomonas spp. или Alcaligenes spp., например, чтобы снизить до минимума время, требуемое для осуществления полной биодеградации нефти. При использовании фильтров, обогащенных микроорганизмом(ами) для биодеградации испарений и летучих, применяют непрерывный способ, в котором загрязняющие соединения деградируют на безвредные соединения. Однако непрерывная подача органических испарений и летучих влияет на степень выживаемости микроорганизмов, присутствующих в фильтре. Тем не менее в некоторых случаях подача органических испарений или летучих прекращается, и в результате микроорганизм(ы) утрачивается. При таких условиях восстановление эффективного жизнеспособного количества микроорганизма(ов) в фильтре необходимо провести в короткий период времени с тем, чтобы осуществить немедленное восстановление функциональности фильтра.

Таким образом, существует общепризнанная потребность в благоприятном для использования препарате, в котором микроорганизмы, включая пробиотические микроорганизмы и микроогранизмы, применяемые в ряде промышленных технологий, могли бы оставаться жизнеспособными и в метаболически активной форме в течение продолжительного периода времени.

При доведении настоящего изобретения до практического применения неожиданно было найдено, что единственный вид непатогенного пробиотического микроорганизма, произведенный из E.coli, способен самостоятельно восстановить флору ЖК тракта человека и ряда млекопитающих и птиц до нормального состояния. Также неожиданно было найдено, что указанный микроорганизм, а также другие микроорганизмы могут быть сохранены в течение длительных периодов времени жизнеспособными и в метаболически активной форме в препарате, содержащем водный раствор летучей фракции(й) из различных растительных экстрактов. Было показано, что пробиотическая композиция, содержащая суспендированный в препарате пробиотический организм, является эффективной в лечении и профилактике различных желудочно-кишечных расстройств. Кроме того, неожиданно было найдено, что препарат сам по себе является эффективным в качестве увеличивающего привес тела препарата и в качестве иммунного стимулятора у млекопитающих и птиц.

Краткое описание сущности изобретения

Согласно одному аспекту настоящего изобретения представлен микроорганизм Escherichia coli штамм BU-230-98 ATCC депозит No. 202226 (DSM 12799).

Согласно другому аспекту настоящего изобретения представлена пробиотическая композиция, содержащая жизнеспособный микроорганизм Escherichia coli штамм BU-230-98 ATCC депозит No. 202226 (DSM 12799) и препарат для сохранения жизнеспособности штамма Escherichia coli. Кроме того, пробиотическая композиция предпочтительно содержит, по крайней мере, одно ароматизирующее вещество. Предпочтительно, препарат включает в себя, по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) из растительного экстракта, полученную перегонкой с водяным паром растительного (например, свеклы, укропа огородного, петрушки огородной или грейпфрута) экстракта при пониженном давлении и температуре бани, предпочтительно не превышающей 38°С.

Пробиотическая композиция согласно настоящему изобретению может быть предназначена для профилактики или лечения желудочно-кишечных инфекций или расстройств, для сохранения в норме или восстановления до нормального состояния микрофлоры желудочно-кишечного тракта, профилактики или лечения диареи, профилактики или лечения желудочно-кишечной инфекции, вызванной кишечным патогеном, таким как грамотрицательная бактерия или грамположительная бактерия, профилактики или лечения желудочно-кишечной инфекции, вызванной Salmonella, профилактики или лечения инфекционной диареи, вызванной, например, C.difficile, Salmonella, в частности S.Shigella, Campylobacter, E.coli, Proteus, Pseudomonas или Clostridium, хронической диареи или диареи, возникающей в результате терапии антибиотиками, радиотерапии или химиотерапии, и/или для нормализации физиологической активности желудочно-кишечного тракта.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения представлен препарат, содержащий, по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) из растительного экстракта, причем летучую фракцию получают путем перегонки с водяным паром растительного экстракта при пониженном давлении и при температуре бани, не превышающей 38°С. Растительный экстракт предпочтительно получают из части растения, выбранной из группы, состоящей из листьев, стеблей, корней и плода. Растением может быть овощное растение, такое как соя культурная, люцерна, чеснок, свекла и капуста, или травянистое растение, такое как петрушка огородная, мята и укроп огородный. Кроме того, препарат может включать в себя продукт жизнедеятельности пчел, такой как прополис, но не ограниченный им. Препарат может служить в качестве корма для сельскохозяйственных животных или пищевой добавки для увеличения привеса животного. Также он может служить для сохранения жизнеспособных бактерий, как далее описано в тексте.

Следовательно, согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения разработан способ получения летучей фракции из растения, включающий в себя стадии (а) измельчения растительного материала с получением растительной биомассы; (b) смешивания растительной биомассы с водой и перемешивания при температуре окружающей среды; (с) перегонки с водяным паром смеси, полученной на стадии (b), при пониженном давлении и при температуре бани, не превышающей 38°С; и (d) сбора летучей фракции, полученной при перегонке с водяным паром. Предпочтительно, пониженное давление составляет 5-10 мбар. Данный препарат может быть использован как пищевая добавка, кормовая добавка и может иметь неожиданное терапевтическое применение, а также обладать свойствами, благоприятными для сохранения бактерий. Терапевтический препарат, содержащий летучую фракцию растения, также раскрыт и может быть получен путем смешивания, по крайней мере, одной летучей фракции (VF) из растительного экстракта с физиологически или ветеринарно допустимыми добавками, носителями или разбавителями. Предпочтительно, летучую фракцию получают путем перегонки с водяным паром растительного экстракта при пониженном давлении и при температуре бани, не превышающей 38°С.

Таким образом, согласно другому аспекту настоящего изобретения получена пробиотическая композиция, содержащая (а) эффективное количество, по крайней мере, одного жизнеспособного пробиотического микроорганизма, проявляющего благоприятную биологическую или терапевтическую активность в желудочно-кишечном тракте; и (b) по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) из растительного экстракта, предпочтительно полученную как описано в данном тексте. Пробиотическим микроорганизмом может быть E.coli, предпочтительно штамм BU-230-98 ATCC депозит No. 202226, и он может быть предназначен для лечения или профилактики любого из вышеуказанных расстройств/патологий/ заболеваний/синдромов, и вдобавок или в качестве альтернативы он может быть предназначен для лечения или профилактики симптомов диспепсии, для усиления иммунного ответа у больного с нарушением иммунной системы, являющимся результатом, например, подавляющей иммунный ответ терапии.

Согласно еще другому аспекту настоящего изобретения получена композиция, содержащая (а), по крайней мере, один микроорганизм, такой как Escherichia spp., Alcaligenes spp., Arthrobacter spp., Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Nitrosomonas spp. и Pseudomonas spp.; и (b), по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) из растительного экстракта, причем, по крайней мере, одну летучую фракцию выбирают так, чтобы сохранить жизнеспособность, по крайней мере, одного микроорганизма в течение, по крайней мере, 2 месяцев, предпочтительно, по крайней мере, 3-6 месяцев, более предпочтительно 6-12 месяцев или более при комнатной температуре.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения разработан способ выращивания Escherichia coli штамма BU-230-98 ATCC депозит No. 202226 (DSM 12799), способ, включающий в себя стадию посева исходной культуры Escherichia coli штамма BU-230-98 ATCC депозит No. 202226 (DSM 12799) в питательную среду и выращивания штамма Escherichia coli вплоть до оптической плотности 15-30 при 650 нм.

Согласно еще другому аспекту настоящего изобретения разработан способ промышленного производства пробиотической композиции, способ, включающий в себя стадию суспендирования жизнеспособного микроорганизма Escherichia coli штамма BU-230-98 ATCC депозит No. 202226 (DSM 12799) в препарате для сохранения жизнеспособности штамма Escherichia coli. Предпочтительно, препарат включает в себя, по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) из растительного экстракта, полученную предпочтительно перегонкой с водяным паром растительного экстракта при пониженном давлении и при температуре бани, не превышающей 38°С, экстракта, полученного, например, из части растения, выбранной из группы, состоящей из листьев, стеблей, корней и плода, причем растением является любое из овощных и травянистых растений, таких как культурная соя, петрушка огородная, мята, укроп огородный, люцерна, чеснок, свекла или капуста.

Согласно еще другому аспекту настоящего изобретения разработан способ получения пробиотической композиции, способ, включающий в себя стадию суспендирования эффективного количества, по крайней мере, одного жизнеспособного пробиотического микроорганизма, проявляющего благоприятное биологическое или терапевтическое действие в желудочно-кишечном тракте, в препарате, содержащем, по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) из растительного экстракта.

Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения разработан способ приготовления композиции, содержащей жизнеспособные микроорганизмы, способ, включающий в себя стадию суспендирования, по крайней мере, одного микроорганизма в препарате, содержащем, по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) растительного экстракта, причем, по крайней мере, одну летучую фракцию выбирают так, чтобы сохранить жизнеспособность, по крайней мере, одного микроорганизма в течение, по крайней мере, 2 месяцев при комнатной температуре. Микроорганизмом может быть, например, Escherichia spp., Alcaligenes spp., Arthrobacter spp., Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Nitrosomonas spp. или Pseudomonas spp.

Согласно еще дополнительному аспекту настоящего изобретения разработан диспенсер для микроорганизмов, состоящий из резервуара и дозатора, соединенных вместе, где в резервуаре, по крайней мере, один микроорганизм комбинируется с препаратом, содержащим, по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) из растительного экстракта, причем, по крайней мере, одну летучую фракцию выбирают так, чтобы сохранить жизнеспособность, по крайней мере, одного микроорганизма в течение, по крайней мере, 2 месяцев при комнатной температуре.

Согласно еще дополнительному аспекту настоящего изобретения разработан способ биоконтроля организма, способ, включающий в себя стадию распределения в эндемической зоне, по крайней мере, одного жизнеспособного микроорганизма, способствующего биоконтролированию организма, где, по крайней мере, один указанный жизнеспособный микроорганизм находится в препарате, содержащем, по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) растительного экстракта, где, по крайней мере, одну летучую фракцию выбирают так, чтобы сохранить жизнеспособность, по крайней мере, одного микроорганизма в течение, по крайней мере, 2 месяцев при комнатной температуре.

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения разработан способ устранения нефтяного загрязнения, способ, включающий в себя стадию распределения в загрязненной зоне, по крайней мере, одного жизнеспособного микроорганизма, способствующего деградации нефти, причем, по крайней мере, один жизнеспособный микроорганизм находится в препарате, содержащем, по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) растительного экстракта, где, по крайней мере, одну летучую фракцию выбирают так, чтобы сохранить жизнеспособность, по крайней мере, одного микроорганизма в течение, по крайней мере, 2 месяцев при комнатной температуре.

Согласно еще последующему аспекту настоящего изобретения разработан способ восстановления популяции микроорганизма, способствующего деградации органических испарений в биофильтре, где способ включает в себя стадию распределения на фильтре, по крайней мере, одного жизнеспособного микроорганизма, способствующего деградации органических испарений, причем, по крайней мере, один жизнеспособный микроорганизм находится в препарате, содержащем, по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) растительного экстракта, где, по крайней мере, одну летучую фракцию выбирают так, чтобы сохранить жизнеспособность, по крайней мере, одного микроорганизма в течение, по крайней мере, 2 месяцев при комнатной температуре.

Согласно еще следующему аспекту настоящего изобретения разработан способ получения закваски (маточника) для осуществления процесса ферментации, где способ включает в себя стадию выращивания достаточного количества микроорганизма для закваски и суспендирования указанного микроорганизма в препарате, содержащем, по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) из растительного экстракта, где, по крайней мере, одну летучую фракцию выбирают так, чтобы сохранить жизнеспособность, по крайней мере, одного микроорганизма в течение, по крайней мере, 2 месяцев при комнатной температуре.

Краткое описание фигур

Изобретение описывают посредством примера только со ссылкой на сопутствующий чертеж. Ссылаясь теперь более детально на чертеж, авторы подчеркивают, что детали показаны только в качестве примера и с целью иллюстрированного обсуждения предпочтительных аспектов изобретения и даны для того, как полагают, чтобы полнее представить и легче понять принципы и концептуальные аспекты изобретения, данные в описании. В этом отношении авторы не пытались показать структурные детали изобретения более подробно чем это необходимо для фундаментального понимания изобретения, причем описание дано с чертежом, помогающим специалистам в данной области понять, как некоторые формы изобретения могут быть воплощены на практике.

Чертеж представляет собой схематическое изображение диспенсера согласно настоящему изобретению.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к (i) непатогенному пробиотическому микроорганизму и к его применению в качестве пробиотического/терапевтического агента; (ii) препарату, содержащему водный раствор летучей фракции (VF), полученной из экстракта, по крайней мере, одного растительного материала, и к его применению в качестве терапевтического агента; (iii) способу промышленного производства препарата из растительного материала; (iv) пробиотической композиции, содержащей непатогенный пробиотический микроорганизм согласно изобретению и/или другой пробиотический микроорганизм(ы) и препарат согласно изобретению, и к ее применению в качестве пробиотического/терапевтического агента; (v) композиции для промышленного применения, содержащей препарат согласно изобретению и микроорганизм(ы) промышленного применения; и (vi) промышленным способам и аппаратам, в которых последнюю композицию используют.

Основы настоящего изобретения и его исполнение можно лучше понять при обращении к чертежу и сопутствующим описаниям. Перед подробным разъяснением, по крайней мере, одного аспекта изобретения следует признать, что изобретение не ограничивается в своем применении деталями, изложенными в следующем описании или приведенными в качестве примера посредством примеров. Изобретение допускает другие аспекты или может быть выполнено различными способами. Кроме того, необходимо иметь в виду, что употребляемая в тексте фразеология и терминология включена с целью описания и не должна рассматриваться как ограничивающая изобретение.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к пробиотическому микроорганизму, являющемуся непатогенной бактерией, произведенной от E.coli, который проявляет благоприятное физиологическое и/или терапевтическое действие, например, в ЖК тракте и депонирован в ATCC (Американская коллекция типовых культур) под депозитом No. 202226 и в DSMZ под депозитом No. 12799.

Термин «пробиотические» употребляют в данном тексте как имя прилагательное с целью описания выделенных бактерий, обладающих свойством ингибировать рост, по крайней мере, одного патогена. Изучение степени ингибирования, которое выполняют в данном изобретении, представляет собой изучение in vitro на твердой среде, на которой культуральные супернатанты кандидатов выделенных бактерий проверяли на их способность ингибировать рост патогена при помещении его на поверхность твердой среды. Обычно бумажный диск, пропитанный культуральным супернатантом кандидата пробиотического штамма, помещают на поверхность пластины с агаром, засеянной патогеном. В результате действия супернатантов пробиотических бактерий образуется кольцо прозрачного агара или снижается плотность роста, что указывает на ингибирование патогена в районе диска. Другие тесты на ингибирование могут иметь место, некоторые из них являются доступными или могут быть разработаны, включая тесты in vitro или in vivo на прямую конкуренцию роста, с помощью которых возможно определить группу пробиотических бактерий, подобных той, которая описана в данном тексте. Бактериальные штаммы, идентифицированные посредством такого теста, находятся в классе пробиотических бактерий, как определено термином, употребляемым в данном тексте.

Пробиотические бактерии согласно настоящему изобретению могут служить в качестве пищевой или кормовой добавки таким образом, что пищевой или кормовой продукт должен содержать жизнеспособный микроорганизм Escherichia coli штамма BU-230-98 ATCC депозит No. 202226 (DSM 12799). Пищевой продукт согласно настоящему изобретению также может включать, по крайней мере, одно вещество, полученное из молока, и которое может быть выбрано из группы, состоящей из сыра и йогурта.

Кроме того, настоящее изобретение относится к препарату, содержащему, по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) растительного экстракта, где летучую фракцию получают перегонкой растительного экстракта при пониженном давлении и при температуре бани, обычно не превышающей 38°С.

Растительным материалом, из которого может быть получена летучая фракция, может быть любая подходящая часть растения, такая как плод, лист, стебель или корень. Многие растения являются подходящими в качестве источника летучих фракций, например яблоня, цитрусовые, культурная соя, свекла, капуста, чеснок и люцерна, а также травы, такие как петрушка огородная, мята и укроп огородный. Кроме того, препараты согласно изобретению могут необязательно дополнительно содержать подходящее количество летучей фракции из продукта пчеловодства, такого как мед, прополис или другой продукт жизнедеятельности пчел, который может быть получен таким же образом, как описано в тексте, в случае получения летучих фракций из растительных экстрактов.

Как будет подробнее описано в следующих примерах, препарат сам по себе можно применять в качестве пищевой/кормовой добавки. Заявителями было найдено, что препарат обладает свойством увеличивать привес, и он представляет собой аспект изобретения. Согласно частному воплощению данного аспекта изобретения препарат, способствующий увеличению привеса животного, или добавка к корму содержит дистиллированную воду и летучие фракции из люцерны, культурной сои, свеклы и укропа огородного, предпочтительно в объемном отношении летучих фракций 2:8:1:4. В качестве альтернативы, препарат или кормовая добавка согласно настоящему изобретению содержит дистиллированную воду и летучие фракции из моркови, свеклы, укропа огородного и грейпфрута (1 часть каждого) на 100 частей воды. И еще в качестве альтернативы, препарат или пищевая добавка согласно настоящему изобретению содержит дистиллированную воду и летучие фракции из свеклы, укропа огородного и петрушки огородной (1 часть каждого) на 100 частей воды.

В следующем аспекте изобретение относится к композиции, содержащей указанный выше препарат согласно изобретению и, по крайней мере, один жизнеспособный микроорганизм либо пробиотический организм, проявляющий терапевтическое или благоприятное биологическое действие, например, в ЖК тракте человека и/или животного, тем самым изобретение относится к пробиотической композиции, либо организм, имеющий промышленное применение, тем самым изобретение относится к композиции, имеющей промышленное применение.

Особое преимущество пробиотических и промышленных композиций проистекает из того факта, что они являются жидкими препаратами. Находясь в биологически активных условиях, препарат служит в качестве поддерживающей среды для живущих бактерий, в противоположность лиофилизированным препаратам, в которых бактерии находятся в состоянии анабиоза. В результате пробиотическая композиция согласно изобретению, например, проявляет активность сразу после перорального введения, начиная с верхнего отдела ЖК тракта, где происходят основные воздействия большинства кишечных патогенов, вызывающих развитие отрицательных желудочно-кишечных синдромов. Пробиотические композиции согласно изобретению также можно применять в качестве препаратов, способствующих увеличению веса тела, или пищевых/кормовых добавок. Аналогично, промышленную композицию согласно изобретению можно использовать с целью эффективного восстановления популяции микроорганизмов, имеющих промышленное применение.

Таким образом, следует отметить, что касается пробиотического применения, пробиотические бактерии, отличные от бактерий, принадлежащих к штамму BU-230-98 (ATCC депозит No.202226, также депонирован в DSM под No. 12799), могут быть использованы с препаратом согласно изобретению, содержащим произведенный из растения материал. Такие пробиотические бактерии имеют очень широкий спектр антагонистической активности. Они также принадлежат к той же филогенетической группе большинства кишечных патогенов и участвуют в таких же системах выживания. Поэтому супрессия и исключение кишечных патогенов может протекать по различным механизмам, например, посредством секреции материала-антагониста, конкуренции за утилизацию питательных веществ и конкуренции за рецепторы адгезии. Таким образом, любые непатогенные бактерии, которые соответствуют указанным критериям, могут применяться в пробиотических композициях согласно изобретению.

Согласно другому аспекту изобретения пробиотические композиции согласно изобретению можно применять для профилактики или лечения желудочно-кишечных инфекций. Термин "желудочно-кишечная инфекция" употребляют в данном тексте, чтобы обозначить любую инфекцию, вызванную кишечным патогеном, включая, между прочим, грамотрицательные и грамположительные бактерии. Улучшая общий баланс и состояние ЖК тракта, препараты и пробиотические композиции согласно изобретению могут также служить инструментом в профилактике инфекций ЖК тракта, вызванных дрожжами, вирусами и простейшими.

Термин «терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество», употребляемый в данном тексте, означает количество, определенное с учетом таких факторов, которые известны в данной области. Количество должно быть достаточным для эффективного восстановления ЖК микрофлоры, которое приводит к нормализации функции ЖК тракта.

В отдельном аспекте пробиотическая композиция, предназначенная для профилактики развития желудочно-кишечных инфекций, включает в себя препарат согласно изобретению, приготовленный из дистиллированной воды и летучих фракций из люцерны, культурной сои, свеклы, укропа огородного и мяты, как указано в тексте, при объемном отношении, например, 5:1:5:15:1, и терапевтически эффективное количество пробиотических бактерий, таких как E.coli ATCC депозит No. 202226 (идентичный DSM 12799), или любых других пробиотических бактерий.

Специфическим примером желудочно-кишечной инфекции является инфекция, которая вызвана микроорганизмом Salmonella, и данное изобретение является особенно предпочтительным для профилактики или лечения желудочно-кишечных инфекций, вызванных указанным микроорганизмом.

Кроме того, пищевую добавку или препарат согласно изобретению, только или в комбинации с эффективным количеством пробиотического микроорганизма, такого как E.coli штамм АТСС депозит No. 202226 (идентичный DSM 12799), можно применять для лечения или профилактики инфекционной диареи, хронической диареи или диареи, являющейся следствием терапии антибиотиками или химиотерапии.

Согласно другому отдельному аспекту изобретения такая пробиотическая композиция, предназначенная для лечения диареи, может содержать дистиллированную воду и летучие фракции из люцерны, культурной сои, свеклы, укропа огородного и мяты при объемном отношении, например, 5:1:5:15:1 и тепаревтически эффективное количество штамма АТСС No. 202226 (DSMZ 12799).

Инфекционная диарея может быть вызвана многочисленными факторами, например микроорганизмом, выбранным из C.difficile, Salmonella, в частности S.Shigella, Campylobacter, E.coli, Proteus, Pseudomonas, Clostridium, кишечным Staphylococcus. Перечисленные микроорганизмы являются немногими из множества инфицирующих агентов.

Кроме того, пробиотическую композицию согласно изобретению можно применять для эффективного восстановления ЖК микрофлоры у субъекта, нуждающегося в таком лечении, приводящего к нормализации функции ЖК тракта. Такие композиции могут включать в себя, например, дистиллированную воду и летучие фракции из люцерны, культурной сои, свеклы, укропа огородного, мяты, петрушки огородной и капусты, предпочтительно при отношении летучих фракций, например, 1:5:5:2:2:1, и терапевтически эффективное количество пробиотических бактерий АТСС депозит No. 202226 (DSM 12799).

Пробиотические композиции согласно изобретению, содержащие, по крайней мере, одну пробиотическую бактерию, оказывающую терапевтическое действие, например, в ЖК тракте, применяют и для других целей, включающих ослабление непереносимости лактозы у субъектов, страдающих от непереносимости лактозы, лечение энтероколита, лечение запора, снижение уровней холестерина в крови, лечение диспептических симптомов и/или стимуляция иммунной системы у субъектов с нарушением иммунной системы, вызванным подавляющей иммунитет терапией.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения летучей фракции из растительного экстракта, причем способ включает в себя стадии: (а) измельчения растительного материала с получением растительной биомассы; (b) смешивания растительной биомассы, полученной на стадии (а), с водой при весовом отношении, предпочтительно, 3 части воды на 1 часть растительной биомассы и перемешивание данной биомассы с водой в течение, по крайней мере, 2 часов при температуре окружающей среды; (с) перегонки смеси, полученной на стадии (b), при пониженном давлении и при температуре бани, предпочтительно не превышающей 38°С; и (d) сбора летучей фракции, полученной при перегонке с водяным паром, причем в дальнейшем фракция может быть разбавлена подходящим буфером.

Летучая фракция согласно изобретению может быть смешана с водой с получением пищевой/кормовой добавки или препарата согласно изобретению. Пищевая/кормовая добавка или препарат согласно изобретению также могут быть приготовлены путем смешивания более одной растительной летучей фракции, полученной способом согласно изобретению. Кроме того, полученная смесь может быть смешана с водой.

Летучие фракции могут быть получены из любого подходящего фрукта, овоща, листа, стебля или корня растения. Растением может быть, например, яблоня, цитрус, культурная соя, свекла, чеснок, капуста или люцерна или травянистое растение, такое как петрушка огородная, мята или укроп огородный. Следует отметить, что при необходимости препарат может также содержать летучие фракции из продуктов пчеловодства, таких как мед или прополис, или другие продукты жизнедеятельности пчел. Указанные летучие фракции могут быть получены таким же способом, как и летучие фракции из растительного экстракта.

Согласно способу изобретения стадию перегонки предпочтительно выполняют при пониженном давлении 5-10 мбар.

Как указано в тексте ранее, пищевая/кормовая добавка или препарат согласно изобретению также могут быть комбинированы, по крайней мере, с одним пробиотическим или промышленным агентом с получением пробиотических или промышленных композиций согласно изобретению. Таким образом, способ получения согласно изобретению также может включать в себя стадию суспендирования, по крайней мере, одного жизнеспособного пробиотического или промышленного микроорганизма в летучей фракции, полученной в указанной выше стадии (d), или в смеси таких летучих фракций, приготовленных как описано выше.

Соответственно отдельному способу согласно изобретению, суспендированный пробиотический микроорганизм может быть новой бактерией согласно изобретению, произведенной из E.coli и депонированной в АТСС под депозитом No. 202226 (и в DSM под депозитом No. 12799).

Наконец, изобретение относится к применению летучей фракции (VF) из растительного экстракта в приготовлении пищевой/кормовой добавки, где VF получают путем перегонки с водяным паром указанного растительного экстракта или из экстракта продукта пчеловодства, такого как мед или прополис, при температуре бани, не превышающей 38°С.

Дополнительные аспекты изобретения включают в себя способ получения композиции, содержащей жизнеспособные микроорганизмы. Способ осуществляют путем суспендирования, по крайней мере, одного микроорганизма в препарате, содержащем, по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) из растительного экстракта. Препарат выбирают так, чтобы сохранить жизнеспособность микроорганизма(ов) в течение, по крайней мере, 2 месяцев при комнатной температуре. Выбранный микроорганизм может быть пробиотическим или иметь промышленное применение. Организмы, которые могут сохраняться в препарате согласно настоящему изобретению, включают в себя Escherichia spp., Alcaligenes spp., Arthrobacter spp., Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Nitrosomonas spp. и Pseudomonas spp.

Как показано на чертеже, в другом аспекте настоящее изобретение относится к диспенсеру 10 микроорганизмов. Диспенсер 10 состоит из резервуара 12 и дозатора 14, соединенных вместе. Резервуар 12 содержит, по крайней мере, один микроорганизм в комбинации с препаратом, содержащим, по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) из растительного экстракта. Препарат выбирают так, чтобы сохранить жизнеспособность микроорганизма(ов) в течение, по крайней мере, 2 месяцев при комнатной температуре. Резервуар 12 может охлаждаться приблизительно до 2-20°С, предпочтительно приблизительно до 4°С. Диспенсер 10 может быть пневматическим диспенсером, который допускает диспергирование в воздухе биоагентов, предназначенных для борьбы с вредителями. Диспенсер может быть ручным. В любом случае распределитель может быть предназначен для автоматического дозирования из него предопределенного объема, например, периодически. С этой целью диспенсер 10 может включать программируемый или контрольно-задающий механизм 16, трубопроводную арматуру 18 и т.д.

Таким образом, согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу биоконтроля организма, который осуществляют путем распределения в эндемической зоне, по крайней мере, одного жизнеспособного микроорганизма, осуществляющего биоконтролирование организма. Жизнеспособный микроорганизм(ы) находится в препарате, содержащем, по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) из растительного экстракта, выбранную так, чтобы сохранить жизнеспособность указанного, по крайней мере, одного микроорганизма(ов) в течение, по крайней мере, 2 месяцев при комнатной температуре.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу устранения нефтяного загрязнения, который осуществляют путем распределения в загрязненной зоне, по крайней мере, одного жизнеспособного микроорганизма, способствующего деградации нефти, такого как Pseudomonas spp. Жизнеспособный микроорганизм(ы) находится в препарате, содержащем, по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) из растительного экстракта, выбранную так, чтобы сохранить жизнеспособность указанного, по крайней мере, одного микроорганизма в течение, по крайней мере, 2 месяцев при комнатной температуре.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу восстановления популяции микроорганизма, деградирующего органические испарения в биофильтре, путем распределения на фильтре, по крайней мере, одного жизнеспособного микроорганизма, такого как Pseudomonas spp., Nitrosomonas spp. или Arthrobacter spp., способствующего деградации органических испарений. Жизнеспособный микроорганизм(ы) находится в препарате, содержащем, по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) из растительного экстракта, выбранную так, чтобы сохранить жизнеспособность указанного, по крайней мере, одного микроорганизма в течение, по крайней мере, 2 месяцев при комнатной температуре.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение предлагает способ получения микроорганизма, используемого для закваски в процессе ферментации, путем выращивания достаточного количества микроорганизма для закваски, такого как Lactococcus spp., Escherichia spp., Bifidobacterium spp., Lactobacillus или Pseudomonas spp., и суспендирования указанного микроорганизма в препарате, содержащем, по крайней мере, одну летучую фракцию (VF) из растительного экстракта, выбранную так, чтобы сохранить жизнеспособность указанного микроорганизма для закваски в течение, по крайней мере, 2 месяцев при комнатной температуре.

Дополнительные цели, предпочтения и новые характеристики настоящего изобретения станут очевидными квалифицированному специалисту в данной области при рассмотрении следующих примеров, которые не стремятся к ограничению. Кроме того, каждые из различных воплощений и аспектов настоящего изобретения, которые представлены в описании выше и которые заявлены в формуле изобретения ниже, находят экспериментальное подтверждение в следующих примерах.

ПРИМЕРЫ

Приведенные здесь следующие примеры, которые вместе с описаниями иллюстрируют изобретение, не несут к ограничительной функции.

Пример 1

Получение «летучей фракции» из растительных экстрактов или из экстрактов продуктов пчеловодства

Свежие овощные растения, доставленные из коммерческих магазинов, тщательно промывали водопроводной водой, рубили и тонко измельчали в промышленном блендере. К овощной биомассе добавляли дистиллированную воду при соотношении 3 части воды на 1 часть овощной массы по весу и оставляли перемешиваться в течение, по крайней мере, 2 часов при температуре окружающей среды.

Затем смесь переносили в выпарную колбу роторного испарителя и выпаривали при пониженном давлении (5-10 мбар) в таких условиях, что температура бани не превышала 38°С и что температура на входе в холодильник составляла 2-5°С. Приблизительно 1 литр конденсата (летучей фракции) собирали из 2,5 кг растительной биомассы. Полученный материал может быть сохранен охлажденным в течение, по крайней мере, 12 месяцев без потери его свойств, как в дальнейшем было проверено.

Такой же способ может быть осуществлен при замене растительного материала на продукты пчеловодства, такие как мед или прополис. Обычно каждую «летучую фракцию» получали из одного типа овощного растения и употребляли при разных разведениях с получением разных смесей для различных целей.

Пример 2

Выделение и рост пробиотического организма E.coli ATCC депозит No. 202226

Пробиотический организм E.coli (депонированный в АТСС под No. 202226 3 мая 1999 г. и в DSM под No. 12799 4 мая 1999 г.) был выделен из E.coli М-17 путем последовательного переноса изолятов, начиная от долгоживущих (2 месяца) организмов, сохраненных в препарате, содержащем летучие фракции из растительного материала, как описано в примере 1 выше, при 37°С и выбирая изоляты, способные конкурировать с патогенами, как будет описано ниже. Пробиотический организм E.coli (депонированный в АТСС под No. 202226 3 мая 1999 г. и в DSM под No. 12799 4 мая 1999 г.) выращивали в следующей среде: (NH₄)₂SO₄ - 5 г/литр, КН₂РО₄ - 13 г/литр, Na₂HPO₄ - 13 г/литр, MgCl₂ - 3 г/литр, CaCl₂ - 0,3 г/литр, дрожжевой экстракт - 10 г/литр, соевый пептон - 10 г/литр и глюкоза - 5 г/литр. Вспомогательные, питательные вещества (дрожжевой экстракт - 1 г/литр, соевый пептон - 2,5 г/литр и глюкоза - 90 г/литр) постоянно добавляли, при этом следили за ростом культуры таким образом, чтобы концентрация глюкозы в бульоне для ферментации поддерживалась на уровне 2 г/литр. рН бульона для ферментации поддерживали нейтральным путем непрерывного добавления 4 г NH₄OH. Культивирование проводили при 30°С в стандартном ферментере при коэффициенте аэрации 0,5 объем/мин в течение 16 часов, когда рост клеток достигал конфлюентности. Указанная процедура приводила к 10¹⁰-10¹¹ клеток/мл. Клетки E.coli собирали центрифугированием, ресуспендировали в солевом растворе и переосаждали. Микробная биомасса могла сохраняться в солевом растворе в холодильнике в течение 48 часов без потери жизнеспособности.

Пример 3

Получение пищевой/кормовой добавки для ускоренного повышения веса тела у животных и птиц

Смесь содержала летучие фракции: люцерны - 50 мл/литр, культурной сои - 200 мл/литр, свеклы - 25 мл/литр и укропа огородного - 100 мл/литр, полученные как описано в примере 1 выше. Баланс был достигнут путем добавления дистиллированной воды.

Пример 4

Получение пищевой добавки для нормализации функции ЖК тракта человека

Смесь содержала летучие фракции: люцерны - 50 мл/литр, культурной сои - 10 мл/литр, свеклы - 50 мл/литр, укропа огородного - 50 мл/литр, мяты - 20 мл/литр, петрушки огородной - 20 мл/литр и капусты - 10 мл/литр, полученные как описано в примере 1 выше. Баланс был достигнут путем добавления дистиллированной воды. Клетки E.coli (АТСС 202226) (пример 2) суспендировали в смеси до концентрации 10⁷ клеток/мл. Для улучшения вкуса можно добавить NaCl (например, 4-10 г/литр).

Пример 5

Получение кормовой (пищевой) добавки для профилактики ЖК инфекций у млекопитающих и птиц

Смесь содержала летучие фракции: люцерны - 50 мл/литр, культурной сои - 10 мл/литр, свеклы - 50 мл/литр, укропа огородного - 150 мл/литр и мяты - 10 мл/литр, полученные как описано в примере 1 выше. Баланс был достигнут путем добавления дистиллированной воды. Клетки E.coli (АТСС 202226) (пример 2) суспендировали в смеси до концентрации 10⁷ клеток/мл. Для улучшения вкуса можно добавить NaCl (например, 4-10 г/литр).

Пример 6

Антагонистическая активность E.coli (ATCC 202226) по отношению к Salmonella typhymirium (ATCC 14028)

Чашки Петри, содержащие модифицированный бриллиантовым зеленым агар, избирательную питательную среду для Salmonella, засевали микроорганизмом S.typhimirium. В агаре была сделана лунка диаметром 9 мм. Определенный объем пищевой добавки (пример 4) был помещен в каждую лунку, и чашки инкубировали в течение 24 часов при 35°С. Процедуру повторяли, но вместо пищевой добавки в лунку помещали жидкость, полученную путем ее фильтрации через микробиологический мембранный фильтр (размер пор 0,45 мкм).

Вокруг каждой лунки, содержащей пищевую добавку, наблюдали зону ингибирования (10-17 мм), лишенную колоний S.typhimirium. Вокруг лунок, содержащих фильтрат без пробиотического организма, зон ингибирования не наблюдали.

Пример 7

Антагонистическая активность E.coli ATCC 202226, а также его родительского штамма E.coli М-17 по отношению к Shigella sps.

Культуры S.flexneri, S.sonnei, E.coli (АТСС 202226) и М-17 отдельно выращивали на питательном агаре в течение 18-20 часов при 37°С. Все культуры собирали в солевом растворе и разбавляли до оптической плотности 10 единиц по Клетту. Аликвоты разбавленных культур вида Shigella (1 мл) только или в комбинации с разбавленной культурой E.coli (АТСС 202226) (1 мл) высевали в вентилируемом шкафу в опытные пробирки, содержащие питательный бульон (5 мл). Пробирки инкубировали в течение 24 часов при 37°С. Количество колониеобразующих единиц (CFU) патогенов и E.coli (АТСС 202226) определяли путем посева культур на питательный агар. Количество CFU двух видов Shigella в чистой культуре и в смешанных культурах с обоими видами пробиотического микроорганизма E.coli приведено в таблице 1 ниже.

Таблица 1Пробиотический организмРост Shigella CFU/млS.flexneriS.sonneiE.coli АТСС 202226
E.coli М-17
Чистая культура Shigella<5х10⁴
1х10⁶
6х10⁶<5х10⁴
2х10⁶
2х10⁶

Пример 8

Употребление пищевой добавки (пример 4) и колибактерина (сухой препарат E.coli M-17) госпитализированными больными с гастроэнтеритом

Группу из 60 больных, у которых развился гастроэнтерит после госпитализации, наугад разделяли на 3 подгруппы со сходным распределением по полу, возрасту и тяжести симптомов гастроэнтерита. Все больные получали нормальное поддерживающее лечение, включая регидратацию, витамины и т.д. Тяжесть состояния не требовала лечения антибиотиками. Первая группа из 20 больных получала 10 мл пищевой добавки (пример 4) 3 раза в сутки за 30 минут до приема пищи в течение 7 дней. Вторая группа, состоящая из такого же количества больных, получала колибактерин (Colibacterinum siccum), как рекомендовано производителем (одна доза дважды в день за 30 минут до приема пищи), и третья группа не получала добавки совсем.

Во всех исследуемых группах отмечали наступление нормализации (в днях) симптомов гастроэнтерита, и данные представлены в таблице 2 ниже.

Таблица 2СимптомыНачало нормализации симптома, дниПищевая добавкаКолибактеринКонтрольТемпература тела2,8±0,22,7±0,23,7±0,2Интоксикация2,5±0,13,6±0,14,6±0,1Боль в животе3,3±0,25,1±0,26,1±0,2Диарея1,8±0,23,4±0,24,4±0,2

Колибактерин (Colibacterinum siccum) представляет собой лиофилизированный препарат живого микроорганизма Е. coli штамма М-17, произведенного BIOMED Ltd., Moscow, Russia и рекомендованного для использования против диареи [Vidal Handbook: Pharmaceutical preparations in Russia (N.B.Nikolaeva, B.P.Alperovich and V.N.Sovinov, Eds.) AstraPharmService, 1997, Moscow, p. 275].

Пример 9

Употребление пищевой добавки (пример 4) больными с острыми ЖК инфекциями

В изучение были вовлечены больные с тяжелыми ЖК инфекциями различной этиологии: сальмонеллез, эшерихиоз, шигеллез, стафилококковые инфекции и пищевые интоксикации неизвестной этиологии. Для всех больных была предписана госпитализация на основании острого наступления заболевания и появления острого гастроэнтерита. Всех 186 больных лечили пищевой добавкой, а подобная группа из 102 больных получала стандартное лечение.

Во всех изученных группах отмечали начало нормализации (в днях) симптомов гастроэнтерита, и данные суммированы в таблице 3 ниже.

Таблица 3СимптомыНачало нормализации, дниИзучаемая группаКонтрольЖар
Слабость
Боль в животе
Диарея
Дни в постели1,2±0,3
1,6±0,2
1,5±0,2
2,3±0,2
4,8±0,32,7±0,3
2,9±0,3
2,4±0,3
4,7±0,4
6,7±0,4

В отдельном исследовании группу из 30 больных с кишечным тифоидом лечили пищевой добавкой. У 80% больных симптомы заболевания исчезали в течение 3 дней. Только в 3 случаях лечение добавкой было остановлено вследствие развития более тяжелого хронического колита.

Пример 10

Употребление пищевой добавки (пример 4) больными с ЖК расстройствами, вызванными антибиотиками

Больных с тяжелыми ЖК расстройствами разделяли на 2 группы. Группа I состояла из 48 больных с пептической язвой, у которых ЖК расстройства развились после лечения антибиотиками против H.pylori. Группа II состояла из 22 больных, у которых ЖК расстройства развились после лечения пневмонии антибиотиками.

Пищевую добавку (5 мл) давали 3 раза в день до приема пищи в течение 7 дней. В обеих группах симптомы диареи исчезали за 2-3 дня у всех больных. После приема добавки полную нормализацию кишечной микрофлоры наблюдали у 84,5% больных. Было продемонстрировано очень сильное увеличение количества микроорганизмов Lactobacilli и Bifidobacteria, снижение общего количества E.coli, полное исчезновение гемолитического микроорганизма E.coli и других патогенов, таких как Staphylococci, Proteus vulgaris и даже Candida sps. У других 15,5% больных наблюдали значительное улучшение.

Пример 11

Употребление пищевой добавки (пример 4) больными с поздним энтероколитом, развившимся после радиационной терапии

Пищевую добавку (10 мл 3 раза в день в течение 14 дней за 30 минут до приема пищи) давали 24 больным с раком матки, толстой кишки и желудка, у которых развился энтероколит после радиотерапии или комбинированной радиотерапии и химиотерапии.

До употребления пищевой добавки все больные жаловались на частые и болезненные позывы к дефекации, жидкий стул (4-12 раз в день), появление слизи (9 случаев) и крови (3 случая) в стуле.

Через два или три дня после приема добавки у всех больных было отмечено уменьшение боли и снижение числа дефекаций; стул имел нормальный вид. Через четыре, пять дней синдром диареи проходил, появление слизи и крови прекращалось. Анализ крови показал, что показатели крови значительно улучшились.

В контрольной группе подобное количество симптомов оставалось существовать.

Пример 12

Употребление пищевой добавки (пример 4) больными СПИДом

У больных со СПИДом часто развивается хроническая диарея. Группе таких больных давали 10 мл пищевой добавки (пример 4) 3 раза в день за 30 минут до приема пищи в течение 20 дней. Контрольная группа не получала добавку. Результаты лечения представлены в таблице 4 ниже.

Таблица 4ПараметрПищевая добавкаКонтрольКоличество больных3020Средний возраст, годы38±136±2Частота ежедневной дефекации:
В начале опыта
В конце опыта
Через месяц после опыта 
3,4±0,3
1,1±0,1
1,5±0,2 
3,6±0,3
3,2±0,3
3,7±0,3Среднее значение начала нормализации6,0±0,7Остается аномальным

У больных, получающих пищевую добавку, наблюдали нормализацию кишечной микрофлоры: снижение общего количества бактерий кишечной группы, исчезновение гемолитической бактерии E.coli, увеличение количества Lactobacilli и Bifidobacteria, снижение количества Candida sps.

Пример 13

Применение пищевой/кормовой добавки (пример 3) для ускорения увеличения веса здоровых поросят

Здоровым поросятам вводили перорально 3 мл пищевой/кормовой добавки на одного поросенка в день до тех пор, пока не отнимали от матки. Группа, получающая кормовую добавку, давала привес при отнятии от матки в среднем на 1,0 кг на одного поросенка более, чем контрольная группа.

Пример 14

Применение кормовой добавки (пример 5) для здоровых поросят

Нескольким сотням здоровых поросят вводили перорально 3 мл кормовой добавки в первый и третий день после рождения и при отнятии от матки. Смертность была сокращена на 50% по сравнению с контрольной группой, получающей стандартное профилактическое лечение антибиотиками. Группа, получающая кормовую добавку, давала привес при отнятии от матки в среднем на 0,39 кг на одного поросенка более, чем контрольная группа. Когда прием кормовой добавки и лечение антибиотиками сравнивали для одного и того же приплода, было обнаружено, что привес у поросят, получающих кормовую добавку, составил на 2,4 кг выше, чем в контроле.

Пример 15

Применение кормовой добавки (пример 5) для поросят, у которых наблюдалась диарея

Нескольким сотням поросят, у которых наблюдалась диарея, давали ежедневно 5 мл кормовой добавки на одного поросенка перорально. Контрольную группу, состоящую из такого же количества поросят, лечили антибиотиками: адвоцином, гентамицином, амоксициллином. Симптомы диареи в группе, получающей кормовую добавку, исчезали в течение 1, 2 дней. Случаев смертности не наблюдали, и поросята развивались нормально. Лечение антибиотиками останавливало диарею у подавляющего большинства поросят, но поросята останавливались в их развитии.

Приблизительно 70 поросятам с замедленным развитием, которые получали лечение антибиотиками против диареи в течение недели и которые рассматривались, в основном, как упущенные, давали кормовую добавку в течение трех дней. Все, кроме двух, выжили.

Пример 16

Применение кормовой добавки (пример 5) для здоровых телят

Однодневным здоровым телятам давали 5 мл кормовой добавки в день с молоком в течение 7 дней. У более чем 95% телят не развивалась диарея до тех пор, пока им не стало 14 дней, когда было диагностировано несколько положительных случаев в отношении ротавируса. Обычно распространение диареи на данной ферме составляло 20-30%.

Пример 17

Применение кормовой добавки (пример 5) для телят, у которых наблюдалась диарея

Телятам, у которых развивалась диарея, давали ежедневно с молоком 10 мл кормовой добавки на одно животное в течение 3-5 дней. Симптомы диареи исчезали в течение 1, 2 дней у 90-95% телят. У оставшихся 5-10% телят диарея была вызвана вирусом. Таких телят лечили антибиотиками с плохими результатами.

Пример 18

Применение кормовой добавки (пример 5) для здоровых ягнят и козлят

Однодневным здоровым ягнятам и козлятам давали 3 мл кормовой добавки в день с молоком в течение 7 дней. В некоторых случаях наблюдали признаки диареи от незначительной до умеренной. Обычно указанные признаки спонтанно исчезали или успешно поддавались лечению при употреблении повышенной дозы кормовой добавки (5 мл). Обычно распространение диареи на таких фермах составляло 50% для ягнят и козлят.

Пример 19

Применение кормовой добавки (пример 5) для ягнят и козлят, у которых наблюдалась диарея

Применение кормовой добавки изучали на стаде, страдающем от патогенных E.coli инфекций. За год, предшествующий эксперименту, приблизительно 90 из 120 ягнят и козлят умерли от диареи. Лечение антибиотиками было неэффективным, поскольку болезнь развивалась внезапно и с быстрым летальным исходом. Ягнятам и козлятам, у которых развивалась диарея, давали с молоком ежедневно 5 мл кормовой добавки на одно животное в течение 3-5 дней. Соответствующую группу животных лечили, как обычно рекомендовано, антибиотиками. Симптомы диареи исчезали в течение 1, 2 дней приблизительно у 90% ягнят и козлят, получающих кормовую добавку. Их дальнейшее развитие было нормальным. В контрольной группе животных, получающих антибиотики (гентамицин), результаты были намного хуже. В этой группе диарея оставалась, что требовало повторного лечения антибиотиками. Развитие в контрольной группе сильно задерживалось.

Пример 20

Применение кормовой добавки (пример 5) для домашней птицы

Кормовую добавку добавляли в питьевую воду со средним потреблением 0,01 мл добавки в день на одного птенца в течение периода разведения птиц (42-49 дней). Увеличение привеса, составляющее 3,2%, которое сопровождалось улучшением переработки пищи на 4%, наблюдали в опытах на бройлерах.

Превосходные результаты также были получены в отношении индеек в возрасте от 1 дня до 6 недель. Каждая птица получала 0,01 мл добавки в день. Привес свыше 10% наблюдали наряду со снижением степени смертности. Птиц, у которых еще наблюдалась диарея, лечили посредством введения пищевой добавки по 0,1 мл в день без какого-либо лечения антибиотиками, и было показано, что они лучше выздоравливали, чем птицы в контрольной группе, которых лечили только антибиотиками.

Пример 21

Применение кормовой добавки (пример 5) для собак и кошек

Применение кормовых добавок для щенков и котят привело к прекращению симптомов диареи в течение 24-48 часов.

Пример 22

Применение кормовой добавки (пример 5) для мышей; доказательство в пользу иммуностимуляции

Двухнедельных мышей С571В1 разделяли на 4 группы из 10 животных в каждой. Мышей лишали воды от 4:00 вечера до 8:00 утра и затем давали 15 мл или воды (группы 1 & 3), или кормовой добавки (группы 2 & 4). Указанную обработку повторяли в течение 2 недель. В конце указанной обработки мышей из групп 3 и 4 подвергали лапаротомии под наркозом посредством эфира. Надрез 1,5 см был сделан в брюшной стенке. Раздражение кишечника осуществляли посредством сухой марли. Через 24 часа после лапаротомии всех мышей убивали; селезенки вырезали. Спленоциты выделяли и культивировали на среде RPMI в течение 48-72 часов в присутствии фитогемагглютинина (РНА). В группе, получающей кормовую добавку, пролиферативная активность спленоцитов, сниженная посредством лапаротомии, восстанавливалась.

Пролиферация спленоцитов, вызванная РНА:

1. Контрольная группа/вода 3060±290

2. Контрольная группа/вода/лапаротомия 2120±300

3. Опытная группа/биококтейль 2740±370

4. Опытная группа/биококтейль/лапаротомия 3040±520

Пример 23

Употребление пищевой добавки (пример 4) человеком; доказательство в пользу иммуностимуляции

Ряд больных оперировали по поводу злокачественных опухолей матки, шейки матки, желудка и кишечника. Больным с гинекологическими опухолями (20 больных) после операции проводили радиотерапию; больным с абдоминальными опухолями (30 больных) проводили химиотерапию. Приблизительно половина больных получала пищевую добавку два раза в день в течение всего курса терапии. У всех больных, получающих пищевую добавку, наблюдали значительную иммуностимуляцию, которую выражали следующим образом:

 Гинекологические опухолиАбдоминальные опухолиКонтрольПищевая добавкаКонтрольПищевая добавкаТ-лимфоциты
(CD3+, HLA-, DR+)0,03±0,010,10±0,031,0±0,11,6±0,2

Трансформация лимфобласта
а. Спонтанная
b. РНА-вызванная530±110
1600±360880±80
5720±2100700±120
4400±13401070±100
13370±3720Фагоциты No (%)60,7±2,976,5±2,257,7±1,574,2±1,9

Пример 24

Эффект сохранения бактерий в препарате

Клетки E.coli были диспергированы в препарате, полученном как описано в примере 1 выше, и сохранялись в течение 6 месяцев при комнатной температуре. Как в начале, так и в конце 6-месячного периода образцы, извлеченные из дисперсии, высевали при соответствующих последовательных разбавлениях на агаровых пластинах с питательным бульоном. Для обоих образцов определяли количество колониеобразующих единиц. В обоих случаях концентрация была 1х10⁷ клеток, что свидетельствует в пользу того, что препарат способствует сохранению микроорганизмов. Указанный выше эксперимент выполняли параллельно с экспериментом, в котором использовали микроорганизм Pseudomonas putida, при этом получали такие же результаты.

Хотя изобретение описано на основании его специфических аспектов, ясно, что многие альтернативные аспекты, модификации и вариации будут очевидны специалистам в данной области. Таким образом, оно стремится охватить все такие альтернативные аспекты, модификации и вариации, которые входят в объем прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в настоящем описании, включены в данный текст в виде ссылки во всей их полноте в такой степени, как если бы специально или индивидуально было предусмотрено включение индивидуальной публикации, патента или патентной заявки в данный текст в виде ссылки. Кроме того, цитирование любой ссылки в данной заявке не должно быть истолковано как признание того, что такую ссылку можно рассматривать как предшествующий настоящему изобретению уровень техники.

Изобретение относится к биотехнологии и касается штамма пробиотического микроорганизма, пробиотической композиции, предназначенной для нормализации физиологической активности желудочно-кишечного тракта, содержащей штамм Escherichia coli BU-230-98 АТСС №202226 (DSM 12799) в качестве активного ингредиента или терапевтически эффективного количества бактерий указанного штамма в сочетании с, по крайней мере, одной летучей фракцией растительного экстракта. Получают пробиотическую композицию суспендированием терапевтически эффективного количества бактерий штамма Е.coli BU-230-98 в летучую фракцию растительного экстракта, который получают водной экстракцией. Указанную летучую фракцию получают путем перегонки с водяным паром указанного растительного экстракта при давлении ниже атмосферного давления и при температуре бани, не превышающей 38°С. Штамм Е.coli BU-230-98 выращивают в питательной среде до достижения оптической плотности 15-30 при 650 нм, что соответствует концентрации 10¹⁰-10¹¹ КОЕ/мл. Пищевой продукт содержит, по крайней мере, один продукт, полученный из молока, и включает бактерии вышеобозначенного штамма Е.coli. Изобретение обеспечивает высокую эффективность в лечении и профилактике различных желудочно-кишечных расстройств, эффективно в качестве увеличивающего привес тела препарата и в качестве иммунного стимулятора у млекопитающих и птиц. 6 н. и 38 з.п. ф-лы, 4 табл., 1 ил.

1. Штамм бактерий Escherichia coli BU-230-98, ATCC №202226 (DSM 12799), предназначенный для нормализации физиологической активности желудочно-кишечного тракта.2. Пробиотическая композиция, предназначенная для нормализации физиологической активности желудочно-кишечного тракта, содержащая в качестве активного ингредиента штамм бактерий Escherichia coli BU-230-98, ATCC №202226 (DSM 12799) и препарат для сохранения жизнеспособности указанного штамма Escherichia coli.3. Пробиотическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит, по крайней мере, одно ароматообразующее вещество.4. Пробиотическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что препарат включает в себя, по крайней мере, одну летучую фракцию растительного экстракта.5. Пробиотическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что указанную летучую фракцию получают путем перегонки с водяным паром указанного растительного экстракта при давлении ниже чем атмосферное давление и температуре бани, не превышающей 38°С.6. Пробиотическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что указанный растительный экстракт получают из части растения, выбранной из группы, состоящей из листьев, стеблей, корней и плода.7. Пробиотическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что указанный растительный экстракт получают из растения, выбранного из группы, состоящей из овощного и травянистого растения.8. Пробиотическая композиция по п.7, отличающаяся тем, что указанное овощное растение выбрано из группы, состоящей из сои, люцерны, чеснока, свеклы и капусты.9. Пробиотическая композиция по п.7, отличающаяся тем, что указанное травянистое растение выбрано из группы, состоящей из петрушки, мяты и укропа.10. Пробиотическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит продукт жизнедеятельности пчел.11. Пробиотическая композиция по п.10, отличающаяся тем, что указанным продуктом жизнедеятельности пчел является прополис.12. Пробиотическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что она предназначена для применения в профилактике или лечении желудочно-кишечных инфекций или расстройств.13. Пробиотическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что она предназначена для применения при сохранении желудочно-кишечной микрофлоры или восстановлении ее до нормы.14. Пробиотическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что она предназначена для применения в профилактике или лечении диареи.15. Пробиотическая композиция по п.14, отличающаяся тем, что она предназначена для применения в профилактике или лечении желудочно-кишечной инфекции, вызванной кишечным патогеном.16. Пробиотическая композиция по п.15, отличающаяся тем, что указанным патогеном является грамотрицательная бактерия или грамположительная бактерия.17. Пробиотическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что указанный препарат содержит дистиллированную воду и летучие фракции из свеклы, укропа и петрушки.18. Пробиотическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что указанный препарат содержит дистиллированную воду и летучие фракции из свеклы, укропа и грейпфрута.19. Пробиотическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что она предназначена для применения в профилактике или лечении желудочно-кишечной инфекции, вызываемой микроорганизмами Salmohella.20. Пробиотическая композиция по п.2, отличающаяся тем, что она предназначена для применения в профилактике или лечении инфекционной диареи, хронической диареи или диареи, являющейся следствием терапии антибиотиками, радиотерапии или химиотерапии.21. Пробиотическая композиция по п.20, предназначенная для лечения инфекционной диареи, отличающаяся тем, что указанный препарат содержит дистиллированную воду и летучие фракции из свеклы, укропа и петрушки.22. Пробиотическая композиция по п.21, отличающаяся тем, что указанная инфекционная диарея вызвана микроорганизмами С.difficile, Salmonella, в частности S.shigella, Campylobacter, E.coli, Proteus, Pseudomonas или Clostridium.23. Пробиотическая композиция, предназначенная для нормализации физиологической активности желудочно-кишечного тракта, содержащая:

(а) терапевтически эффективное количество бактерий штамма Escherichia coli BU-230-98, АТСС №202226 (DSM 12799), и

(b) no крайней мере, одну летучую фракцию растительного экстракта, где указанный растительный экстракт получают водной экстракцией и указанную летучую фракцию получают путем перегонки с водяным паром указанного растительного экстракта при давлении ниже атмосферного давления и при температуре бани, не превышающей 38°С.