ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛИБАКТЕРИНА Российский патент 1996 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 C12N1/20 C12R1/19 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к производству антагонистических биологических препаратов и, в частности, колибактерина. Колибактерин применяют при хронических колитах, дисбактериозе кишечника различной этиологии, долечивании реконвалесцентов после дизентерии, профилактики дизентерии и других кишечных заболеваний (1). Действующим началом колибактерина являются живые бактерии штамма E.coli и, в первую очередь, их метаболиты, антагонистически активные в отношении шигелл Флекснера и Зонне.

Известен штамм Escherichia coli M-17, который в течение 50-ти лет используется для производства калибактерина (2). Есть все основания считать, что он не только исторически устарел, не адаптирован к изменившимся за это время условиям окружающей среды, но и по своим действующим характеристикам значительно уступает предлагаемому штамму. А именно следует отметить его сравнительно невысокую антагонистическую активность в отношении патогенных шигелл; выраженную чувствительность к основным антибиотикам и, особенно, к колицинам; низкую устойчивость к действию физико-химических факторов.

Для усовершенствования биологических препаратов типа колибактерина весьма ценными и необходимыми должны быть следующие характеристики (3):
высокие репродуктивные свойства, что обусловливает их экономическую рентабельность;
повышенная резистентность к наиболее часто применяемым антибиотикам;
выраженная степень устойчивости к известным колицинам;
достаточная резистентность к действию физико-химических факторов;
безвредность, т. е. отсутствие токсичности и иммунных генетических показателей, свойственных условно патогенным микроорганизмам.

Задачей изобретения является получение штамма с более высокими качественными и количественными действующими характеристиками по сравнению со штаммом М-17.

Заявляемый штамм бактерии Escherichia coli ЛЭГМ N 18 депонирован во Всесоюзный коллекции промышленных микроорганизмов института "ВНИИ генетика" под N В-6240 8 июня 1992 года.

Штамм E. coli ЛЭГМ N 18 обладает всеми свойствами, характерными для семейства Enterobacteriaceae, рода Escherichia и является типичным представителем вида Escherichia coli commune. Штамм ЛЭГМ N 18 был выделен при плановом углубленном медосвидетельствовании здорового человека в баклаборатории СЭС г. Перми. Это обусловливает присущую ему природную приживляемость в организме человека. Видовая идентификация штамма проведена по системе ТИМАЦ'а. В результате всесторонних проверок он отобран как лучший среди более 800 штаммов, исследованных в процессе 7-летних работ по изучению природных популяций микроорганизмов в организации-заявителе.

Заявляемый штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Бактерии представляют собой короткие с округлыми концами подвижные палочки с размерами 0,5 на 1,5μ, расположенными в мазке в виде отдельных клеток или небольших скоплений. Грамотрицательны, спор не образуют, капсулы не имеют. На полноценной агаровой среде через 18-20 часов роста при температуре +37^oC образуют гладкие, круглые с ровными краями колонии диаметром 2,0-2,5 мм. В жидкой полной среде (мясо-пептонный бульон, казеиновый гидролизат) вызывают равномерное помутнение.

Биологические признаки.

Штамм не утилизирует цитрат и малонат натрия, не образует ацетоин на среде Кларка, разлагает лактозу при +42^oC, не продуцирует оксидазу. В органической среде продуцирует индол, не образует сероводород, не разлагает мочевину, не продуцирует фенилаланиндезаминазу. Штамм не обладает желатиназной активностью, не ферментирует лизин; расщепляет глюкозу, лактозу, маннит, сахарозу до кислоты и газа. Таким образом, штамм ЛЭГМ N 18 видотипичен по своим биохимическим свойствам.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выделение штамма бактерий Escherichia coli ЛЭГМ N 18.

Исходный материал (испражнения человека) разводили в пробирке физиологическим раствором приблизительно в 10 раз. После отстаивания берут бактериологической петлей с поверхности каплю жидкости и делают посев штрихом на 2 чашки Петри с дифференциально-диагностической средой Эндо для получения изолированных колоний. После суток роста при +37^oC выбирают характерную по внешнему виду (темно-красную с металлическим блеском) колонию и используют ее для получения чистой культуры высевом на скошенный мясо-пептонный агар. Затем следует определение видовой принадлежности выделенного штамма по системе ТИМАЦ'а. Последняя состоит в изучении типичности культуральных, биохимических (ферментативных, сахаро- и протеолитических) и тинкториальных свойств, морфологии выделенных бактерий. Полное соответствие этих признаков требуемым для кишечной палочки дает основание для развернутой проверки выделенного штамма по всем характеристикам, необходимым качественному производственному (для колибактерина) штамму. Сюда относятся: изучение динамики развития на жидких и плотных питательных средах; антагонистической активности в отношении сопутствующей условно патогенной микрофлоры; наличия и уровня устойчивости к основным антибиотикам; чувствительности к колицинам; устойчивости к действию физико-химических факторов (КФ облучение, активный хлор); безвредности, т. е. отсутствию токсичности и антигенных показателей, свойственных условно патогенным микроорганизмам. Все эти исследования проводили параллельно с существующим штаммом М-17 и сравнивали с ним. В таблице приведены сравнительные характеристики свойств и показателей заявляемого штамма ЛЭГМ N 18 с прототипом (штамм М-17).

Из приведенных в таблице данных следует, что заявляемый штамм E.coli ЛЭГМ N 18 по своим показателям значительно превосходит существующий аналог (штамм М-17).

Таким образом, штамм Escherichia coli ЛЭГМ-18 отличается более высокими репродуктивными свойствами, высокой антагонистической активностью в отношении болезнетворных шигелл Флекснера и Зонне, повышенной устойчивостью к 9 типам колицинов, абсолютной нечувствительностью к 5-ти и повышенной резистентностью к другим антибиотикам, повышенной устойчивостью к действию активного хлора и УФ облучения. Эти характеристики, как и отсутствие у штамма ЛЭГМ-18 гемолитических и энтеротоксических признаков, а также типичных для условно патогенных микробов антигенов позволяет не только рекомендовать, но и предпочесть его в качестве претендента на роль производственного штамма при изготовлении колибактерина взамен используемого сейчас М-17.

Пример 2. Использование штамма бактерий Escherichia coli ЛЭГМ-18 для получения колибактерина.

Технология производства колибактерина сводится к следующему.

Восстанавливают лиофилизированный и отконтролированный штамм E.coli N 18, для чего содержимое каждой из вскрытых ампул разводят в 5 мл мясо-пептонного бульона и выращивают в пробирках при температуре +37^oC в течение 18-20 часов. После этого микробную культуру из каждой пробирки пересевают на бактериологические матрицы с казеиновым агаром и выращивают при тех же параметрах. Затем делают смывы (по 50 мл физиологического раствора на матрац) и переносят их в реактор с казеиновым гидролизатом, где выращивают в течение 5-6 часов при температуре +37^oC при постоянном перемешивании, продувке стерильным воздухом, периодических добавках глюкозы до плотности 50-60 млрд микробных клеток в 1 мл культуры (по стандарту мутности). При этом количество живых микроорганизмов должно составлять не менее 20 млрд/мл (по данным микроскопии с фазовым контрастом). Полученную микробную взвесь разливают в стеклянные ампулы по 3 мл и в течение 36-42 часов при остаточном давлении 70 Па проводят ее лиофилизацию с последующим запаиванием ампул под вакуумом (или в атмосфере инертного газа). Сухой препарат имеет вид крупно- или мелкопористой массы желтоватого цвета. Все операции приготовления колибактерина проводят с соблюдением стерильности. Контроль готового колибактерина проводят, согласно Регламенту производства (5): на растворимость, стерильность, антагонистическую активность против шигелл и общую безвредность (на белых мышах). При контроле штамма ЛЭГМ-18 (1 раз в квартал), помимо перечисленных, следует проверять его чувствительность к наборам антибиотиков и колицинов стандартными методами.

Литература
1. Справочник по применению бактериальных и вирусных препаратов. Изд. Медицина. М. 1980.

2. Наставление по применению сухого колибактерина. Пермское НПО "Биомед". Пермь, 1969. прототип.

3. Пшеничнов Р.А. Колотвинов С.В. Основы построения системы генетического мониторинга природных популяций микроорганизмов. Изд. УНЦ АН СССР, Свердловск, 1986, 118 стр.

4. Справка института "ВНИИ генетика". Москва, 8 июня 1992 г.

5. Регламент производства колибактерина сухого N 153-80. Утв. Главным управлением по производству бактерийных и вирусных препаратов МЗ СССР. М. 26 июня 1980. ТТТ1 ТТТ2

Использование: медицинская микробиология - производство антагонистических биологических препаратов. Сущность изобретения: предложен новый природный штамм Escherichia coli /ЛЭГМ N 18/ ВКПМ В-6240 для производства колибактерина - высокоэффективного биологического средства, способствующего восстановлению нормального биоценоза кишечника. По морфологическим, культуральным и физиологическим свойствам относится к семейству Enterobacteriaceae роду Escherichia и является типичным представителем вида Escherichia coli commune. По сравнению со штаммом М-17 предлагаемый штамм ЛЭГМ-18 отличается более высокими репродуктивными свойствами, высокой антагонистической активностью в отношении болезнетворных шигелл Флекснера и Зонне, повышенной резистентностью к большинству колицинов и антибиотиков, апатогенен, нетоксичен, обладает повышенной устойчивостью к действию активного хлора и УФ облучения. Полученный из штамма ВKПМ В-6240 колибактерин более перспективен при санации хронических колитов, дисбактериозе кишечника различной этиологии, долечивании реконвалесцентов после дизентерии, профилактики дизентерии и других кишечных заболеваний. 1 табл.

Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В 6240, используемый для получения колибактерина.