СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА ЦЫПЛЯТ Российский патент 2009 года по МПК A61K35/66 A61P1/14 

Изобретение относится к области медицины, а именно к препаратам для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) на основе пробиотиков (живых микроорганизмов или веществ микробного происхождения, оказывающие при естественном способе введения позитивное воздействие на физиологические, биохимические и иммунные реакции хозяина через стабилизацию и оптимизацию функции его нормальной микрофлоры) и может быть использовано в ветеринарии, медицине, пищевой промышленности и смежных отраслях.

В настоящее время для решения сходных задач предполагается вводить в организм перорально препараты, содержащие отдельные колонии микроорганизмов, в частности биопрепараты на основе молочнокислых микроорганизмов (ЕР 0097484, 1984, кл. А23С 1/05: ЕР 0043962, 1980, кл. А23С 19/086: US 4289888, 1979, кл. А23С 9/123). Препараты, как правило, содержит клетки бактерий, остатки культуральной жидкости (КЖ), жиры, белки, лактозу, камедь и другие добавки. Состав композиций определяются особенностями используемых микроорганизмов и характером поставленной задачи.

Известен лечебно-профилактический биопрепарат Бактиспорин для лечения широкого круга заболеваний, содержащий лиофильно высушенную биомассу штамма Bacillus subtilis 3Н и защитную среду на основе сахарозо-желатиновой смеси или лактозы (RU №2130316, А61К 35/66, 1999). Однако биопрепарат Бактиспорин не эффективен против ряда возбудителей острых кишечных инфекций, например, вызываемых бактериями рода Pseudomonas spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp.

Известен препарат Биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека, содержащий живые клетки штаммов Bacillus subtilis 3 (ВКПМ № В-2335) и Bacillus licheniformis 31 (ВКПМ № В-2336), а также наполнитель (RU №1722502, А61К 35/74, 1992). Биоспорин характеризуется высокой антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов, однако входящие в его состав штаммы чувствительны к антибиотикам, поэтому препарат не рекомендуется применять при лечении совместно с антибиотиками.

Известны препараты на основе ацидофильных микроорганизмов (RU 2064269, кл. А23С 9/12, 1994; SU 1227145, кл. А23С 9/123, 1983; RU 2080795, кл. А23С 9/12, 1997), содержащие клетки бактерий и остатки культуральной жидкости (КЖ) с некоторыми добавками, улучшающими его эксплуатационные характеристики (желатин, сахарозу, обезжиренное молоко), а также воду.

Недостатком таких препаратов является их относительно невысокая биологическая активность, связанная с процессом дезактивации живых микроорганизмов при их прохождении через верхние отделы ЖКТ (желудок, двенадцатиперстная кишка), а также отсутствие стабильности их биологических свойств при длительном хранении, что ведет к снижению эффективности лечебно-профилактических процедур.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому препарату является препарат «Витафлор» (пат. РФ №№2169573, 2001), который представляет собой симбиотическую культуру молочнокислых бактерий, включающую в себя Lactobacillus acidophilus Д-75, и штамм Lactobacillus acidophilus Д-76, депонированные в коллекции ВНИИ СХМБ 16.07.1997, при соотношении микроорганизмов указанных штаммов от 4:1 до 1:4 и при содержании живых клеток от 1 до 10 млрд клеток на 1 г препарата.

Препарат "Витафлор" способствует адаптации организма к неблагоприятным внешним воздействиям и используется, в частности, для лечения мальтлимфом желудка (пат. РФ №2269353, 2006), а также при изготовлении различных пищевых продуктов (пат. РФ №2202217, 2003; пат. РФ №2178975, 2002). Препарат не инактивируется компонентами желудочного сока и его лечебное действие сохраняется, по крайней мере, в течение 1 часа. Использование в качестве пробиотика симбиотической системы способствует вытеснению из желудочного тракта патогенных микроорганизмов и тем самым - выздоровлению больного.

Недостатком «Витафлора» является относительно невысокая противоинфекционная активность, в результате чего необходимо использовать длительные (2-3 месяца) курсы введения препарата, что делает его малоперспективным для использования в промышленном птицеводстве.

Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание на основе «Витафлора» более эффективного препарата, обладающего более сильным и быстрым лечебно-профилактическим действием по отношении к широкому спектру инфекционных заболеваний.

Техническая задача решалась в создании препарата, в состав которого наряду с пробиотиком входила композиция, содержащая антибиотик, при этом природа, концентрация и условия введения не вызывают деактивации штаммов бактерий. В качестве антибиотика использовали энрофлоксацин, который обладает широким антибактериальным спектром против грамположительных и грамотрицательных бактерий и микоплазм: Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma meleagridis, Ecsherichia coli, Salmonella spp., Haemo-philus spp., Pasterella spp., Brodetella spp., Erysiplelothrix rhusiopathiac Kibsiella spp., Staphylococcus aureus., Streptococcus spp. и т.п.

Технический результат достигался в результате использования препарата, содержащего симбиотические микроорганизмы препарата «Витафлор», в который дополнительно включены энрофлоксацин и поверхностно-активное вещество (ПАВ) - твин-80 при следующем соотношении ингредиентов (мас.%):

симбиотические микроорганизмы препарата «Витафлор» - 10-20;

энрофлоксацин - 75-85;

твин-80 - 1-2.

Особенностью препарата является использование энрофлоксацина в водорастворимой форме, что, как выяснилось в результате проведенных экспериментов, практически не оказывает негативного воздействие на данную симбиотическую систему, в то время как действие антибиотика на патогенные микроорганизмы в основном сохраняется. В частности, энрофлоксацин сохраняет антибактериальное действие против таких микроорганизмов, как Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma meleagridis, Ecsherichia coli, Salmonella spp., Campylobacter spp., Haemophilus spp., Pasterella spp., Brodetella spp., Erysiplelothrix rhusiopathiac Kibsiella spp., Staphylo-coccus aureus., Streptococcus spp. и ряд других.

Использование энрофлоксацина в концентрации более 85% приводит к торможению развития молочнокислых симбионтов, при концентрации менее 75% ослабляется его антиинфекционное действие.

Использование концентрации «Витафлор» менее 10% масс не позволяет получить в организме устойчивую популяцию микроорганизмов, что снижает длительность позитивного воздействия препарата и ведет к необходимости дополнительного введения в организм пробиотика. Использование его в более высоких концентрациях уменьшает антиинфекционное действие в связи с уменьшением содержания антибиотика.

Выбор концентрации твин-80 определяется концентрацией антибиотика и особенностями используемого раствора. Концентрация ПАВ должна обеспечивать полный перевод антибиотика в водорастворимую форму. Излишние количества твин-80 не способствуют улучшению свойств препарата.

Оптимальное содержание компонентов в препарате составило «Витафлор» - 16%; твин-80 - 1,6%, энрофлоксацин - 82,4%. Основные исследования были проведены на данной композиции препарата, получившего условное наименование «Лактофторхин».

Препарат в лечебно-профилактических целях применяют, как правило, в виде 5-10% водного раствора для выпаивания птиц. При этом наряду с лечебно-профилактическим воздействием отмечалось повышение на 10-15% среднесуточного прироста живой массы птицы.

Препарат представляет собой гомогенную взвесь желтовато-белого цвета, без наличия плесени и комочков, с кисломолочным запахом. Выбранная доза обусловлена, с одной стороны, необходимостью введения достаточно больших количеств активного начала и учитывает рекомендуемые дозы введения антибиотика в организм (ежедневная профилактическая и лечебная доза энрофлоксацина 3-5 мг/кг массы птиц в течение 3 дней при колибактериозе и 5 дней при сальмонеллезе), а с другой стороны, более высокая концентрация препарата придает воде специфический привкус, затрудняя выпаивание птиц.

Препарат получают смешением и тщательным перемешиванием входящих в него продажных сухих ингредиентов. Перед использованием препарат при перемешивании растворяют в заданном количестве воды.

Препарат Лактофторхин ветеринарный показал эффективность при профилактике и лечении острых кишечных инфекционных болезней (сальмонеллез, колибактериоз, геморрагический энтерит, кампилобактериоз, микоплазмоз), а также осложнений после переболевания инфекционными болезнями (гриппом, НБ, ИЛТ, ИБ и инфекционная бурсальная болезнь), хронических отравлений, вызванных скармливанием пораженных комбикормов плесневыми грибами, микотоксинами, и энтеритов различной этиологии. Может рекомендоваться как антистрессовый фактор при переходе с одного вида кормления на другой.

Пример 1. Влияние состава и дозировки композиции на кишечный микробиоценоз цыплят при экспериментальном колибактериозе.

Для определения влияния состава композиции на микробиоценоз кишечника и выбор оптимальной рецептуры и дозы препарата проводили эксперименты в условиях вивария.

В экспериментальных исследованиях были использованы цыплята-бройлеры кросса Барос. Птиц содержали в виварии, в клеточных батареях типа БКМ-3Б. Кормление осуществляли согласно "Рекомендациям по нормативному кормлению сельскохозяйственной птицы", МСХ СССР, 1983. В виварий цыплят доставляли автомобильным транспортом через 6-8 ч после выборки.

Цыплят опытных и 1-ой контрольной групп заражали культурой Е.coli в дозе ЭЛД₅₀ (около 500 млн. микробных тел на 1 голову). Перед заражением цыплят определяли заражающую дозу возбудителя (ЛД₅₀) на одновозрастных птицах.

Цыплятам 1-й опытной группы ежедневно выпаивали 10% раствор лактофторхина, состава: препарат «Витофлор» - 10%, энрофлоксацин - 88%, Твин-80 - 2%) в дозе 10⁶ микробных тел на голову (исходя из концентрации молочнокислых бактерий в сутки, в течение 3 дней, начиная с суточного возраста, по схеме, изложенной ниже.

Цыплятам 2-й опытной группы ежедневно выпаивали 5% раствор лактофторхина, состава: препарат «Витофлор» - 20%, энрофлоксацин - 79%, Твин-80 - 1% в дозе 10⁷ микробных тел на голову в сутки (исходя из концентрации молочнокислых бактерий) один раз в день, начиная с суточного возраста, по схеме, изложенной ниже.

Цыплятам 3-й опытной группы ежедневно выпаивали 8% раствор лактофторхина, состава: препарат «Витофлор» - 16%, энрофлоксацин - 72,4%, Твин-80 - 1,6% в дозе 10⁶ микробных тел на голову в сутки (исходя из концентрации молочнокислых бактерий) один раз в день, начиная с суточного возраста, по схеме, изложенной ниже.

Цыплятам 4-й опытной группы ежедневно выпаивали 8% раствор лактофторхина, состава: препарат «Витофлор» - 16%, энрофлоксацин - 72,4%, Твин-80 - 1,6% в дозе 10⁷ микробных тел на голову в сутки (исходя из концентрации молочнокислых бактерий) один раз в день, начиная с суточного возраста, по схеме, изложенной ниже.

Контрольным группам выпаивали физиологический раствор.

Схема выпаивания лактофторхина состояла в следующем: цыплят выдерживали 2 ч без воды, затем птице опытных групп в поилку наливали препарат, растворенный в 10 мл кипяченой воды, цыплятам контрольной группы - 10 мл физиологического раствора. Через 45-60 мин в поилки наливали питьевую воду. Для определения количественного и качественного состава микрофлоры фекалий цыплят контрольной и опытных групп исследовали в суточном, 8-дневном и 15-дневном возрасте. Данные кишечного микробиоценоза представлены в табл.1.

Динамика кишечного микробиоценоза у цыплят в контрольных группах без E.coli и опытных группах с E.coli, где использовали Лактофторхин существенно не отличается.

Таким образом, применение цыплятам, содержащимся в виварии, Лактофторхина ветеринарного в жидкой форме, начиная с суточного возраста, не повлияло на динамику формирования кишечных популяций лактобактерий, бифидобактерий, стафилококков, но замедлило колонизацию кишечника микроорганизмами семейства энтеробактерий. Уменьшение популяционного уровня этих микроорганизмов в кишечнике может снижать вероятность возникновения желудочно-кишечных заболеваний, вызываемых кишечными микроорганизмами.

Дозы 10⁸-10⁹ микробных клеток на голову в сутки являются экономически невыгодными, т.к. при этом значительно увеличивается расход пробиотика. Исходя из этого, при проведении дальнейших экспериментов были выбраны варианты дозировок 10⁶ и 10⁷ микроорганизмов на голову в сутки.

Различий между опытными группами, получавшими лактофторхин в данном диапазоне концентраций в дозах 10⁷ и 10⁶ микробных тел на голову, не выявлено.

Пример 2. В ООО «Племенная птицефабрика Лебяжье» в течение 3 месяцев были проведены испытания препарата Лактофторхин в дозе 10⁶ микроорганизмов на голову в сутки на трех группах цыплят по 10000 голов в каждой группе. Препарат вводили птицам в ходе выпаивания. В качестве контроля использовали цыплят, которым давали энрофлоксацин в эквивалентных дозах.

Средние показатели по трем партиям птицы, при выращивании которых использовали Лактофторхин ветеринарный, представлены в таблице 2, в качестве контроля приведены усредненные данные по трем партиям цыплят, которым применяли антибиотик.

Таблица 2 Воздействие препарата Лактофторхин на сохранность цыплят. Производственные показатели Группа цыплят, опыт Группа цыплят, контроль Номер группы 1 2 3 1 2 3 Сохранность, % 93,8 95,7 96,1 85,4 89,6 88,5 Среднесуточный прирост живой массы, г 50,9 52,1 53,1 40,8 42,5 43,3 Расход корма 2,01 2,03 2,05 2,05 2,1 2,1

Пример 3. Эффективность использования препарата Лактофторхин против сальмонеллеза птиц была показана в модельных опытах по экспериментальному заражению цыплят кросса «Бройлер-6» сальмонеллами штамма S.enteritidis.

Цыплятам с суточного возраста в течение 5 дней применяли препарат Лактофторхина с питьевой водой групповым методом. В возрасте 7 дней цыплят опытных и контрольных групп алиментарно заражали S.enteritidis в дозе 3·10⁸ микробных тел. Через 6 дней после заражения по 5 цыплят из подопытных и контрольных групп исследовали бактериологически на наличие сальмонелл во внутренних органах, а также по клиническому проявлению болезни, сохранности птицы. Бактериологические исследования проводили согласно методическим указаниям по лабораторной диагностике сальмонеллеза человека и животных, обнаружению сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды.

Полученные результаты по профилактическому действию препарата приведены в таблице 3. Проведенные эксперименты показали, что препарат лактофторхин при групповом применении с питьевой водой в течение 5 дней полностью предотвращает не только клиническое проявление болезни, но и формирование бактерионосительства при алиментарном инфицировании цыплят в возрасте 7 дней в дозе от 10³ до 10⁶ сальмонелл.

У птиц опытных групп при указанных заражающих дозах не выделены сальмонеллы из внутренних органов через 6, 55 дней после заражения. Следует подчеркнуть, что на фоне применения препарата лактофторхина сальмонелл не удалось обнаружить не только во внутренних органах, но и на слизистой слепых отростков кишечника.

В контрольных группах выявлены реагирующие и выделены возбудители сальмонеллеза даже при инфицировании птиц в дозе 10³-10⁴ микробных тел как со слизистой кишечника, так и из внутренних органов.

При заражающих дозах от 10⁶ до 3·10⁸ микробных тел S.enteritidis препарат предупреждает клиническое проявление болезни, обеспечивает 94-96%-ную сохранность, снижает степень обсеменения внутренних органов.

Для оценки эффективности лечебного воздействия при сальмонеллезе в возрасте 7 дней цыплят опытных и контрольных групп алиментарно заражали S.enteritidis в дозе 3·10⁸ микробных тел.

Цыплятам в подопытных группах препарат Лактофторхин вводили через 1, 6, 12 и 24 часа с питьевой водой групповым методом после заражения цыплят патогенным штаммом S.enteritidis; в контрольных группах применяли физиологический раствор.

Терапевтическую эффективность учитывали через 6 дней после заражения. Для этого отбирали по 5 цыплят из подопытных и контрольных групп и исследовали бактериологически на наличие сальмонелл во внутренних органах, а также оценивали общее состояние птицы, клинические проявления болезни, сохранность, данные патологоанатомических исследований. Полученные результаты приведены в таблице 4.

Из данных таблицы следует, что лактофторхин при однократном введении обладает выраженным терапевтическим эффектом до 12 часов после заражения цыплят патогенным штаммом S.enteritidis. При введении препарата через 24 часа после заражения цыплят терапевтическая эффективность снижается до 20%.

Таким образом, применяя препарат лактофторхин без использования каких-либо иных лекарственных средств, можно решить эпизоотологические и эпидемиологические аспекты проблемы сальмонеллеза в промышленном птицеводстве.

Таблица 4 Уровень терапевтической эффективности препарата Лактофторхина при заражении цыплят S.enteritidis в зависимости от сроков введения препарата Время введения препаратов после заражения (ч) Количество цыплят в группе (гол.) Заболело (гол.) Пало (гол.) Наличие патологических изменений (гол.) Выд. культ. E.coli КТЭ % 1
6 20
20 6
11 0
5 0
7 1
10 100
75 12 20 19 10 13 19 50 24 20 20 13 17 20 35 зараженный             контроль 20 20 20 20 20 0 не зараженный             контроль 20 0 20 0 0 -

Приведенные данные практического применения препарата лактофторхин показывают, что заявляемая композиция обладает лечебно-профилактическим воздействием на птицу при инфекционных заболеваниях, а также способствует повышению среднесуточного привеса цыплят.

Изобретение относится к области ветеринарии. Средство содержит симбиотическую систему штаммов молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus Д-75 и Д-76 препарата «Витафлор», энрофлоксацин и твин-80 при следующем соотношении ингредиентов (мас.%): симбиотические микроорганизмы препарата «Витафлор» - 10-20; энрофлоксацин - 75-85; твин-80 - 1-2. Средство снижает падеж молодняка птиц и способствует повышению среднесуточного привеса цыплят на 10-15%. 4 табл.

Средство для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта цыплят на основе симбиотической системы штаммов молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus Д-75 и Д-76 препарата «Витафлор», отличающееся тем, что оно дополнительно содержит энрофлоксацин и твин-80 при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:
симбиотические микроорганизмы препарата «Витафлор» 10-20 энрофлоксацин 75-85 твин-80 1-2