СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (ТОКСИЧНОСТИ) КОМПОНЕНТОВ ГАЗОВЫХ СРЕД И ЕЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ОСОБИ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/02 

Изобретение относится к области токсикологии, фармакологии, санитарии, медицины, экологии, контроля качества продуктов питания, твердых материалов и жидкостей, содержащих растворенные газы, и может быть использовано для определения токсичных свойств водорастворимых соединений в газовой среде, а также диагностики величины негативного воздействия этих соединений на живые организмы.

Известен способ оценки так называемой «токсичности» воздушной среды по интенсивности биолюминесценции бактерий «Эколюм» и измерительного прибора серии «Биотоке» // Оценка токсичности воздушной среды по интенсивности биолюминесценции бактерий. Методические рекомендации. Минздрав России, М. 2000 г., 19 с. Способ основан на поглощении фильтрами АФА-ХА-20 из 10 м³ атмосферного воздуха или воздуха жилых помещений твердых и аэрозольных частиц (с фиксированием атмосферного давления, температуры и влажности воздуха, направления и силы ветра во время отбора проб воздуха) с последующим выдерживанием фильтра с 5 мл дистиллированной воды в течение часа (для извлечении водорастворимых соединений из сорбированных фильтром частиц), добавления люминесцирующих бактерий и определения интенсивности биолюминесценции. В качестве контрольной пробы используют чистый фильтр, выдержанный в течение 1 часа в 5 мл дистиллированной воды. Критерием токсичности водного раствора служит величина «Индекса токсичности», обозначаемого символом «Т», Т=(I_o-I)/I_o, где I_о, I - соответственно интенсивность свечения бактерий в контроле и анализируемой пробе. По величине индекса токсичности анализируемые пробы классифицируют на три группы: «допустимая степень токсичности» (Т<20), «образец токсичен» (20<Т<50), «образец сильно токсичен» (Т>50).

Основные недостатки способа заключаются в том, что в воздухе определяют только твердые и неизвестное количество жидких аэрозольных частиц, а газовая составляющая из органических и неорганических компонентов не улавливается фильтром АФА-ХА-20, а в результате не оценивается ее вклад в токсичность атмосферного воздуха. Кроме того, выдерживание фильтра с дистиллированной водой в течение часа не гарантирует установления термодинамического равновесия между загрязняющими веществами в твердых частицах и водным раствором, а выбранный критерий (индекс токсичности) является мало информативным.

Известен способ определения концентрации или дозы веществ, вызывающих гибель 50% особей живых организмов (ЛС50 или ЛД50) [Беспамятнов Г.П., Кротов Ю.А. Предельно допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде. Л. Химия, 1985, 528 с.]. Основная последовательность действий заключается в размещении подопытных животных в затравочных камерах, обеспечивающих достаточную подвижность животных, оптимальный воздухообмен, очищенный от примесей, при температуре 20-25°С и влажность 70-75%. Необходимую концентрацию химических веществ создают с помощью специальных дозаторов, тип и конструкция которых зависит от агрегатного состояния вещества и особенностей их физических и химических свойств. Действие вещества изучается в 4-х месячном эксперименте.

Основные недостатки способа определения ЛС50 или ЛД50 заключаются в трудности эмпирического подбора диапазона и исследуемых концентраций химического вещества, требующих постановки специальных прикидочных опытов, ограниченной объективности оценок специфичности воздействия только испытуемого вещества на испытуемый объект, так как с воздухом могут поступать в организм испытуемого объекта другие загрязняющие вещества, большой длительности испытаний и высокой стоимости всего цикла получения и обобщения полученных результатов для каждого вида живых организмов, а также малой информативности величин ЛС50 и ЛД50.

Известен санитарно-гигиенический способ определения предельно допустимой (безвредной) для человека концентрации (ПДК) химических веществ и концентрации индивидуальных соединений в атмосферном воздухе или другой газовой смеси, основанный на принципе порогового действия вне зависимости от характера действия (общетоксического, раздражающего, канцерогенного, мутагенного, аллергического и т.п.). Указанный способ не позволяет адекватно оценивать воздействие двух и более компонентов в газовой фазе даже на человека из-за проявления эффектов синергизма-антагонизма при совместном действии двух и большего количества компонентов, кроме того, его применимость затруднительна из-за невозможности идентификации, количественного определения инструментальными методами многих тысяч всегда присутствующих в воздухе индивидуальных соединений и ограниченности установленных значений ПДК для индивидуальных соединений. Кроме того, санитарно-гигиенический критерий не распространяется на другие виды живых организмов.

Наиболее близким аналогом изобретения является «Способ количественного определения биологической активности (токсичности и стимулирующей способности) тестируемых объектов с использованием биосенсоров». Патент на изобретение №2215291, заключающийся в подготовке образцов биосенсоров, исследуемых и контрольных объектов, который включает стадии выбора биосенсора из одной партии, адаптации его к условиям эксперимента и выдерживания одновременно при тождественных условиях в тестируемом и контрольном объектах в течение заданного времени, измерения наиболее чувствительного параметра (отклика) к воздействию на биосенсор компонентов в тестируемом объекте, нахождения зависимости относительного отклика биосенсора от концентрации компонентов в тестируемом объекте, определение коэффициента биологической активности, а затем биологической активности (токсичности) компонентов в тестируемом объекте.

Основной недостаток способа связан с тем, что с его помощью невозможно прямое определение суммарного воздействия токсичных компонентов газовых сред и нахождение критериев воздействия токсичных веществ в газовых средах на живые организмы.

Целью предлагаемого изобретения является возможность создания с использованием неселективных биотестов или биосенсоров (далее биотесты) способа определения суммарного загрязнения газовых сред водорастворимыми соединениями и критериев их воздействия на особи живых организмов.

Предлагаемый способ вообще не требует идентификации и количественного определения содержания индивидуальных соединений и введения каких-либо нормативов на них типа ПДК, а фиксирует воздействие всех присутствующих в тестируемой среде компонентов на неселективные биотесты особи живых организмов.

В основу предлагаемого способа положены известные представления о механизме поступления токсикантов в живой организм из газовых сред ингаляционным путем с промежуточной стадией растворения их в водном субстрате организма, а также методы физической химии, касающиеся закономерностей распределения водорастворимых веществ между газовой и жидкой фазами с последующим проявлением негативного воздействия растворенных соединений в водном субстрате на живые организмы с летальным исходом.

Для определения критериев выживаемости особей живых организмов от воздействия на живые организмы токсичных компонентов газовых сред используют термодинамически равновесные водные растворы с тестируемой газовой средой, которые воспроизводимо характеризуют их токсичное воздействие на живые организмы.

Поставленная цель достигается тем, что при определении суммарной токсичности газовых сред сначала получают термодинамически равновесный раствор между компонентами газовых сред и выбранным растворителем при фиксированных условиях: температура, соотношение газовой и жидкой фаз, давление и т.д. [Харин С.Е. Термодинамика необратимых процессов. Киев, Изд. Киевского университета, 1961, 555 с.].

В качестве детекторов суммарной токсичности равновесных водных растворов используют неселективные биотесты. Под неселективными биотестами подразумевают любые виды живых организмов или частей организма, которые в зависимости от содержания любых водорастворимых токсичных соединений в равновесном водном растворе проявляют «реакцию» или дают «отклик» в виде изменения линейных размеров, численности, биомассы, теплопроводности, электропроводности, диэлектрической проницаемости, интенсивности выделения или поглощения энергии, например свечения и т.д. Во всех случаях эксперимент проводят одновременно в загрязненной и незагрязненной (контрольной) средах, а в расчетах используют отношение отклика биотеста в тестируемой среде к контрольной, которое обычно выражают в процентах.

Для определения токсичных свойств водорастворимых соединений в газовых средах для неселективных биотестов «i»-представителей особей каждого вида живых организмов определяют с помощью трех критериев выживаемости в тестируемой среде. Коэффициент биологической активности индивидуального соединения «k_i»-специфический параметр, характеризующий воздействие каждого индивидуального соединения на исследуемый неселективный биотест. Биологический эффект «B_e,i» - параметр, характеризующий относительный отклик или относительную выживаемость особей неселективного биотеста, процент или долю выживших особей живых организмов в тестируемой среде относительно контроля. Биологическую активность или токсичность компонентов тестируемой среды - специфический параметр для каждого вида неселективного биотеста, характеризующий воздействие любых индивидуальных соединений или их смесей с проявлением строго фиксированного биологического эффекта.

Для определения величины биологического эффекта (процента выживших особей в тестируемой среде относительно контроля) от воздействия на живые организмы токсичных компонентов в газовой фазе используют равновесные растворы, полученные при контакте компонентов газовой смеси в выбранном растворителе с использованием методик, описанных в Руководстве по контролю загрязнения атмосферного воздуха, РД 52.04.186-89, М.: Гидрометеоиздат, 1991, с.297-303) и Ждамиров Г.Г., Лапина Н.Ф., Тулупов П.Е., Сныков В.П. Устройство для приготовления равновесной парогазовой смеси. А.С. №1278700 (СССР), // Бюл. Изобр, 1986, №47.

Сущность изобретения сводится к следующему.

1. Способ определения биологической активности (токсичности) компонентов газовых сред и ее воздействия на особи живых организмов, включающий выбор неселективного биотеста из одной партии каждого вида «i» живых организмов из установленного перечня, адаптацию биотеста к условиям эксперимента, приготовление тестируемых сред, которыми являются термодинамически равновесные растворы, полученные известными методами при фиксированных условиях (температура, давление, соотношение фаз и др.) из исследуемой газовой среды с использованием выбранного растворителя, которым может быть дистиллированная вода, незагрязненная вода из привычной среды обитания живых организмов данного вида или водные растворы, широко используемые для введения особям живых организмов лекарственных препаратов, например физиологический раствор, а контрольной средой является тот же выбранный растворитель, помещение биотеста одновременно в тестируемые и контрольные объекты или введение известными методами в организм биотеста тех же тестируемых и контрольных растворов, выдерживание биотеста одновременно при тождественных условиях в тестируемых и контрольном объектах или с введенными в организм растворами в течение заданного времени, необходимого для достижения не менее пяти процентов различий токсичности (биологического эффекта) от воздействия наиболее разбавленного раствора для каждого применяемого биотеста, измерение наиболее чувствительного параметра (отклика) биотеста на воздействие компонентов в тестируемом и контрольном объекте, для каждой новой партии применяемого биотеста и с каждой серией измеряемых тестируемых проб проверяют соблюдение экспоненциальной зависимости биологического эффекта «B_e,i» от концентрации «С» водного раствора сульфата меди, для этого особи биотеста выдерживают не менее чем в пяти водных растворах сульфата меди и дистиллированной воды или с введенными в организм теми же растворами, определяют биологический эффект B_e,I - относительный отклик биотеста в растворах сульфата меди к контролю, строят графическую зависимость B_e,i(C) и при соблюдении экспоненциальной зависимости:

определяют другие критерии выживаемости особей живых организмов в растворах сульфата меди - коэффициент биологической активности сульфата меди «k_i» по отношению к выбранному неселективному биотесту по формуле:

и биологическую активность растворов сульфата меди «В_а,i» по воздействию на неселективный биотест, как произведение коэффициента биологической активности на концентрацию индивидуального соединения, например сульфата меди,

или из соотношения:

затем определяют экспериментально биологический эффект от воздействия компонентов в исследуемых равновесных растворах с газовой средой «B_e,i,s», затем рассчитывают биологическую активность компонентов в равновесных растворах с газовой средой «В_а,i,s» по формуле /4/, а затем рассчитывают биологическую активность компонентов в газовой среде «(B_a,i)_gas» по формуле /5/:

с использованием соотношений объемов растворителя (V_s) и газовой среды (V_g), взятых при получении равновесных растворов и рассчитывают биологический эффект воздействия на биотест токсичных соединений в газовой среде «(B_e,i)_gas» по формуле:

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для ускорения процесса получения термодинамически равновесного раствора используют циркуляцию исследуемого газа через смеситель, в котором газ поступает в раствор через инертный пористый фильтр.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что получение равновесных растворов и измерение отклика биотеста проводят при температуре 25°С и фиксируемом давлении, а затем результаты измерений пересчитывают известными методами к нормальным условиям.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что время экспозиции различных биотестов в тестируемом и контрольном растворах устанавливается одинаковым.

Существо изобретения иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Определение зависимости токсичности (биологического эффекта) бензола в атмосферном воздухе при воздействии на биолюминесцирующие микроорганизмы Эколюм-5

Сущность способа состоит в следующем. Сначала готовят серию равновесных водных растворов при 25°С с известными концентрациями бензола в атмосферном воздухе по известной методике // [Руководство по контролю загрязнения атмосферного воздуха, РД 52.04.186-89, М., Гидрометеоиздат, 1991, с.297-303]. Для этого получают равновесные водные растворы бензола при циркуляции в замкнутом режиме 2 л атмосферного воздуха через ловушку с 16 мл дистиллированной воды. Концентрацию компонентов в газовой среде находят экспериментальным путем или на основании уравнения Генри для равновесных растворов, а затем приводят к нормальным условиям. Контрольной пробой выбирают дистиллированную воду. В качестве биотеста используют биолюминесценцию бактерий Эколюм-5, интенсивность люминесценции которых зависит от концентрации токсикантов в тестируемом объекте.

Подготовка биотеста к работе включает вскрытие флакона с лиофилизированным биореагентом, добавление 10 мл охлажденной до 4-8°С дистиллированной воды с получением суспензии бактерий с рН 7,0-7,4, встряхивание смеси и выдерживание в термостате при 2-4°С в течение 30 мин, а затем повышение температуры до 25°С. Перед отбором пробы суспензию во флаконе перемешивают взбалтыванием. Измеряют фоновое значение прибора «Биотокс-10» при счете 10 сек без кюветы. Затем в кювету добавляют 0,1 мл суспензии бактерий из флакона и 0,9 мл дистиллированной воды при температуре 25°С, свечение рабочей суспензии бактерии должно находиться в интервале, превышающем фоновое значение в 25-250 раз. Если обнаруженная величина свечения бактерий меньше указанного интервала, то увеличивают добавку биотеста кратно 0,1 мл и повторяют измерение. Если величина свечения бактерий больше указанного интервала, то суспензию бактерий разбавляют дистиллированной водой и повторяют измерение.

Определение относительного отклика биотеста - биологического эффекта «B_e» (отношения интенсивности свечения бактерий в тестируемой (I) и в контрольной (I_о) пробах) проводят на основе среднего результата измерений в трех параллельных повторностях для каждой пробы.

Типичная зависимость относительного отклика биотеста от концентрации и биологической активности бензола в равновесном водном растворе рассчитывают с помощью формул /6/ и /7/, критерии выживаемости Эколюм-5 для газовой фазы приведены на Фиг.1. Зависимость относительного отклика бактерий Эколюм от токсичности бензола в одном м³ атмосферного воздуха приведена на Фиг.2.

Цитированные источники.

1. Оценка токсичности воздушной среды по интенсивности биолюминесценции бактерий. Методические рекомендации. Минздрав России, М. 2000 г., 19 с.

2. Беспамятнов Г.П., Кротов Ю.А. Предельно допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде. Л.: Химия, 1985, 528 с.].

3. Ждамиров Г.Г., Лапина Н.Ф., Тулупов П.Е., Сныков В.П. Устройство для приготовления равновесной парогазовой смеси. А.С. №1278700 (СССР) // Бюл. Изобр, 1986 №47.

4. Харин С.Е. Термодинамика необратимых процессов. Киев, Изд. Киевского университета, 1961, 555 с.

5. Патент RU (11) 2215291 (13) С1. Выдан 27.10.2003. Бюл. №30, Приоритет от 06.08.2002.

Изобретение относится к биотехнологии и экологии. Способ включает выбор и подготовку образцов биотестов, тестируемых и контрольных объектов, введение биотеста в тестируемые и контрольные объекты с последующей количественной оценкой воздействия отдельных соединений. Для реализации способа тестируемый и контрольный объекты газовых сред готовят в виде равновесных растворов в воде или другом подходящем растворителе, а биотест выбирают из одной партии исходных видов генетически выровненных особей живых организмов, адаптируют их к условиям эксперимента и выдерживают одновременно при тождественных условиях в исследуемом и контрольном объектах (равновесных растворах) в течение заданного времени. Затем измеряют наиболее чувствительный параметр (отклик) биотеста к воздействию загрязняющих веществ на выжившие особи биотеста в тестируемом объекте. По результатам измерения параметров биотеста из зависимости относительного отклика биотеста от концентрации растворенных компонентов в тестируемом объекте находят биологический эффект от воздействия компонентов в тестируемом объекте и биологическую активность компонентов равновесного раствора. Затем по биологической активности равновесных растворов и соотношению объема газовой среды и объема растворителя, взятых для получения равновесных растворов, определяют биологическую активность и биологический эффект газовой среды. Заявленное изобретение позволяет определять величины негативного воздействия на живые организмы отдельных соединений или их смесей, находящихся в газовой фазе. 3 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ определения биологической активности (токсичности) компонентов газовых сред и ее воздействия на особи живых организмов, включающий выбор неселективного биотеста из одной партии каждого вида «i» живых организмов, из установленного перечня, адаптацию биотеста к условиям эксперимента, приготовление тестируемых сред, которыми являются термодинамически равновесные растворы, полученные известными методами при фиксированных условиях (температура, давление, соотношение фаз и др.) из исследуемой газовой среды с использованием выбранного растворителя, которым может быть дистиллированная вода, незагрязненная вода из привычной среды обитания живых организмов данного вида или водные растворы, широко используемые для введения особям живых организмов лекарственных препаратов, например физиологический раствор, а контрольной средой является тот же выбранный растворитель, помещение биотеста одновременно в тестируемые и контрольные объекты или введение известными методами в организм биотеста тех же тестируемых и контрольных растворов, выдерживание биотеста одновременно при тождественных условиях в тестируемых и контрольном объектах или с введенными в организм растворами в течение заданного времени, необходимого для достижения не менее 5% различий токсичности (биологического эффекта) от воздействия наиболее разбавленного раствора для каждого применяемого биотеста, измерение наиболее чувствительного параметра (отклика) биотеста на воздействие компонентов в тестируемом и контрольном объектах, для каждой новой партии применяемого биотеста и с каждой серией измеряемых тестируемых проб проверяют соблюдение экспоненциальной зависимости биологического эффекта «B_e,i» от концентрации «С» водного раствора сульфата меди, для этого особи биотеста выдерживают не менее чем в пяти водных растворах сульфата меди и дистиллированной воды или с введенными в организм теми же растворами, определяют биологический эффект B_e,i - относительный отклик биотеста в растворах сульфата меди к контролю, строят графическую зависимость B_e,i(C) и при соблюдении экспоненциальной зависимости

В_e,i=100e_i ^-kC /1/

определяют другие критерии выживаемости особей живых организмов в растворах сульфата меди - коэффициент биологической активности сульфата меди «k,» по отношению к выбранному неселективному биотесту по формуле

k_i=(l/C)ln(100/B_e,i) /2/

и биологическую активность растворов сульфата меди «B_e,i,j» по воздействию на неселективный биотест как произведение коэффициента биологической активности на концентрацию индивидуального соединения, например сульфата меди, В_а,i=k_jC /3/

или из соотношения

B_a,i=ln(100/B_e,i), /4/

затем определяют экспериментально биологический эффект от воздействия компонентов в исследуемых равновесных растворах с газовой средой «B_e,i,s», затем рассчитывают биологическую активность компонентов в равновесных растворах с газовой средой «B_a,i,s» по формуле /4/, а затем рассчитывают биологическую активность компонентов в газовой среде «(B_a,i)_gas» по формуле /5/

(B_a,i)_gas=(V_s/V_g)ln(100/B_e,i,s) /5/

с использованием соотношений объемов растворителя (V_s) и газовой среды (V_g), взятых при получении равновесных растворов, и рассчитывают биологический эффект воздействия на биотест загрязняющих веществ в газовой среде «(B_e,i)_gas» по формуле