СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ ФЕРМЕНТАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНОВ УТИЛИЗАЦИИ КСИЛОЗЫ Российский патент 2006 года по МПК C12N1/21 C12P13/04 C12R1/19 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу получения L-аминокислот путем ферментации пентоз и более конкретно к способу получения L-аминокислот с использованием бактерии с усиленной экспрессией генов утилизации ксилозы путем ферментации смеси арабинозы и/или ксилозы с глюкозой в качестве источника углерода. Недорогой источник углерода, представляющий собой смесь гексоз и пентоз из гемицеллюлозной фракции целлюлозной биомассы, может быть использована для промышленного производства L-аминокислот, например L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты и L-триптофана.

Описание предшествующего уровня техники

Традиционно L-аминокислоты получают промышленным способом с помощью ферментации штаммов различных микроорганизмов. Используемая при этом ферментационная среда обычно содержит достаточное количество различных источников углерода и азота.

Общепринятыми источниками углерода являются различные углеводы, такие как гексозы, пентозы, триозы; различные органические кислоты и спирты. К гексозам относятся глюкоза, фруктоза, манноза, сорбоза, галактоза и подобные им. Пентозы включают в себя арабинозу, ксилозу, рибозу и подобные им. Тем не менее, вышеупомянутые углеводы и другие традиционные источники углерода, такие как меласса, зерно, сахарный тростник, крахмал, их гидролизаты, и т.д., используемые в современной промышленности, достаточно дороги. Таким образом, необходим альтернативный более дешевый вариант источника углерода для получения L-аминокислот.

Целлюлозная биомасса является перспективным субстратом для продукции L-аминокислот благодаря как своей готовности к применению, так и дешевизне по сравнению с чистыми углеводами, зерном, сахарным тростником или другими источниками углерода. Среднее содержание целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина в целлюлозной биомассе составляет примерно 40-60% целлюлозы, 20-40% гемицеллюлозы 10-25% лигнина и 10% других соединений. Целлюлозная фракция состоит из полимеров гексозных сахаров, обычно глюкозы. Гемицеллюлозная фракция состоит в основном из пентозных сахаров, включая ксилозу и арабинозу. Состав различных сырьевых биомасс приведен в Таблице 1 (http://www.ott.doe.gov/biofuels/understanding_biomass.html).

Таблица 1.ИсходныйШестиуглеродныеПятиуглеродныеЛигнинЗольныйматериалсахарасахара остатокТвердая39-50%18-28%15-28%0.3-1.0%древесина    Мягкая41-57%8-12%24-27%0.1-0.4%древесина    

Более детальную информацию о составе более 150 образцов биомассы можно получить в сводной таблице "Biomass Feedstock Composition and Property Database" (http://www.ott.doe.gov/biofuels/progs/searchl.cgi).

В ближайшем будущем ожидается разработка промышленного процесса для эффективной конверсии целлюлозной биомассы в готовый к применению компонент ферментационной среды - как правило, это смесь углеводородов. Следовательно, вскоре ожидается также увеличение масштаба использования возобновляемых источников энергии, таких как целлюлоза и гемицеллюлоза, для продукции полезных веществ (Aristidou A., Pentila. M., Curr. Opin. Biotechnol, 2000, Apr., 11:2, 187-198). Тем не менее, подавляющее большинство опубликованных статей и патентов или патентных заявок описывают утилизацию целлюлозной биомассы с помощью биокатализа (бактерии и дрожжи) для получения этанола, который в перспективе должен стать альтернативным топливом. Такие процессы включают в себя ферментацию целлюлозной биомассы с использованием различных модифицированных штаммов Zymomonas mobilis (Deanda К. et al., Appl. Environ. MicrobioL, 1996 Dec., 62:12, 4465-70; Mohagheghi A. et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 2002, 98-100:885-98; Lawford H.G., Rousseau J.D., Appl. Biochem. Biotechnol, 2002, 98-100:429-48; PCT applications WO 95/28476, WO 98/50524), модифицированных штаммов Escherichia coli (Dien B.S. et al., Appl. Biochem. Biotechnol, 2000, 84-86:181-96; Nichols N.N. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001 Jul, 56:1-2, 120-5; патент США 5000000). В качестве продукта ферментации ксилозы из гемицеллюлозных сахаров с помощью дрожжей Candida tropicalis может быть получен ксилитол (Walthers Т. et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 2001, 91-93:423-35). 1,2-Пропандиол может быть получен путем ферментации арабинозы, фруктозы, галактозы, глюкозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, ксилозы и их комбинаций с использованием рекомбинантного штамма Escherichia coli (патент США 6303352). Также было показано, что 3-дегидрошикимовая кислота может быть получена путем ферментации глюкозо/ксилозо/арабинозной смеси с использованием штамма Escherichia coli. Максимальные концентрации и конверсии 3-дегидрошикимовой кислоты были получены в опыте, когда в качестве источника углерода использовали глюкозо/ксилозо/арабинозную смесь, по сравнению с использованными в том же качестве чистых ксилозы или глюкозы (Kai Li and J.W.Frost, Biotechnol. Prog., 1999, 15, 876-883).

Также было показано, что Escherichia coli способна утилизировать пентозы, такие как L-арабиноза и D-ксилоза (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996). Транспорт L-арабинозы в клетку осуществляется двумя индуцируемыми системами: (1) пермеазой с низким сродством к субстрату (K_m около 0.1 мМ), кодируемой геном araE, и (2) системой с высоким сродством к арабинозе (К_m от 1 до 3 μM), кодируемой опероном araFG, Ген araF кодирует периплазматический связывающий белок (306 аминокислот) с функцией хемотактического рецептора, а локус araG кодирует белок, расположенный на внутренней стороне клеточной мембраны. Сахар утилизируется группой ферментов, кодируемых опероном araBAD: изомеразой (кодируемой геном araA), которая обратимо превращает альдозу в L-рибулозу; киназой (кодируемой геном araB), которая фосфорилирует кетозу, образуя L-рибулозо 5-фосфат; и L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразой (кодируемой геном araD), которая катализирует образование D-ксилозо-5-фосфата (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).

Большинство штаммов Е.coli растет на D-ксилозе, но штамм К-12 без мутации не способен расти на этом сахаре. Утилизация этой пентозы происходит через индуцируемый и регулируемый также катаболитной репрессией путь, включающий в себя транспорт через плазматическую мембрану двумя индуцируемыми пермеазами (неактивными при росте на D-рибозе или D-арабинозе), изомеризацию в D-ксилулозу, и АТФ-зависимое фосфорилирование этой пентулозы с образованием D-ксилулозо 5-фосфата. Транспортная система с высоким сродством к субстрарту (K_m 0.3 до 3 μM) зависит от связывающего белка, расположенного в периплазме (37000 Da) и, возможно, запускается высокоэнергетическим веществом. Транспортная система с низким сродством к субстрарту (К_m около 170 μМ) получает энергию за счет энергии переноса протона. Эта система симпорта D-ксилозы-протона кодируется геном xylE. Основным кластером генов, определяющим утилизацию D-ксилозы, является оперон xylAB(RT). Ген xylA кодирует изомеразу (54000 Da) и ген xylE кодирует киназу (52000 Da). Оперон имеет две точки начала транскрипции, одна из которых расположена перед открытой рамкой считывания xylB. Поскольку пермеаза с низким сродством к субстрату кодируется не входящим в оперон геном xylE, то локус xylT, также обозначаемый как xylF (xylFGHR), возможно, кодирует транспортную систему с высоким сродством к субстрату и, таким образом, должен состоять как минимум из двух генов (один, кодирующий периплазматический белок, и другой, кодирующий мембранный белок) (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996). Гены xylFGH кодируют АВС транспортеры ксилозы, при этом ген xylF кодирует гипотетический ксилозосвязывающий белок, ген xylG кодирует гипотетический АТФ-связывающий белок, ген xylH кодирует гипотетический мембранный компонент, и ген xylR кодирует ксилозный транскрипционный активатор.

Введение вышеупомянутых генов Е.coli, кодирующих L-арабинозоизомеразу, L-рибулокиназу, L-рибулозо 5-фосфат 4-эпимеразу, ксилозоизомеразу и ксилулокиназу в дополнение к трансальдолазе и транскетолазе в микроорганизм, такой как Zymomonas mobilis, позволяют этому микроорганизму перерабатывать арабинозу и ксилозу в этанол (WO/9528476, WO 98/50524). И, наоборот, гены Zymomonas, кодирующие алкогольдегидрогеназу (ADH) и пируватдекарбоксилазу (PDH), повышают продукцию этанола у штаммов Escherichia coli (Dien B.S. et al, Appl. Biochem. Biotechnol, 2000, 84-86:181-96; патент США 5000000).

Процесс получения L-аминокислот, таких как L-изолейцин, L-гистидин, L-треонин и L-триптофан, с помощью ферментации на смеси глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза, был уже раскрыт ранее авторами настоящего изобретения (патентная заявка России 2003105269).

Однако в настоящее время нет сообщений, описывающих бактерии с усиленной экспрессией генов утилизации ксилозы, таких как локус xylABFGHR, или описывающих использование этих генов для получения L-аминокислот из смеси сахаров - гексоз и пентоз.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является повышение продукции штамма-продуцента L-аминокислоты, предоставление бактерии - продуцента L-аминокислоты с усиленной экспрессией генов утилизации ксилозы и предоставление способа получения L-аминокислот из смеси сахаров - гексоз, таких как глюкоза, и пентоз, таких как ксилоза или арабиноза, с использованием вышеупомянутой бактерии. Продукт переработки целлюлозной биомассы может быть использован как компонент ферментационной среды в качестве источника углерода. Данная цель была достигнута путем обнаружения того факта, что локус xylABFGHR, клонированный на низкокопийном векторе, повышает продукцию L-аминокислот, например L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты и L-триптофана. Для этой цели использовался микроорганизм, способный расти на продукте переработки целлюлозной биомассы и являющийся продуцентом L-аминокислот. Продукт переработки целлюлозной биомассы состоит из ксилозы и арабинозы в смеси с глюкозой и служит источником углерода. Штаммы - продуценты L-аминокислоты представлены штаммом Escherichia coli. Таким образом, было совершено настоящее изобретение.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии - продуцента L-аминокислоты, при этом указанная бактерия принадлежит к семейству Enterobacteriaceae и обладает повышенной активностью любого из ферментов, участвующих в утилизации ксилозы.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой активности ферментов, утилизирующих ксилозу, повышены за счет усиления экспрессии локуса xylABFGHR.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой активности ферментов, утилизирующих ксилозу, повышены путем увеличения количества копий локуса xylABFGHR или модификации нуклеотидной последовательности, контролирующей экспрессию этих генов таким образом, что экспрессия указанных генов усиливается.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой количество копий указанных генов в клетке увеличено за счет трансформации бактерии низкокопийным вектором, содержащим локус xylABFGHR.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой локус xylABFGHR получен из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа продукции L-аминокислот, включающего в себя выращивание описанной выше бактерии в культуральной жидкости, содержащей смесь сахаров - глюкозы и пентоз, и выделение из культуральной жидкости накопленной в ней L-аминокислоты.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором пентозами являются арабиноза и ксилоза.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором указанная смесь сахаров является продуктом переработки целлюлозной биомассы.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором продуцируемой L-аминокислотой является L-гистидин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором у указанной бактерии экспрессия генов путей биосинтеза L-гистидина усилена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором продуцируемой L-аминокислотой является L-треонин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором у указанной бактерии экспрессия генов путей биосинтеза L-треонина усилена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором продуцируемой L-аминокислотой является L-лизин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором у указанной бактерии экспрессия генов путей биосинтеза L-лизина усилена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором продуцируемой L-аминокислотой является L-аргинин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором у указанной бактерии экспрессия генов путей биосинтеза L-аргинин усилена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором продуцируемой L-аминокислотой является L-глутаминовая кислота.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором у указанной бактерии экспрессия генов путей биосинтеза L-глутаминовой кислоты усилена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором продуцируемой L-аминокислотой является L-триптофан.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором у указанной бактерии экспрессия генов путей биосинтеза L-триптофана усилена.

Указанный способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-гистидина с помощью ферментации на смеси сахаров - глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Также указанный способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-треонина с помощью ферментации на смеси сахаров - глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Также указанный способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-лизина с помощью ферментации на смеси сахаров - глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Также указанный способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-аргинина с помощью ферментации на смеси сахаров - глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Также указанный способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-глутаминовой кислоты с помощью ферментации на смеси сахаров - глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Также указанный способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-триптофана с помощью ферментации на смеси сахаров - глюкозы и пентоз, таких как арабиноза и ксилоза. Указанная смесь сахаров - глюкозы и пентоз, используемая как компонент ферментационной среды, может быть получена из продуктов переработки растительной биомассы, таких как целлюлозная биомасса, предпочтительно гидролизат целлюлозы.

Краткое описание рисунков

На чертеже изображена структрура локуса xylABFGHR на хромосоме штамма Е.coli MG1655. Стрелки на диаграмме указывают позиции праймеров, использованных для ПЦР.

Наилучший способ осуществления изобретения.

Согласно настоящему изобретению "бактерия - продуцент L-аминокислоты" означает бактерию, обладающую способностью к накоплению этой L-аминокислоты в питательной среде в условиях, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Способность к продукции L-аминокислоты может быть придана или улучшена путем селекции. Используемый здесь термин «бактерия - продуцент L-аминокислоты» также означает бактерию, которая способна к продукции L-аминокислоты и вызывает накопление L-аминокислоты в питательной среде в количествах, больших, чем природный или родительский штамм, и, предпочтительно, означает, что микроорганизм способен производить и накапливать в ферментационной среде целевую L-аминокислоту в концентрациях не менее чем 0.5 г/л, более предпочтительно - не менее 1.0 г/л.

Термин «L-аминокислоты» включает в себя L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, Erwinia, Pantoea, Providencia и Serratia. Роды Escherichia и Pantoea предпочтителены.

Термин «обладает повышенной активностью ферментов утилизации ксилозы» означает то, что удельная активность становится выше, чем у немодифицированного штамма, например природного штамма. Например, в случае, когда количество молекул фермента в клетке увеличено, когда специфическая активность у молекулы фермента увеличена и так далее. Количество белка, кодируемого геном, может быть измерено известными методами, включающими SDS-электрофорез в полиакриламидном геле с последующим иммуноблоттингом (Western blotting analysis). Кроме того, в качестве природного штамма, который может служить объектом для сравнения, может быть упомянут штамм Escherichia coli К-12. В результате увеличения внутриклеточной активности ферментов утилизации ксилозы наблюдается эффект увеличения количества накопленного L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты и L-триптофана.

"Ферменты утилизации ксилозы" включают в себя белки транспорта ксилозы, ферменты, катализирующие изомеризацию и фосфорилирование ксилозы, а также регуляторные белки. Более конкретно эти ферменты включают в себя ксилозоизомеразу, ксилулокиназу, транспортеры ксилозы и ксилозный транскрипционный активатор. Ксилозоизомераза катализирует реакцию изомеризации D-ксилозы в D-ксилулозу. Ксилулокиназа катализирует реакцию фосфорилирования D-ксилулозы с использованием АТФ, в результате чего образуется D-ксилулозо-5-фосфат и АДФ. Доказательством наличия активности ферментов утилизации ксилозы в клетке, таких как ксилозоизомераза, ксилулокиназа, определяется комплементацией соответствующих мутантов Е.coli, дефективных по ксилозоизомеразе или ксилулокиназе соответственно.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia», означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).

Термин «увеличение экспрессируемого количества гена(ов)» означает, что экспрессируемое количество гена(ов) в клетке выше, чем количество этих генов в немодифицированном штамме, например природном. Примерами таких модификаций могут являться: увеличение количества экспрессируемых гена(ов) в пересчете на клетку, повышение уровня экспрессии этого(их) гена(ов) и так далее. Количество копий экспрессируемого гена измеряют, например, с помощью рестрикции хромосомной ДНК и последующей гибридизацией по Саузерну, при этом используется зонд, синтезированный на основе последовательности указанного гена, флюоресцентной гибридизацией in situ (FISH) и подобными им. Уровень экспрессии гена может быть измерен с помощью различных методов, включая гибридизацию по Нозерну, количественный ПЦР с обратной транскрипцией и подобные им. Кроме того, в качестве природного штамма, который может служить объектом для сравнения, может быть упомянут штамм Escherichia coli К-12. В результате увеличения внутриклеточной активности ферментов утилизации ксилозы наблюдается эффект увеличения количества накопленного L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты и L-триптофана.

Увеличение активности в клетке бактерии может быть достигнуто путем увеличения уровня экспрессии генов, кодирующих ферменты утилизации ксилозы. Гены утилизации ксилозы могут включать в себя любые гены, выделенные как из бактерий, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae, так и из других бактерий, таких как коринеформные бактерии. Гены, выделенные из бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, предпочтительны.

Ген, кодирующий ксилозоизомеразу из Е.coli (ЕС номер 5.3.1.5), известен и получил название xylA (номера нуклеотидов с 3727072 по 3728394 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi: 16131436). Ген, кодирующий ксилулокиназу (ЕС номер 2.7.1.17) известен и получил название xylB (номера нуклеотидов с 3725546 по 3727000 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi:16131435). Ген, кодирующий белок транспортной системы, связывающий ксилозу, известен и получил название xylF (номера нуклеотидов с 3728760 по 3729752 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi: 16131437). Ген, кодирующий гипотетический АТФ-связывающий белок транспортной системы ксилозы, известен и получил название xylG (номера нуклеотидов с 3729830 по 3731371 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi:16131438). Ген, кодирующий пермеазную составляющую транспортной системы ксилозы АВС-типа, известен и получил название xylH (номера нуклеотидов с 3731349 по 3732530 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi:16131439). Ген, кодирующий регулятор транскрипции xyl оперона известен и получил название xylR (номера нуклеотидов с 3732608 по 3733786 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; gi: 16131440). Таким образом, все вышеупомянутые гены могут быть получены с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; refer to White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)), используя праймеры, синтезированные на основе нуклеотидных последовательностей этих генов.

Гены, кодирующие ферменты утилизации ксилозы у других микроорганизмов, могут быть получены аналогичным способом.

Ген xylA из Escherichia coli представлен ДНК, кодирующей следующий белок (А) или (В):

(A) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO: 2); или

(B) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO: 2), который обладает активностью ксилозоизомеразы.

Ген xylB из Escherichia coli представлен ДНК, кодирующей следующий белок (С) или (D):

(C) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 4 (SEQ ID NO: 4); или

(D) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 4 (SEQ ID NO: 4), который обладает активностью ксилулокиназы.

Ген xylF из Escherichia coli представлен ДНК, кодирующей следующий белок (Е) или (F):

(Е) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 6 (SEQ ID N: 6); или

(F) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 6 (SEQ ID NO: 6), который обладает активностью, приводящей к повышению количества L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты или L-триптофана, накопленного в культуральной среде, в случае когда количество этого белка в бактерии - продуценте L-аминокислоты увеличено одновременно с увеличением количества белков, кодируемых генами xylAB и xylGHR.

Ген xylG из Escherichia coli представлен ДНК, кодирующей следующий белок (G) или (Н):

(G) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 8 (SEQ ID NO: 8); или

(Н) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 8 (SEQ ID NO: 8), который обладает активностью, приводящей к повышению количества L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты или L-триптофана, накопленного в культуральной среде, в случае когда количество этого белка в бактерии - продуценте L-аминокислоты увеличено одновременно с увеличением количества белков, кодируемых генами xylAB и xylFHR.

Ген xylH из Escherichia coli представлен ДНК, кодирующей следующий белок (I) или (J):

(I) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 10 (SEQ ID NO: 10); или

(J) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 10 (SEQ ID NO: 10), который обладает активностью, приводящей к повышению количества L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты или L-триптофана, накопленного в культуральной среде, в случае когда количество этого белка в бактерии - продуценте L-аминокислоты увеличено одновременно с увеличением количества белков, кодируемых генами xylAB и xylFGR.

Ген xylR из Escherichia coli представлен ДНК, кодирующей следующий белок (К) или (L):

(К) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 12 (SEQ ID NO: 12); или

(L) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 12 (SEQ ID NO: 12), который обладает активностью, приводящей к повышению количества L-гистидина, L-треонина, L-лизина, L-аргинина, L-глутаминовой кислоты или L-триптофана, накопленного в культуральной среде, в случае когда количество этого белка в бактерии - продуценте L-амминокислоты увеличено одновременно с увеличением количества белков, кодируемых генами xylAB и xylFGH.

ДНК, кодирующая ксилозоизомеразу, включает в себя ДНК, кодирующую белок, содержащий делеции, замены, вставки или добавления одной или нескольких аминокислот в одной или нескольких положениях в белке (А) при условии, что указанный белок не теряет своей активности. Несмотря на то что количество «нескольких» аминокислот может быть различным в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре указанного белка, это количество может варьировать от 2 до 50, предпочтительно от 2 до 20, и, более предпочтительно от 2 до 10 аминокислотных остатков для белка (А). Этот объясняется тем фактом, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг к другу и замена таких аминокислот не оказывает существенного влияния на трехмерную структуру белка и его активность. Таким образом, белок (В) может иметь гомологию, не меньшую, чем от 30 до 50%, предпочтительно от 50 до 70%, более предпочтительно от 70 до 90% и наиболее предпочтительно - более 90%, по отношению к общему количеству аминокислотных остатков, входящих в состав ксилозоизомеразы, и обладающий активностью ксилозоизомеразы. Те же критерии и степень гомологии могут быть применены к остальным белкам (С), (Е), (G), (I) и (К).

Для оценки степени гомологии между ДНК возможно использование нескольких способов расчета, таких как BLAST search, FASTA search и CrustalW.

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) - это самообучающийся алгоритм поиска, используемый программами BLASTP, BLASTN, BLASTX, MEGABLAST, TBLASTN, и TBLASTX; эти программы оценивают значимость найденных результатов с использованием статистических методов Karlin, Samuel и Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 5873-7). Способ поиска FASTA описан W.R.Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990 183: 63-98). Способ ClustalW описан Thompson J.D., Higgins D.G. и Gibson T.J. ("CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 1994, 22: 4673-4680).

ДНК, кодирующая практически такие же белки, как белок, описанный в пункте (А), может быть получена, например, путем модификации нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей белок, описанный в пункте (А), например, с помощью метода сайт-направленного мутагенеза, таким образом, что один или несколько аминокислотных остатков могут быть делегированы, заменены, вставлены или добавлены. ДНК, модифицированная, как описано выше, может быть получена традиционными известными методами обработками с целью получения мутаций. Такие методы включают обработку ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, гидроксиламином или обработку бактерии, содержащей указанную ДНК, с помощью УФ излучения или реагентом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота.

ДНК, кодирующая ксилозоизомеразу, включает также ДНК, которая может быть получена из различных штаммов бактерий, принадлежащих к роду Escherichia ввиду природного разнообразия. ДНК, кодирующая такие белки, может быть получена путем выделения ДНК, которая гибридизуется геном xylA или его частью в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий активностью ксилозоизомеразы. Термин «жесткие условия», упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические - не образуются. Например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру, ДНК, обладающие гомологией не менее 70% друг относительно друга. С другой стороны, примером жестких условий являются условия, при которых ДНК гибридизуются друг с другом, при концентрации солей, соответствующей стандартным условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от вида фильтра, используемого для блоттинга и, как правило, рекомендована изготовителем. Например, рекомендованная продолжительность отмывки нейлонового фильтра Hybond™ N+(Amersham) в жестких условиях составляет 15 минут. В качестве зонда для ДНК, кодирующей варианты и гибридизующейся с геном xylA, также может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером SEQ ID NO: 1. Зонд подобного рода может быть получен в результате ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером SEQ ID NO: 1, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером SEQ ID NO: 1, в качестве матрицы. В случае когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50°, 2×SSC и 0.1% SDS.

ДНК, кодирующие практически такие же белки, как другие белки утилизации ксилозы, могут быть получены с применением методик, аналогичных тем, которые применяли для получения ксилозоизомеразы, как описано выше.

Трансформация бактерии с помощью ДНК, кодирующей белок, означает введение указанной ДНК в клетку бактерии, например, традиционными методами для увеличения экспрессии указанного гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и увеличения активности указанного белка в клетке бактерии.

Бактерия согласно настоящему изобретению также включает в себя бактерию, в которой активность белка согласно настоящему изобретению повышена благодаря трансформации указанной бактерии ДНК, кодирующей такой же белок, как описанный в пунктах (А) или (В), (С) или (D), (Е) или (F), (G) или (Н), (I) или (J), и (К) или (L), или благодаря усилению последовательности, регулирующей экспрессию вышеупомянутой ДНК на хромосоме указанной бактерии.

К методам увеличения экспрессии генов относятся методы увеличения числа копий гена. Введение гена в вектор, способный к функционированию в бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, увеличивает число копий указанного гена. Для подобных целей могут быть предпочтительно использованы векторы разной копийности. Более предпочтительно использование низкокопийных векторов. Примерами низкокопийных векторов являются pSC101, pMW118, pMW119 и подобные им. Термин "низкокопийный вектор" используется для обозначения векторов, количество копий которых на клетку не превышает 5. Способы трансформации включают в себя все возможные способы, известные специалисту в данной области. Например, может быть использован способ обработки клеток-реципиентов хлоридом кальция для повышения проницаемости клеточных стенок для ДНК, опубликованный для Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol, 53, 159 (1970)).

Кроме того, усиление экспрессии гена может также быть достигнуто путем введения нескольких копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации, Mu интеграцией или подобными им. К примеру, один цикл Mu интеграции позволяет ввести в бактериальную хромосому до 3-х копий указанного гена.

С другой стороны, усиление экспрессии генов может быть достигнуто помещением ДНК согласно настоящему изобретению под контроль более сильного промотора взамен природного. Сила промотора определяется частотой акта инициации синтеза РНК. Методы оценки силы промотера и примеры сильных промоторов описаны у Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987-2994). Например, P_R промотор известен как сильный конститутивный промотор. В качестве сильных промоторов известны P_L промотор, lac промотор, trp промотор, trc промотор, фага лямбда и подобные им.

Усиление трансляции может быть достигнуто путем введения в ДНК согласно настоящему изобретению более эффективной последовательности Shine-Dalgamo (SD последовательности) вместо природной SD последовательности. SD последовательностью является область, находящаяся на цепи ДНК перед старт-кодоном мРНК и взаимодействующая с 16SPHK рибосомы (Shine J. and Dalgamo L, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71,4, 1342-6).

Использование сильного промотора может быть совмещено с увеличением числа копий гена.

Кроме того, промотор может быть усилен, например, введением мутации в последовательность промотора для повышения уровня транскрипции гена, расположенного за промотором. Уже известно, что замена нескольких нуклеотидов в спейсерном участке между сайтом связывания рибосомы (RBS) и старт кодоном и, в частности, в последовательностях, расположенных непосредственно перед старт кодоном, серьезно влияет на уровень трансляции мРНК. Например, была обнаружена 20-кратная разница в уровне экспрессии гена в зависимости от состава последовательности из трех нуклеотидов, находящихся перед старт кодоном (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403,1981; Hui et al; EMBO J., 3, 623-629, 1984).

Методами получения хромосомной ДНК, гибридизации, ПЦР, получения плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные им могут являться обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) и подобным ей.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-аминокислоты. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции L-аминокислоты.

Примеры бактерий - продуцентов L-аминокислоты, принадлежащих к роду Escherichia, приведены ниже.

Бактерия - продуцент L-гистидина

Примерами бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, обладающих способностью к продукции L-гистидина, включают в себя штаммы бактерии - продуцента L-гистидина, принадлежащих к роду Escherichia, такие как штамм Е.coli 24 (ВКПМ В-5945, Российский патент 2003677); штамм Е.coli 80 (ВКПМ В-7270, Российский патент 2119536); штаммы Е.coli NRRL В-12116 - В12121 (патент США 4388405); штаммы Е.coli H-9342 (FERM ВР-6675) и Н-9343 (FERM ВР-6676) (патент США 6344347); штамм Е.coli H-9341 (FERM BP-6674) (Европейская патентная заявка 1085087А2); штамм Е.coli AI80/pFM201 (патент США 6258554) и подобные им.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была в дальнейшем модифицирована для усиления экспрессии одного или более генов гистидинового оперона, который предпочтительно включает в себя ген hisG, кодирующий АТФ фосфорибозилтрансферазу, не чуствительную к ингибированию гистидином по принципу обратной связи (патенты России 2003677 и 2119536), для бактерии - продуцента L-гистидина.

Бактерия - продуцент L-треонина

Примеры родительского штамма для получения бактерии - продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е.coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е.coli FERM BP-3756 (патент США 5474918), штаммы Е.coli FERM ВР-3519 и FERM BP-3520 (патент США 5376538), штамм Е.coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР1149911А) и подобными им.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать глюкозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA^*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 113105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-3996.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована таким образом, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих генов:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;

- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок;

- гена asd, кодирующего аспартат-β-семиальдегиддегидрогеназу;

- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартат трансаминазу);

Последовательность гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrA расположен на хромосоме штамма Е.coli К-12 между генами thrL и thrB. Последовательность гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrB расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrA и thrC. Последовательность гена thrC, кодирующего треонинсинтазу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrC расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между геном thrB и открытой рамкой считывания уааХ. Все три указанных гена функционируют как один треониновый оперон.

Мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, так же, как и гены thrB и thrC, могут быть получены в виде единого опреона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая представлена в штамме-продуценте Е.coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5705371.

Ген rhtA находится на 18 минуте хромосомы Е.coli недалеко от оперона glnHPQ, кодирующего компоненты системы транспорта глутамина, при этом ген rhtA идентичен ORF1 (ген ybiF, нуклеотиды с 764 по 1651 в последовательности с номером ААА218541, gi:440181 в базе данных GenBank), расположенной между генами pexB и ompX. Элемент, экспрессирующий белок, кодируемый ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine - устойчивость к гомосерину и треонину). Также было установлено, что мутацией rhtA23 является замена G на А в положении 1 по отношению к ATG старт-кодону (ABSTRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A).

Последовательность гена asd из E.coli известна (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с номером NC_000913.1, gi: 16131307 в базе данных GenBank), и может быть получена методом ПЦР (полимеразной цепной реакции; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности указанного гена. Гены asd из других микроорганизмов могут быть получены подобным способом.

Также последовательность гена aspC из Е.coli известна (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с с номером NC_000913,1, gi: 16128895 в базе данных GenBank) и может быть получена методом ПЦР. Гены aspC из других микроорганизмов могут быть получены подобным способом.

Бактерия - продуцент L-лизина

Примеры бактерий - продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Escherichia, включают мутантов, обладающих устойчивостью к аналогу L-лизина. Аналог L-лизина ингибирует рост бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но это ингибирование полностью или частично снимается, когда в среде также присутствует L-лизин. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваются оксализином, лизингидроксаматом, S-(2-аминоэтил)-L-цистеином (АЕС), γ-метиллизном, α-хлорокапролактамом и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к указанным аналогам лизина, могут быть получены путем обработки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, традиционными мутагенами. Конкретные примеры бактериальных штаммов, используемых для получения L-лизина, включают штамм Escherichia coli AJ 11442 (PERM BP-1543, NRRL В-12185; смотри патент США 4346170) и штамм Escherichia coli VL611. В этих микроорганизмах аспартокиназа устойчива к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.

Штамм WC196 может быть использован в качестве бактерии - продуцента L-лизина Escherichia coli. Данный бактериальный штамм был получен путем селекции фенотипа устойчивости к АЕС у штамма W3110, производного от штамма Escherichia coli К-12. Полученный штамм был назван Escherichia coli AJ 13069 и был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 6 декабря, 1994 г. и получил инвентарный номер PERM P-14690. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 29 сентября 1995 г., и штамм получил инвентарный номер FERM ВР-5252 (смотри патент США 5827698).

Бактерия - продуцент L-аргинина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии - продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 237 (ВКПМ В-7925) и его штаммами-производными, содержащими мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм-продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (выложенная патентная заявка Японии №57-5693) и подобные им.

Бактерия - продуцент L-глутаминовой кислоты

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии - продуцента L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli VL334 thrC⁺ (Европейский патент ЕР 1172433). Штамм Е.coli VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофом по L-изолейцину и L-треонину с мутациями в генах thrC и ilvA (патент США 4278765). В этот штамм была перенесена природная аллель гена thrC методом общей трансдукции с использованием бактериофага Р1, выращенного на клетках природного штамма Е.coli K12 (ВКПМ В-7). В результате был получен штамм, ауксотроф по L-изолейцину, VL334thrC⁺. Этот штамм обладает способностью к продукции L-глутаминовой кислоты.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии - продуцента L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя мутантные штаммы, лишенные активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или обладающие сниженной активностью α-кетоглутаратдегидрогеназы. Бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, лишенные активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или обладающие сниженной активностью α-кетоглутаратдегидрогеназы, и способы их получения описаны в патентах США 5378616 и 5573945. Конкретно примеры таких штаммов включают в себя следующие штаммы:

E.coli W3110sucA::Kmr

Е.coli AJ12624 (FERM ВР-3853)

Е.coli AJ12628 (FERM BP-3854)

Е.coli AJ2949 (FERMBP-4881)

Е.coli W3110sucA::Kmr - это штамм, полученный в результате разрушения гена α-кетоглутаратдегидрогеназы (далее называемого "sucA ген") в штамме Е.coli W3110. У этого штамма активность α-кетоглутаратдегидрогеназы отсутствует полностью.

Другие примеры бактерии - продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя бактерии, принадлежащие к роду Pantoea, которые лишены активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или имеющют сниженную активность α-кетоглутаратдегидрогеназы, и могут быть получены описанным выше способом. Примерами таких штаммов являются штамм Pantoea ananatis A J 13356 (патент США 6331419), штамм Pantoea ananatis AJ13356, депонированный в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute ofBioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6,1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 19 февраля, 1998 и получивший инвентарный номер FERM P-16645. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 11 января 1999 г., и штамм получил инвентарный номер FERM BP-6615. Штамм Pantoea ananatis AJ13356 не имеет α-KGDH активности в результате разрушения гена αKGDH-E1 субъединицы (sucA). Вышеупомянутый штамм при выделении был идентифицирован как Enterobacter agglomerans и депонирован как штамм Enterobacter agglomerans AJ13355. Тем не менее, позднее он был классифицирован как Pantoea ananatis на основе нуклеотидной последовательности 16S рРНК и других доказательств (смотри раздел Примеры). Несмотря на то что оба штамма - AJ13355 и полученный из него штамм AJ13356 были депонированы в указанный выше депозитарий как Enterobacter agglomerans, для целей данного описания они будут упоминаться как Pantoea ananatis.

Бактерия - продуцент L-триптофана

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии - продуцента L-триптофана согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами - продуцентами L-триптофана, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), дефицитные по триптофанил-тРНК синтетазе, кодируемой мутантным геном trpS (патент США 5756345); штамм Е.coli SV164 (pGH5), содержащий аллель serA, не ингибирующийся серином по принципу обратной связи (патент США 6180373); штаммы Е.coli AGX17 (pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264), дефицитные по ферменту триптофаназе (патент США 4371614); штамм Е.coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps, в котором способность к продукции фосфоенолпирувата усилена (WO 9708333, патент США 6319696) и подобные им.

Ранее было показано, что ген yddG, кодирующий мембранный белок, не вовлеченный ни в один путь биосинтеза L-аминокислот, сообщает микроорганизму устойчивость к L-фенилаланину и нескольким аналогам аминокислот при амплификации природного аллеля данного гена на многокопийном векторе в указанном микроорганизме. Кроме того, ген yddG может положительно влиять на продукцию L-фенилаланина или L-триптофана, когда дополнительные копии этого гена введены в клетки соответствующего штамма-продуцента (WO 03044192). Таким образом, желательно, чтобы бактерия - продуцент L-триптофана была далее модифицирована таким образом, что экспрессия открытой рамки считывания yddG в указанной бактерии была усилена.

Бактерия - продуцент L-фенилаланина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии - продуцента L-фенилаланина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (ВКМП В-8197); штамм HW1089 (АТСС-55371), содержащий ген pheА34 (патент США 5354672); мутантный штамм MWEC101-b (KR8903681); штаммы NRRL B-12141, NRRL В-12145, NRRL В-12146 и NRRL В-12147 (патент США 4407952) и пободные им. Также в качестве родительских штаммов могут быть использованы бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, - продуценты L-фенилаланина, такие как штамм E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAB] (FERM ВР-3566), штамм E.coli К-12[W3110(tyrA)/pPHAD] (FERM ВР-12659), штамм E.coli К-12[W3110(tyrA)/pPHATerm] (FERM ВР-12662) и штамм E.coli К-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4, рАСМАВ], названный как AJ12604 (FERM BP-3579) (Европейский патент ЕР 488424В1). Кроме того, также могут быть использованы бактерии - продуценты L-фенилаланина, принадлежащие к роду Escherichia с повышенной активностью белков, кодируемых геном yedA или геном yddG (патентные заявки США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 А1).

Бактерия - продуцент L-цистеина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии - продуцента L-цистеина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli JM15, трансформированный различными аллелями гена cysE, кодирующих устойчивые к ингибированию по типу обратной связи серинацетилтрансферазы (патент США 6218168, патентная заявка РФ 2003121601); штамм Е.coli W3110, содержащий сверхэкспрессированные гены, кодирующие белок, способный к секреции соединений, токсичных для клетки (патент США 5972663); штаммы Е.coli, содержащие цистеиндесульфогидразу со сниженной активностью (патент Японии JP 11155571 А2); штамм Е.coli W3110 с повышенной активностью позитивного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (заявка РСТ WO 0127307 A1), и подобные им.

Бактерия - продуцент L-лейцина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии - продуцента L-лейцина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli, устойчивые к аналогам лейцина, включающих, например, β-2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин и 5,5,5-трифлуоролейцин (выложенные патентные заявки Японии 62-34397 и 8-70879), штаммы Е.coli, полученные с помощью генно-инженерных методов, описанных в заявке РСТ 96/06926; Е.coli штамм Н-9068 (JP8-70879A2), и подобные им.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-лейцина. Примеры таких генов включают в себя гены оперона leuABCD и предпочтительно представлены мутантным геном leuA, кодирующим изопропилмалатсинтазу со снятым ингибированием L-лейцином по типу обратной связи (патент США 6403342). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, которые экспортируют L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают в себя гены b2682 и b2683 (refiviygaZH) (патентная заявка РФ 2001117632, Европейская патентная заявка ЕР 1239041 А2).

Бактерия - продуцент L-пролина

Примеры бактерий-продуцентов L-пролина, используемых в качестве родительского штамма согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 702ilvA (ВКПМ В-8012), дефицитного по гену ilvA и способного к продукции L-пролина (Европейский патент ЕР 1172433). Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-пролина. Предпочтительно примеры таких генов для бактерий - продуцентов L-пролина включают ген proB, кодирующий глутаматкиназу с десенсибилизированной регуляцией L-пролином по типу обратной связи (патент Германии 3127361). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, экскретирующие L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примерами таких генов являются гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (патентная заявка РФ 2001117632, Европейская патентная заявка ЕР 1239041 А2).

Примеры бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и обладающих способностью к продукции L-пролина, включают следующие штаммы Е.coli: NRRL В-12403 и NRRL В-12404 (патент Великобритании GB 2075056), ВКПМ В-8012 (патентная заявка РФ 2000124295), плазмидные мутанты описаны в патенте Германии DE 3127361, плазмидные мутанты описаны у Bloom F.R. et al (The 15^th Miami winter symposium, 1983, p.34) и подобные им.

Вышеупомянутые штаммы - продуценты L-аминокислоты могут в дальнейшем быть модифицированными таким образом, что скорость ассимиляции пентоз повышена или усилена способность к биосинтезу L-аминокислоты с использованием широкого спектра методов, хорошо известных специалисту в данной области.

Скорость утилизации пентозных сахаров может быть в дальнейшем повышена за счет амплификации генов ассимиляции пентоз, гены araFG и araBAD для ассимиляции арабинозы, или путем введения мутаций в систему ассимиляции глюкозы (PTS или non-PTS), таких как мутация ptsG (Nichols N.N. et al., Appl. Microbiol. BiotechnoL, 2001, Jul. 56: 1-2, 120-5).

К способу согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии - продуцента L-аминокислоты в питательной среде с целью продукции с целью накопления указанной L-аминокислоты в питательной среде, и сбора L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Процесс согласно настоящему изобретению включает в себя процесс получения L-аминокислоты, включающего в свою очередь в себя стадии культивирования бактерии - продуцента L-аминокислоты в ферментационной среде, что позволяет накапливать указанную L-аминокислоту в культуральной жидкости, и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости, при этом ферментационная среда содержит смесь глюкозы и пентоз. Также способ согласно настоящему изобретению включает в себя процесс получения L-гистидина, включающего в свою очередь в себя стадии культивирования бактерии - продуцента L-гистидина в ферментационной среде, что позволяет накапливать L-гистидин в культуральной жидкости, и выделения L-гистидина из культуральной жидкости, при этом ферментационная среда содержит смесь глюкозы и пентоз. Также способ согласно настоящему изобретению включает в себя процесс получения L-треонина, включающего в свою очередь в себя стадии культивирования бактерии - продуцента L-треонина в ферментационной среде, что позволяет накапливать L-треонин в культуральной жидкости, и выделения L-треонина из культуральной жидкости, при этом ферментационная среда содержит смесь глюкозы и пентоз. Также способ согласно настоящему изобретению включает в себя процесс получения L-лизина, включающего в свою очередь в себя стадии культивирования бактерии - продуцента L-лизина в ферментационной среде, что позволяет накапливать L-лизин в культуральной жидкости, и выделения L-лизина из культуральной жидкости, при этом ферментационная среда содержит смесь глюкозы и пентоз. Также способ согласно настоящему изобретению включает в себя процесс получения L-аргинина, включающего в свою очередь в себя стадии культивирования бактерии - продуцента L-аргинина в ферментационной среде, что позволяет накапливать L-аргинин в культуральной жидкости, и выделения L-аргинина из культуральной жидкости, при этом ферментационная среда содержит смесь глюкозы и пентоз. Также способ согласно настоящему изобретению включает в себя процесс получения L-глутаминовой кислоты, включающего в свою очередь в себя стадии культивирования бактерии - продуцента L-глутаминовой кислоты в ферментационной среде, что позволяет накапливать L-глутаминовую кислоты в культуральной жидкости, и выделения L-глутаминовой кислоты из культуральной жидкости, при этом ферментационная среда содержит смесь глюкозы и пентоз. Также способ согласно настоящему изобретению включает в себя процесс получения L-триптофана, включающего в свою очередь в себя стадии культивирования бактерии - продуцента L-триптофана в ферментационной среде, что позволяет накапливать L-триптофан в культуральной жидкости, и выделения L-триптофана из культуральной жидкости, при этом ферментационная среда содержит смесь глюкозы и пентоз.

Смесь пентоз, таких как ксилоза и арабиноза, и гексоз, таких как глюкоза, может быть получена из недопереработанных источников биомассы. Глюкоза, ксилоза, арабиноза и другие углеводы могут быть выделены из растительной биомассы благодаря обработке паром и/или гидролизу концентрированной кислотой, гидролизу разведенной кислотой, ферментативному гидролизу, с использованием таких ферментов, как целлюлаза, или щелочной обработке. Когда субстратом для ферментации является целлюлозный материал, целлюлоза может быть гидролизована до сахаров в процессе ферментации или отдельно, после чего может быть утилизована в L-аминокислоту. Поскольку гемицеллюлоза легче, чем целлюлоза гидролизуется до сахаров, то предпочтительна предварительная гидролизация целлюлозного субстрата, отделение пентоз и последующий гидролиз целлюлозы паром, кислотой, щелочью, ферментами или сочетанием этих разрушителей для получения глюкозы.

В настоящем изобретении использовали смесь, содержащую в различных пропорциях глюкозу/ксилозу/арабинозу для того, чтобы оценить состав глюкозо-пентозной смеси для ферментации, которую потенциально можно получить из растительных гидролизатов (смотри раздел Примеры).

В настоящем изобретении выращивание, сбор и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием микроорганизма. Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, которые требуются микроорганизму для роста.

К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза, сахароза, арабиноза, ксилоза и другие пентозы и гексозы, которые бактерия - продуцент L-аминокислоты может использовать как источник углерода. Глюкоза, ксилоза, арабиноза и другие углеводы могут являться компонентом смеси сахаров, полученных в результате гидролиза целлюлозной биомассы.

Пентозы, котрые можно использовать как компонент ферментационной среды согласно настоящему изобретению, включают ксилозу и арабинозу, но не ограничиваются ими.

В качестве источника азота могут использоваться различные соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов и ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок используются монофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные соединения. Некоторые питательные добавки могут быть при необходимости добавлены в питательную среду. Например, если микроорганизму для роста необходим пролин (ауксотрофия по пролину), соответствующее количество тирозина может быть добавлено в питательную среду для выращивания.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание, ферментация с аэрацией, при температуре от 20 до 40°С, предпочтительно от 30 до 38°C. рН питательной среды находится в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем целевая L-аминокислота может быть собрана и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.

Примеры

Более детально настоящее изобретение будет разъяснено ниже со ссылкой на следующие примеры, не ограничивающие область применения настоящего изобретения.

Пример 1. Клонирование локуса xylABFGHR из хромосомы штамма Е.coli MG1655.

На основании анализа генома штамма Е.coli MG1655 гены xylABFGHR могли быть клонированы единым HindIII фрагментом (13.1 т.п.о.) из общего количества 556 HindIII хромосомных фрагментов (чертеж). Для этой цели была создана библиотека генов, клонированных в вектор pUC 19, этот вектор сохраняет стабильность в Е.coli с полученными размерами вставок.

Для конструирования такой лаборатории генов хромосомная ДНК штамма MG1655 была обработана рестриктазой HindIII, а вектор pUC19 был обработан рестриктазой XbaI. Для предотвращения лигирования среди фрагментов ДНК одного типа липкие концы всех полученных фрагментов ДНК были достроены с помощью фрагмента Кленова (достройка двух нуклеотидов). После лигирования был получен набор рекомбинантных pUC19 плазмид. Размер библиотеки составлял более чем 200 тысяч клонов. Библиотека была проанализирована при помощи ПЦР с использованием праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности вектора, и праймеров, комплементарных клонированному фрагменту хромомсомы. После ПЦР-анализа среди проверенных фрагментов ДНК не было обнаружено продуктов ПЦР искомого молекулярного веса, и это означало, что фрагмент, соответствующий оперону xylABFGHR, отсутствовал в полученной библиотеке. Такой результат мог быть получен из-за негативного влияния гена malS, а также из-за открытых рамок считывания yiaA и yiaB ORFs (с неизвестными функциями), которые также располагались в целевом HindIII фрагменте. Другой возможной причиной негативного отбора данного фрагмента мог служить большой размер Xyl-локуса. Для того чтобы снять эту проблему, были сконструированы новые библиотеки генов на модифицированной плазмиде pUC19. Основная идея состояла в том, чтобы клонировать Xyl-локус как набор фрагментов без лишнего гена malS и рамок считывания yiaA и yiaB.

Для этой цели был модифицирован полилинкер вектора pUC19, а именно в полилинкер вставили синтетический фрагмент ДНК, содержащий сайт рестрикции MluI. На основе модифицированного вектора pUC19 было создано две библиотеки генов. Первую библиотеку сконструировали, расщепив хромосомную ДНК штамма MG1655 и модифицированный вектор pUC19 рестриктазами HindIII и MluI с последующим лигированием. Объем библиотеки составил более чем 4000 клонов. Библиотеку генов проанализировали при помощи ПЦР с использованием праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности плазмиды, и праймеров 1 (SEQ ID NO: 13) и 2 (SEQ ID NO: 14), которые комплементарны нуклеотидной последовательности фрагмента xylABFG локуса xyl. Среди полученных ПЦР-продуктов были обнаружены фрагменты ДНК с нужным молекулярным весом. Следующей задачей было обогащение библиотеки генов нужным фрагментом. Для ее решения ДНК из исходной библиотеки генов была обработана энодонуклеазами, сайты рестрикции не встречаются в целевом фрагменте. Это следующие рестриктазы - Есо1471, KpnI, MlsI, Bst11071. Частота встречаемости нужной плазмиды в обогащенной библиотеки равнялась 1/800 клонов. Обогащенная библиотека была проанализирована с помощью ПЦР, как описано выше. После пяти последовательных обогащений библиотеки генов в клеточной популяции было отобрано только десять клонов, содержащих гены xylABFG. Полученная плазмида, содержащая фрагмент ДНК HindIII - MluI с генами xylABFG, была названа pUC19/xylA-G. Затем фрагмент HindIII-MphI 103I, содержащий открытые рамки считывания yiaA viyiaB, был удален из плазмиды pUC19/xylA-G; липкие концы затупили с помощью фрагмента Кленова и вставили лигированием синтетический линкер, содержащий сайт рестрикции EcoRI. Таким образом была получена плазмида pUC19/xylA-G-2. Далее, полученная плазмида pUC19/xylA-G-2 была обработана рестриктазой EheI; липкие концы затупили с помощью фрагмента Кленова и вставили лигированием синтетический линкер, содержащий сайт рестрикции HindIII. Так была получена плазмида pUC19/xylA-G-3. Сайт рестрикции HindIII был введен в имеющийся фрагмент ДНК, содержащий гены xylHR, восстановив таким образом локус xyl.

Вторую библиотеку сконструировали, расщепив хромосомную ДНК штамма MG1655 и модифицированный вектор pUC19 рестриктазами PstI и MluI с последующим лигированием. Объем библиотеки составил более чем 6000 клонов. Библиотеку генов проанализировали при помощи ПЦР с использованием праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности плазмиды, и праймеров 3 (SEQ ID NO: 15) и 4 (SEQ ID NO: 16), которые комплементарны нуклеотидной последовательности клонируемого хромосомного фрагмента. Среди полученных ПЦР-продуктов были обнаружены фрагменты ДНК с нужным молекулярным весом. Следующим шагом было последовательное разделение клеточной популяции с библиотекой генов с помощью ПЦР-анализа. В результате семи последовательных разделений клеточной популяции с клонированным фрагментом, содержащим гены xylHR, были отобраны только 10 клонов. Среди этой популяции целевой фрагмент ДНК был найден с помощью рестрикционного анализа. Полученная плазмида, содержащая фрагмент ДНК PstI-MluI с генами xylHR, была названа pUC19/xylHR. Затем фрагмент ДНК HindIII-MluI из плазмиды pUC19/xylHR был введен лигированием в плазмиду pUC19/xylA-G-3, предварительно обработааную рестриктазами HindIII и MluI. В итоге был получен полный xyl локус штамма MG1655. Полученная в результате многокопийная плазмида, содержащая полный локус xylABFGHR, была названа pUC19/xylA-R.

Затем фрагмент ДНК HindIII-EcoRI из плазмиды pUC19/xylA-R был переклонирован на низкокопийный вектор pMW119mod, предварительно обработанный рестриктазами HindIII и EcoRI, в результате была получена плазмида pMW119mod-xylA-R, содержащая полный локус xylABFGHR. Низкокопийный вектор pMW119mod был сконструирован на основе коммерчески доступного вектора pMW119 путем удаления фрагмента PvuII-PvuII. Этот фрагмент содержит полилинкер и является большей частью гена lacZ. Ген lacZ содержит сайты связывания репрессора lacl, после которых на плазмиде расположена вставка синтетического линкера, содержащего сайты EcoRI и HindIII, необходимых для дотирования локуса xylABFGHR из плазмиды pUC19/xylA-R.

Пример 2: Продукция L-гистидина бактерией - продуцентом L-гистидина в результате ферментации на смеси глюкозы и пентоз.

Штамм-продуцент L-гистидина Е.coli 80 был использован для оценки продукции L-гистидина в результате ферментации на смеси глюкозы и пентоз. Штамм Е.coli 80 (ВКПМ В-7270) детально описан в патенте России RU2119536. Трансформация штамма 80 плазмидой pMW119mod-xylA-R была произведена традиционным методом с получением штамма 80/pMW119mod-xylA-R. Для получения посевной культуры оба штамма 80 и 80/pMW119mod-xylA-R выращивались на роторной качалке (250 об/мин) при 27°C в течение 6 часов в лабораторных пробирках 40 мл (⊘ 18 мм), содержащих 2 мл L-бульона со стрептомицином 1 г/л. Для штамма 80/pMW119mod-xylA-R в среду дополнительно добавляли ампициллин 100 мг/л. Затем 2 мл (5%) посевного материала вносили в ферментационную среду. Ферментация производилась на роторной качалке (250 об/мин) при 27°C в течение 65 часов в лабораторных пробирках 40 мл, содержащих 2 мл ферментационной среды.

После выращивания, количество L-гистидина, накопленного в среде, определяли методом бумажной хроматографии. Бумага экспонировалась с подвижной фазой следующего состава: н-бутанол: уксусная кислота: вода = 4:1:1 (v/v). В качестве реагента для визуализации использовался 0,5% раствор нингидрина в ацетоне. Результаты представлены в Таблице 2.

Состав среды для ферментации, (г/л):

Углеводы (сумма) 100.0Мамено0.2 суммарного азотаL-пролин0.8(NH₄)₂SO₄25.0КН₂PO₄2.0MgSO₄×7H₂O1.0FeSO₄×7H₂O0.01MnSO₄×5H₂O0.01Тиамин HCl0.001Бетаин2.0СаСО₃6.0Стрептомицин1.0

Углеводы (глюкозу, арабинозу, ксилозу), L-пролин, бетаин и сульфат марганца стерилизовали отдельно. СаСО₃ стерилизовали сухим жаром при 110°C в течение 30 мин. рН доводили до 6.0 с помощью КОН перед стерилизацией.

Таблица 2ШтаммГлюкозаКсилозаГлюкоза/ксилоза 1:1АрабинозаГлюкоза/арабиноза 1:1OD₄₅₀His, г/лOD₄₅₀His, г/лOD₄₅₀His, г/лOD₄₅₀His, г/лOD₄₅₀His, г/л80438.9Нет0.4393.23710.3408.7   роста       80/pMW119mod-399.3509.6399.93610.5409.1.xylA-R          

Как видно из Таблицы 2, усиление экспрессии локуса xylABFGHR, увеличивает продукцию гистидина штаммом Е.coli 80, выращиваемом на среде, содержащей ксилозу.

Пример 3. Продукция L-треонина путем ферментации смеси глюкозы и пентозы с использованием бактерии - продуцента L-треонина.

Для оценки продукции L-треонина путем ферментации смеси глюкозы и пентоз использовали штамм Е.coli В-3996. Трансформацию штамма В-3996 плазмидой pMW119mod-xylA-R или вектором pMW119 осуществляли традиционным методом с использованием CaCl₂ с получением штаммов 3996/pMW119mod-xylA-R и 3996/pMW119 соответственно.

Каждый из штаммов Е.coli B-3996/pMW119 и B-3996/pMW119mod-xylA-R выращивали в течение 12-15 часов при 37°C на чашках с L-агаром, содержащим стрептомицин (50 мг/л) и ампициллин (150 мг/л). Затем одну петлю каждого из штаммов переносили в ферментационную среду, содержащую в качестве источника углерода ксилозу (4%). Выращивание проводили в 2 мл ферментационной среды, содержащей стрептомицин (50 мг/л) в 20×200 мм пробирках. Клетки выращивали в течение 25 часов при 32°C на роторной качалке при 250 об/мин.

После выращивания количество L-треонина, накопленного в среде, определяли методом бумажной хроматографии с использованием с подвижной фазой следующего состава: н-бутанол : уксусная кислота : вода = 4:1:1 (v/v). В качестве реагента для визуализации использовали 2% раствор нингидрина в ацетоне. Пятно, содержащее L-треонин, вырезали, L-треонин элюировали 0.5% водным раствором CdCl₂, а количество L-треонина определяли спектрофотометрически при 540 нм. Результаты представлены в Таблице 3.

Состав среды для ферментации (г/л):

Углеводы40.0(NH₄)₂SO₄24.0NaCl0.8KH₂PO₄2.0MgSO₄×7H₂O0.8FeSO₄×7H₂O0.02MnSO₄×5H₂O0.02Тиамин HCl0.0002Дрожжевой экстракт 1.0СаСО₃30.0

Ксилозу и сульфат магния стерилизовали отдельно. СаСО₃ стерилизовали при 180°C в течение 2 часов. рН доводили до 7.0. Антибиотики вносили в среду после стерилизации.

Таблица 3ШтаммКсилозаOD₅₄₀Thr, г/лB-3996/pMW11913.9±1.07.0±0.2B-3996/pMW119mod-xylA-R16.1±0.99.3±0.9

Как видно из Таблицы 3, повышенная экспрессия локуса xylABFGHR повышала продукцию L-треонина штаммом Е.coli B-3996/pMW119, выращиваемом на среде, содержащей ксилозу.

Пример 4. Продукция L-лизина путем ферментации смеси глюкозы и пентозы с использованием бактерии - продуцента L-лизина.

Для оценки продукции L-треонина путем ферментации смеси глюкозы и пентоз использовали штамм Е.coli WC196ΔcadA Δldc. Штамм WC196ΔcadA ΔldcC получен из штамма WC 196 путем инактивации лизидекарбоксилаз, кодируемых генами ldC и cadA, как описано в патенте США 5827698. Трансформацию штамма WC196ΔcadA Δldc плазмидой pMW119mod-xylA-R или вектором pMW119 осуществляли традиционным методом с использованием CaCl₂ с получением штаммов WC196ΔcadA Δldc/pMW119mod-xylA-R и WC196ΔcadA Δldc/pMW119 соответственно.

Каждый из штаммов Е.coli WC196ΔcadA Δldc/pMW119 и WC196ΔcadA Δldc/pMW119mod-xylA-R выращивали в течение 12-15 часов при 37°С на чашках с L-агаром, содержащим ампициллин (150 мг/л). Затем одну петлю каждого из штаммов переносили в ферментационную среду, содержащую в качестве источника ушерода либо ксилозу (4%), либо смесь ксилозы (2%) с глюкозой (2%). Выращивание проводили в 2 мл ферментационной среды 20×200 мм пробирках. Клетки выращивали в течение 25 часов при 32°С на ротоной качалке при 250 об/мин.

После выращивания количество L-лизина, накопленного в среде, определяли методом бумажной хроматографии с использованием с подвижной фазой следующего состава: н-бутанол: уксусная кислота: вода = 4:1:1 (v/v). В качестве реагента для визуализации использовали 2% раствор нингидрина в ацетоне. Пятно, содержащее L-лизин, вырезали, L-лизин элюировали 0.5% водным раствором CdCl₂, количество L-лизина определяли спектрофотометрически при 540 нм. Результаты представлены в Таблице 4.

Состав среды для ферментации (г/л):

Углеводы40.0(NH₄)₂SO₄24.0КН₂PO₄1.0MgSO₄×7H₂O1.0FeSO₄×7H₂O0.01MnSO₄×5H₂O0.01Дрожжевой экстракт2.0СаСО₃30.0

Глюкозу, ксилозу и сульфатмагния стерилизовали раздельно. СаСО₃ стерилизовали при 180°С в течение 2 часов. рН доводили до 7.0 с помощью КОН. Антибиотики вносили в среду после стерилизации.

Таблица 4ШтаммКсилозаГлюкоза/ксилоза 1:1OD₅₄₀Lys, г/лOD₅₄₀Lys, г/лWC196ΔcadA Δldc/pMW119/pMW1195.7±0.20.024.5±0.21.0±0.3WC196ΔcadA Δldc35.2±0.71.8±0.236.7±0.22.0±0.3/pMW119mod-xylA-R    

Как видно из Таблицы 4, повышенная экспрессия локуса xylABFGHR повышала продукцию L-лизина штаммом Е.coli WC196ΔcadA Δldc/pMW119, выращиваемом на среде, содержащей ксилозу.

Пример 5. Продукция L-глутаминовой кислоты путем ферментации смеси глюкозы и пентозы с использованием штамма - продуцента L-глутаминовой кислоты.

Для оценки продукции L-глутаминовой кислоты путем ферментации смеси глюкозы и пентоз использовали штамм Е.coli AJ12624. Трансформацию штамма AJ1AJ12624 плазмидой pMW119mod-xylA-R или вектором pMW119 осуществляли традиционным методом с использованием CaCl₂ с получением штаммов AJ12624/pMW119mod-xylA-R и AJ12624/pMW119 соответственно.

Каждый из штаммов Е.coli AJ12624/pMW119 и AJ12624/pMW119mod-xylA-R выращивали в течение 12-15 часов при 37°С на чашках с L-агаром, содержащим ампициллин (150 мг/л). Затем одну петлю каждого из штаммов переносили в ферментационную среду, содержащую в качестве источника углерода ксилозу (4%). Выращивание проводили в 2 мл ферментационной среды 20×200 мм пробирках. Клетки выращивали в течение 48 часов при 32°С на ротоной качалке при 250 об/мин.

После выращивания количество L-глутаминовой кислоты, накопленной в среде, определяли методом бумажной хроматографии с использованием с подвижной фазой следующего состава: н-бутанол: уксусная кислота: вода = 4:1:1 (v/v). В качестве реагента для визуализации использовали 2% раствор нингидрина в ацетоне. Пятно, содержащее L-глутаминовую кислоту, вырезали, L-глутаминовую кислоту элюировали 0.5% водным раствором CdCl₂, количество L-глутаминовой кислоты определяли спектрофотометрически при 540 нм. Результаты представлены в Таблице 5.

Состав среды для ферментации (г/л):

Углеводы40.0(NH₄)₂SO₄25.0КН₂PO₄2.0MgSO₄×7H₂O1.0Тиамин HCl0.0001L-изолейцин0.07СаСО₃25.0

Ксилозу и сульфат магния стерилизовали раздельно. СаСО₃ стерилизовали при 180°С в течение 2 часов. рН доводили до 7.2

Таблица 5ШтаммКсилозаOD₅₄₀Glu, г/лAJ12624/pMW1198.6±0.34.5±0.2AJ12624/pMW119mod-xylA-R8.0±0.25.3±0.2

Как видно из Таблицы 5, повышенная экспрессия локуса xylABFGHR повышала продукцию L-глутаминовой кислоты штаммом Е.coli AJ12624/pMW119, выращиваемом на среде, содержащей ксилозу.

Пример 6. Продукция L-триптофана путем ферментации смеси глюкозы и пентоз с использованием штамма - продуцента L-триптофана.

Для оценки продукции L-триптофана путем ферментации смеси глюкозы и пентоз использовали штамм Е.coli SV164/pGH5. Трансформацию штамма SV164/pGH5 плазмидой pMW119mod-xylA-R или вектором pMW119 осуществляли традиционным методом с использованием CaCl₂ с получением штаммов SV164/pGH5/pMW119mod-xylA-R и SV164/pGH5/pMW119, соответственно.

Каждый из штаммов Е.coli SV164/pGH5/pMW119 и SV164/pGH5/pMW119mod-xylA-R выращивали в течение 12-15 часов при 37°C на чашках с L-агаром, содержащим тетрациклин (30 мг/л) и ампициллин (150 мг/л). Затем одну петлю каждого из штаммов переносили в ферментационную среду, содержащую в качестве источника углерода либо ксилозу (4%), либо смесь глюкозы (2%) с ксилозой (2%). Выращивание проводили в 2 мл ферментационной среды 20×200 мм пробирках. Клетки выращивали в течение 48 часов при 32°C на ротоной качалке при 250 об/мин.

После выращивания количество L-триптофана, накопленного в среде, определяли методом тонкослойной хроматографии. Использовали 10×15 см пластинки, покрытые 0.11 мм слоем силикагеля Сорбфил без флуоресцентного индикатора (АО Сорбполимер, Краснодар, РФ). Пластинки Сорбфилэкспонировали с подвижной фазой следующего состава: пропан-2-ол: этилацетат: 25% водный аммиак: вода = 40:40:7:16 (v/v). В качестве реагента для визуализации использовали 2% раствор нингидрина в ацетоне. Результаты представлены в Таблице 7. Компоненты среды для ферментации приведены в Таблице 6, но указанные компоненты должны быть стерилизованы отдельными группами А, В, С, D, Е, F и Н для предотвращения их взаимодействия во время стерилизации.

Таблица 6РатсворыКомпонентКонечная концентрация, г/лАКН₂PO₄1.5 NaCl0.5 (NH₄)₂SO₄1.5 L-Methionine0.05 L-Phenylalanine0.1 L-Tyrosine0.1 Mameno (total N)0,07ВGlucose40.0 MgSO₄×7H₂O0.3СCaCl₂0.011DFeSO₄×7H₂O0.075 Sodium citrate1.0ЕNa₂MoO₄×2H₂O0.00015 Н₃ВО₃0.0025 CoCl₂×6Н₂О0.00007 CuSO₄×5H₂O0.00025 MnCl₂×4H₂O0.0016 ZnSO₄×7H₂O0.0003FThiamine HCl0.005GСаСО₃30.0НPyridoxine0.03рН раствора А доводили до 7.1 с помошью NH₄OH.Таблица 7ШтаммКсилозаГлюкоза/ксилоза 1:1OD₅₄₀Trp, г/лOD₅₄₀Trp, г/лSV164/pGH5/pMW1193.5±0.40.5±0.215.3±0.25.3±0.7SV 164/pGH5/pMW119mod-xylA-R13.9±0.53.6±0.515.1±0.86.0±0.5

Как видно из Таблицы 7, повышенная экспрессия локуса xylABFGHR повышала продукцию L-триптофана штаммом Е.coli SV164/pGH5/pMW119, выращиваемом на среде, содержащей ксилозу.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на конкретные примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения. Каждый из вышеупомянутых документов, на который существует ссылка, включен в настоящее описание во все полноте.

Изобретение относится к биотехнологии. L-аминокислоту получают с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, с усиленной экспрессией генов утилизации ксилозы. Способ включает выращивание указанной бактерии - продуцента L-аминокислоты в культуральной жидкости, содержащей ксилозу, и выделение L-аминокислоты из культуральной жидкости. Заявленное изобретение позволяет получать L-аминокислоты с высокой степенью эффективности. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл.

1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент L-аминокислоты, обладающая повышенной экспрессией генов утилизации ксилозы.2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что экспрессия генов утилизации ксилозы повышена за счет усилия экспрессии локуса xylABFGHR.3. Бактерия по п.2, отличающаяся тем, что активность ферментов утилизации ксилозы повышена за счет увеличения количества копий локуса xylABFGHR или модификации последовательности, контролирующей экспрессию генов таким образом, что экспрессия указанных генов усилена.4. Бактерия по п.3, отличающаяся тем, что количество копий указанного локуса увеличено за счет трансформации бактерии низкокопийным вектором, содержащим локус xylABFGHR.5. Бактерия по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что локус xylABFGHR получен из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.6. Способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии по любому из пп.1-5 в питательной среде, содержащей смесь глюкозы и пентоз, и выделения накопленной L-аминокислоты из культуральной жидкости.7. Способ по п.6, отличающийся тем, что пентозами являются арабиноза и ксилоза.8. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанная смесь сахаров является продуктом переработки целлюлозной биомассы.9. Способ по п.6, отличающийся тем, что получаемой L-аминокислотои является L-гистидин.10. Способ по п.9, отличающийся тем, что в указанной бактерии усилена экспрессия генов биосинтеза L-гистидина.11. Способ по п.6, отличающийся тем, что получаемой L-аминокислотой является L-треонин.12. Способ по п.11, отличающийся тем, что в указанной бактерии усилена экспрессия генов биосинтеза L-треонина.13. Способ по п.6, отличающийся тем, что получаемой L-аминокислотой является L-лизин.14. Способ по п.13, отличающийся тем, что в указанной бактерии усилена экспрессия генов биосинтеза L-лизина.15. Способ по п.6, отличающийся тем, что получаемой L-аминокислотой является L-глутаминовая кислота.16. Способ по п.15, отличающийся тем, что в указанной бактерии усилена экспрессия генов биосинтеза L-глутаминовой кислоты.17. Способ по п.6, отличающийся тем, что получаемой L-аминокислотой является L-триптофан.18. Способ по п.17, отличающийся тем, что в указанной бактерии усилена экспрессия генов биосинтеза L-триптофан.