СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-треонина С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia Российский патент 2009 года по МПК C12N1/21 C12P13/04 C12R1/01 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу получения L-аминокислоты путем ферментации и, в частности, к генам, которые способствуют процессу ферментации. Эти гены являются полезными для улучшения продуктивности L-аминокислот, таких, например, как L-треонин, L-лизин, L-лейцин, L-гистидин, L-цистеин, L-фенилаланин, L-аргинин, L-триптофан, L-глутаминовая кислота, L-валин, и L-изолейцин.

Описание предшествующего уровня техники

Обычно L-аминокислоты получают в промышленном масштабе с помощью методов ферментации, используя штаммы микроорганизмов, выделенных из природных источников, или их мутанты. В большинстве случаев микроорганизмы модифицируют таким образом, чтобы увеличить производственный выход L-аминокислот.

К настоящему времени описано много способов увеличения производственного выхода L-аминокислот, включающих трансформацию микроорганизмов с помощью рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4,278,765). Другие способы увеличения производственного выхода включают усиление активности ферментов, участвующих в биосинтезе аминокислоты, и/или уменьшение чувствительности фермента-мишени к ингибированию по типу обратной связи конечной L-аминокислотой (см., например, заявку РСТ WO 95/16042 или патенты США 4,346,170; 5,661,012 и 6,040,160).

Штаммы, используемые для получения L-треонина, известны, включая штаммы с увеличенной активностью ферментов, участвующих в биосинтезе L-треонина (патенты США 5,175,107; 5,661,012; 5,705,371; 5,939,307 и европейский патент ЕР 0219027), штаммы, устойчивые к химическим продуктам, таким как L-треонин и его аналоги (заявка РСТ WO 01/14525A1, европейская заявка ЕР 301572 А2, патент США 5,376,538), штаммы, в которых ключевые ферменты не чувствительны к ингибированию продуцируемой L-аминокислотой или ее производными по типу обратной связи (патенты США 5,175,107; 5,661,012), и штаммы, в которых ферменты, участвующие в разрушении треонина, инактивированы (патенты США 5,939,307; 6,297,031).

В настоящее время одним из наиболее известных продуцентов треонина является штамм-продуцент треонина Escherichia coli VKPM В-3996 (патенты США 5,175,107 и 5,705,371). При конструировании штамма VKPM В-3996 несколько мутаций и плазмида, описанная ниже, были встроены в родительский штамм Е.coli К-12 (VKPM B-7). Мутантный ген thrA (мутация thrA442) кодирует аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, которая является устойчивой к ингибированию треонином по типу обратной связи. Мутантный ген ilvA (мутация ilvA442) кодирует треонин-дезаминазу, которая обладает повышенной активностью, что приводит к снижению скорости биосинтеза изолейцина и к проявлению фенотипа типа «leaky» изолейцинового голодания. В бактерии, содержащей мутацию ilvA442, транскрипция оперона thrABC не угнетается изолейцином; поэтому эта мутация приводит к очень эффективной продукции треонина. Инактивация гена tdh, кодирующего треониндегидрогеназу, приводит к предотвращению разрушения треонина. Генетическая детерминанта ассимиляции сахарозы (гены scrKYABR) была перенесена в этот штамм. Для усиления экспрессии генов, контролирующих биосинтез треонина, плазмида pVIC40, содержащая мутантный треониновый оперон thrA442BC, была введена в промежуточный штамм TDH6. Количество L-треонина, накапливаемое в процессе ферментации штамма, может достигать 85 г/л.

При оптимизации главного пути биосинтеза желаемого соединения дальнейшее улучшение штаммов-продуцентов L-аминокислот может быть достигнуто путем снабжения бактерии повышенным количеством сахаров в качестве источника углерода, например глюкозы или арабинозы. Несмотря на эффективный транспорт глюкозы системой PTS, снижение высокопродуктивного штамма источником углерода, тем не менее, может быть недостаточным.

Известно, что активный транспорт сахаров и других метаболитов в бактериальных клетках осуществляется несколькими транспортными системами. Одной из них является переносчик AlsABC.

Транспортные системы ABC, предназначенные для введения или выведения питательных веществ и других субстанций через клеточную мембрану, широко распространены в природе. Для большинства бактериальных систем основным фактором, определяющим специфичность транспортного комплекса в целом, является периплазматический компонент (Chaudhuri BN, Ко J, Park C, Jones ТА, Mowbray SL.; J Mol Biol. 1999 Mar 12; 286(5):1519-31).

Периплазматические белок-связывающие транспортные системы состоят из периплазматического субстрат-связывающего белка, из двух (иногда из одного) очень гидрофобных интегральных мембранных белков, и одного (иногда двух) гидрофильного поверхностного мембранного белка, который связывает и гидролизует АТФ. Эти системы образуют надсемейство АВС-переносчиков (Saurin W, Dassa E.; Protein Sci. 1994 Feb; 3(2):325-44).

Переносчик AlsABC принадлежит к надсемейству АТФ-связывающих кассетных транспортных белков (ABC-ATP-binding Cassette). Он отвечает за усвоение D-аллозы, гексозы с гидроксильными группами в цис-положении, которая может использоваться бактерией E.coli в качестве единственного источника углерода. Делеция генов als приводила к неспособности бактерии к росту на D-аллозе. Методом флуоресцентной спектроскопии установлено, что белок AlsB является периплазатическим белком, который связывает D-аллозу с константой диссоциации K_d=0.33 мкМ. По данным анализа сходства последовательности, белок AlsA является АТФ-связывающим компонентом, а белок AlsC является мембранным компонентом АВС-переносчика. Система AlsABC также переносит рибозу с низкой аффинностью. Комплементационный анализ als-мутантов показал, что клонированные гены als могут восстанавливать рост бактерии на минимальной среде с рибозой. Изучение транскрипционно «слитых» с β-галактозидазой белков привело к предположению, что белок AlsR является негативным регулятором генов alsABC, a транскрипция гена alsR регулируется аллозой (Kim С, Song S, Park С.; J Bacteriol. 1997 Dec; 179(24):7631-7).

Оперон, ответственный за метаболизм D-аллозы, был локализован на 92.8 минуте на карте сцепления генетических признаков E.coli. Он состоит из шести генов, alsRBACEK, которые индуцируются D-аллозой и находятся под контролем репрессорного гена-регулятора alsR, кодирующего белок-репрессор. Этот оперон также подвержен катаболитной репрессии. Три гена, alsB, alsA, и alsC, необходимы для транспорта D-аллозы. D-аллоза-связывающий белок, который кодируется геном alsB, является периплазматическим белком с Mr=32,779, который обладает аффинностью к D-аллозе с K_d=0.33 мкМ. По аналогии с другим промежуточным связывающим белком АВС-переносчиков было установлено, что транспортная система аллозы включает АТФ-связывающий компонент (AlsA) и трансмембранный белок (AlsC). Белок AlsA имеет молекулярную массу Mr=56,614 и кодируется геном alsA, который расположен после гена alsB. Белок с молекулярной массой Mr=34,185 кодируется геном alsC, который расположен после гена alsA. Было установлено, что белок AlsE (предположительно D-аллоза-6-фосфат-3-эпимераза), но не белок AlsK (предположительно киназа D-аллозы) необходим для метаболизма аллозы. Переносчик D-аллозы частично участвует в низкоаффинном транспорте D-рибозы (Kirn С, Song S, Park С.; J Bacteriol. 1997 Dec; 179(24):7631-7).

Однако в настоящее время нет сообщений, описывающих использование бактерий семейства Enterobacteriaceae, обладающих усиленной экспрессией оперона alsABC для увеличения продукции L-амино кислот путем ферментации глюкозы.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 изображено взаимное расположение праймеров Р1 и Р2 на плазмиде pMW 118-attL-Cm-attR.

На Фиг.2 изображено конструирование фрагмента хромосомной ДНК, содержащего инактивированный оперон ptsHI-crr.

На Фиг.3 изображена замена области природного промотора оперона alsABC в Е.coli на гибридный промотор Р_L-tac.

На Фиг.4 изображено влияние P_L-tacalsABC на рост PTS^- штамма. MG1655 означает штамм Е.coli MG1655; MGΔpts означает штамм Е.coli MG1655ΔptsHI-crr; и MGΔpts-P-alsABC означает штамм Е.coli MG1655 ΔptsHI-crr P_L-tacalsABC.

На Фиг.5 показан результат выравнивания первичных последовательностей AlsB из Yersinia pseudotuberculosis (YERPS), Yersinia pestis (YERPE), Bacillus subtilis (BACSU), Bacillus cereus (BACC1), Escherichia coli (ECOLI), Symbiobacterium thermophilum (SYMTH). Выравнивание было осуществлено с использованием PIR Multiple Alignment program (http://pir.georgetown.edu). Идентичные аминокислоты отмечены звездочкой (*), сходные аминокислоты отмечены двоеточием (:).

На Фиг.6 показан результат выравнивания первичных последовательностей AlsA из Yersinia pestis (YERPE), Bacillus cereus (BACC1), Bacillus subtilis (BACSU), Yersinia pseudotuberculosis (YERPS), Escherichia coli (ECOLI), Symbiobacterium thermophilum (SYMTH). Выравнивание было осуществлено с использованием PIR Multiple Alignment program (http://pir.georgetown.edu). Идентичные аминокислоты отмечены звездочкой (*), сходные аминокислоты отмечены двоеточием (:).

На Фиг.7 показан результат выравнивания первичных последовательностей Als С из Escherichia coli (ECOLI), Symbiobacterium thermophilum (SYMTH), Bacillus cereus (BACC1), Bacillus subtilis (BACSU), Yersinia pestis (YERPE), Yersinia pseudotuberculosis (YERPS). Выравнивание было осуществлено с использованием PIR Multiple Alignment program (http://pir.georgetown.edu). Идентичные аминокислоты отмечены звездочкой (*), сходные аминокислоты отмечены двоеточием (:).

Описание изобретения

Целями настоящего изобретения являются повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислоты и предоставление способа получения неароматических и ароматических L-аминокислот с использованием этих штаммов бактериальных клеток.

Вышеупомянутые цели были достигнуты путем установления того факта, что усиление экспрессии оперона alsABC, кодирующего переносчик D-аллозы, может привести к повышению продуктивности L-аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-лейцин, L-гистидин, L-цистеин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-валин, L-изолейцин и L-аргинин путем ферментации с использованием глюкозы в качестве источника углерода. Недостаток источника углерода был смоделирован путем удаления транспортной системы PTS (ptsHI-crr) в штамме-продуценте L-аминокислоты.

Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии-продуцента L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что в указанной бактерии усилена экспрессия оперона alsABC.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная экспрессия оперона alsABC усилена путем модификации последовательности, контролирующей экспрессию оперона alsABC таким образом, что экспрессия гена усиливается, или путем увеличения количества копий оперона alsABC.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия выбрана из группы, состоящей из бактерий рода Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella and Morganella.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, при этом указанный оперон кодирует:

(А) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или его вариант;

(Б) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или его вариант; и

(С) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6 или его вариант;

при этом в случае, когда указанные варианты присутствуют в указанном опероне, такие варианты обладают активностью высокоаффинных переносчиков D-аллозы, когда указанные варианты сочетаются вместе.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, при этом указанный оперон включает:

(А) фрагмент ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность с номерами нуклеотидов с 1 по 936 в SEQ ID NO:1, или фрагмент ДНК, который гибридизуется с указанной последовательностью или с зондом, синтезированным на основе указанной последовательности, в жестких условиях;

(Б) фрагмент ДНК, включающий нуклеотидную последовательность с номерами нуклеотидов с 1 по 1533 в SEQ ID NO:3, или фрагмент ДНК, который гибридизуется с указанной последовательностью или с зондом, синтезированным на основе указанной последовательности, в жестких условиях; и

(С) фрагмент ДНК, включающий нуклеотидную последовательность с номерами нуклеотидов с 1 по 981 в SEQ ID NO:5, или фрагмент ДНК, который гибридизуется с указанной последовательностью или с зондом, синтезированным на основе указанной последовательности, в жестких условиях; и

при этом случае, когда в указанном опероне присутствуют указанные фрагменты ДНК, которые гибридизуются с указанными последовательностями или с указанными зондами, такие фрагменты ДНК кодируют белки, обладающие активностью высокоаффинного переносчика D-аллозы, когда указанные белки сочетаются вместе.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, при этом указанные жесткие условия представляют собой такие условия, при которых отмывка проводится при температуре 60°С при концентрации соли 1×SSC и 0,1% SDS, приблизительно в течение 15-ти минут.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, при этом указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, чтобы увеличить активность глюкокиназы.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, при этом указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, чтобы увеличить активность изомеразы ксилозы.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-треонина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, при этом указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что у такой бактерии усилена экспрессия гена, выбранного из группы, включающей:

- мутантный ген thrA, который кодирует аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I и является устойчивой к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- ген thrB, который кодирует гомосеринкиназу;

- ген thrC, который кодирует треонинсинтазу;

- ген rhtA, который кодирует предположительно трансмембранный белок;

- ген asd, который кодирует аспартат-β-полуальдегиддегидрогеназу;

- ген aspC, который кодирует аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу); и

комбинацию этих генов.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-лизина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-гистидина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-фенилаланина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-аргинина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-триптофана.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, при этом указанная бактерия является бактерией-продуцентом L-глутаминовой кислоты.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, который включает в себя выращивание описанной выше бактерии в питательной среде, содержащей глюкозу в качестве источника углерода, и выделение L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, при этом указанная L-аминокислота является L-треоином.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, при этом указанная L-аминокислота является L-лизином.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, при этом указанная L-аминокислота является L-гистидином.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, при этом указанная L-аминокислота является L-фенилаланином.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, при этом указанная L-аминокислота является L-аргинином.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, при этом указанная L-аминокислота является L-триптофаном.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, при этом указанная L-аминокислота является L-глутаминовой кислотой.

Подробное описание наилучшего способа осуществления изобретения

Согласно настоящему изобретению «бактерия-продуцент L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к продукции и выделению L-аминокислоты в питательную среду, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Способность бактерии продуцировать L-аминокислоту может быть придана или увеличена путем выведения. Используемый здесь термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» также означает бактерию, которая способна к продукции L-аминокислоты и вызывает накопление L-аминокислоты в ферментационной среде в больших количествах, по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким как штамм Е.coli K-12, и, предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее чем 0.5 г/л, более предпочтительно, не менее чем 1.0 г/л. Термин «L-аминокислота» включает в себя L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин. Аминокислоты L-треонин, L-лизин, L-гистидин, L-фенилаланин, L-аргинин, L-триптофан, и L-глутаминовая кислота являются предпочтительными.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Envinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и т.д. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock). Бактерия, принадлежащая к родам Escherichia или Pantoea, предпочтительна.

Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)).

Бактерия, согласно настоящему изобретению, включает в себя штамм семейства Enterobacteriaceae, который способен продуцировать L-аминокислоту и модифицирован таким образом, что экспрессия оперона alsABC у этой бактерии усилена. Кроме того, бактерия, согласно настоящему изобретению, включает штамм семейства Enterobacteriaceae, который способен продуцировать L-аминокислоту и трансформирован с помощью фрагмента ДНК, кодирующего оперон alsABC таким образом, что компоненты переносчика D-аллозы, кодируемые этим фрагментом ДНК, экспрессируются.

Фраза «активность высокоаффинного переносчика D-аллозы» означает активность переноса сахаров, таких как D-аллоза и глюкоза, в клетку. Активность высокоаффинного переносчика D-аллозы может быть обнаружена и измерена с использованием мембранных везикул, таких, которые описаны в работах Daruwalla et al (Biochem J., 200(3), 611-27 (1981)) или путем комплементации штамма с делегированными генами оперона alsABC высокоаффинного переносчика D-аллозы (Horazdovsky, B.F. and Hogg, R.W., J. Bacteriol; 171(6):3053-9(1989)).

Термин «усиление экспрессии оперона» означает, что уровень экспрессии генов, составляющих оперон, выше, чем у немодифицированного штамма, например, природного штамма. Примеры такой модификации включают в себя увеличение числа копий гена(ов) оперона в расчете на клетку и/или повышение уровня экспрессии гена(ов) оперона и тому подобное. Количество копий гена оперона измеряется, например, с помощью ряда известных методов, таких как блотинг по Саузерну с использованием зондов, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности генов оперона, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), и подобными им методами. Уровень экспрессии генов оперона может быть измерен с помощью ряда известных методов, включающих блотинг по Нозерну, количественный ОТ-ПЦР и подобные им. Кроме того, природные штаммы, которые могут выступать в качестве контроля, включают, например, штаммы Escherichia coli К-12 или Pantoea ananatis FERM ВР-6614 (заявка РСТ WO 2004099426, AU 2004236516 A1). Штамм Pantoea ananatis FERM ВР-6614 был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии (National Institute of Bioscience and Human- Technology, Agency of Industrial Science and Technology), в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, 19 февраля 1998 года и получил инвентарный номер PERM P-16644. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 11 января 1999 года и штамм получил инвентарный номер PERM BP-6614. Хотя этот штамм при выделении был идентифицирован как Enterobacter, тем не менее, позднее он был классифицирован как Pantoea ananatis на основе нуклеотидной последовательности 16S рРНК и других доказательств, приведенных ранее. В результате увеличения внутриклеточной активности переносчика D-аллозы, L-аминокислоты, например, L-треонин, L-лизин, L-гистидин, L-фенилаланин, L-триптофан или L-глутаминовая кислота, обнаруживаются в культуральной среде.

Оперон alsABC включает три гена в следующей последовательности. Ген alsB (синонимы - ЕСК4081, b4088, yjcX) кодирует белок, связывающий D-аллозу (синонимы - В4088, YjcX). Ген alsB (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с номерами с 4,309,130 по 4,310,065 в нуклеотидной последовательности с инвентарным номером NC_000913 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен на хромосоме штамма Е.coli К-12 между генами rpiR и alsA. Ген alsA (синонимы - ЕСК4080, b4087, yjcW) кодирует слитые субъединицы переносчика D-аллозы надсемейства АВС:АТФ-связывающие компоненты переносчика D-аллозы (синонимы - B4087, YjcW). Ген alsA (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с номерами с 4,307,471 по 4,309,003 в нуклеотидной последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 16131913) расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами alsB и alsC. Ген alsC (синонимы - yjcV, ECK4079, b4086, JW4047) кодирует субъединицу переносчика D-аллозы (синонимы - B4086, YjcV). Ген alsC (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с номерами с 4,306,512 по 4,307,492 в нуклеотидной последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами alsA и alsE. Другие опероны alsABC известны как: оперон alsABC из Shigella dysenteriae serotype I, Shigella sonney, Erwinia carotovora subsp. atroseptica, Yersinia pestis, Yersiniapseudotuberculosis, Pseudomonas pseudomallei, Pseudomonas mallei, Pseudomonas solanacearum. Нуклеотидные последовательности генов alsB, alsA, и alsC из Escherichia coli приведены в Перечне последовательностей под номерами: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, и SEQ ID NO:5, соответственно. Аминокислотные последовательности, кодируемые генами alsB, alsA, и alsC приведены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, и SEQ ID NO:6, соответственно,

Будучи транспортированной в клетку глюкоза фосфорилируется глюкокиназой, которая кодируется геном glk. Поэтому желательно модифицировать бактерию таким образом, чтобы усилить активность глюкокиназы. Ген glk, который кодирует глюкокиназу в Escherichia coli, известен (номера нуклеотидов с 2506481 по 2507446 в нуклеотидной последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank; gi: 16127994) расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между рамками считывания b2387 и b2389.

При определенных условиях, изомераза ксилозы, кодируемая геном xylA, также эффективно катализирует конверсию D-глюкозы в D-фруктозу (Wovcha, M.G. et al, AppI Environ Microbiol. 45(4): 1402-4 (1983)). Поэтому желательно модифицировать бактерию таким образом, чтобы усилить активность изомеразы ксилозы. Ген ху1А, который кодирует изомеразу ксилозы в Escherichia coli, известен (номера нуклеотидов с 3728788 по 3727466 в нуклеотидной последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами xylB и xylF.

Гены alsABC, glk и xylA могут быть получены с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе известных нуклеотидных последовательностей генов. Гены, кодирующие переносчик D-аллозы из других микроорганизмов, могут быть получены подобным образом.

Примерами генов оперона alsABC являются выделенные из Escherichia coli фрагменты ДНК, которые кодируют следующие белки:

(A) белок, включающий аминокислотную последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2 и ее варианты;

(Б) белок, включающий аминокислотную последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:4 и ее варианты;

(B) белок, включающий аминокислотную последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:6 и ее варианты.

Термин «вариант белка» в значении, в котором она используется в настоящем изобретении, означает белок, который имеет изменения в аминокислотной последовательности, а именно делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, при условии, что при этом сохраняется необходимый уровень активности белка, например, такой уровень активности, который обеспечивает усиленную продукцию L-аминокислоты. Ряд изменений в варианте белка зависит от положения или от типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Количество изменений может составлять от 1-го до 30-ти, предпочтительно от 1-го до 15-ти и наиболее предпочтительно от 1-го до 5-ти изменений в последовательностях белка под номерами 2, 4, 6 (SEQ ID NO:2, 4, 6). Эти изменения могут иметь место в областях белка, которые не являются критичными для его функции. Это становится возможным благодаря тому, что аминокислоты обладают высокой гомологией друг с другом, и поэтому третичная структура или активность белка не нарушаются при таком изменении. Поэтому в качестве варианта белка может выступать белок, который имеет гомологию не менее чем 70%, предпочтительно не менее чем 80%, более предпочтительно, не менее чем 90% и наиболее предпочтительно, не менее чем 95% по отношению к полной аминокислотной последовательности, представленной на SEQ ID NOs.2, 4, 6 при условии, что активность переносчика D-аллозы сохраняется, когда этот белок сочетается с соответствующими компонентами высокоаффинного переносчика D-аллозы. В качестве примера компонентов, с которыми может комбинироваться высокоаффинный переносчик D-аллозы, могут служить следующие компоненты: вариант белка, приведенный в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2, комбинируется с белками, имеющими аминокислотную последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:6, вариант белка, приведенный в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:4, комбинируется с белками, имеющими аминокислотную последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:6, и вариант белка, приведенный в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:6, комбинируется с белками, имеющими аминокислотную последовательность, приведенную в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4. Гомология между аминокислотными последовательностями может быть установлена с использованием хорошо известных методов, например с помощью выравнивания последовательностей в компьютерной программе BLAST 2.0, которая вычисляет три параметра: счет, идентичность и сходство.

Замена, делеция, инсерция, добавление или инверсия одного или нескольких аминокислотных остатков будут представлять собой консервативную мутацию или консервативные мутации при условии, что активность белка при этом сохраняется. Примером консервативной мутации(ий) является консервативная замена(ы). Примеры консервативных замен включают замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gin, His или Lys, замену Asn на Glu, Gin, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gin, замену Cys на Ser или Ala, замену Gin на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gin, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gin, Arg или Tyr, замену Не на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на He, Met, Val or Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gin, His или Arg, замену Met на Ile, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, He или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp и замену Val на Met, He или Leu.

Результаты сравнения первичных аминокислотных последовательностей белков alsABC из Escherichia coli (ECOLI), Symbiobacterium thermophilum (SYMTH), Bacillus cereus (BACC1), Bacillus subtilis (BACSU), Yersinia pestis (YERPE), Yersinia pseudotuberculosis (YERPS) выявили высокий уровень гомологии среди этих белков (см. Фиг.5, Фиг.6, Фиг.7). С этой точки зрения, замены или делеции аминокислотных остатков, которые являются идентичными (отмеченные звездочками (*)) во всех вышеуказанных белках могут быть критическими для их функции. Возможно, что замена сходных аминокислотных остатков (отмеченных двоеточием (:)) на сходные аминокислотные остатки не приведет к нарушению активности белка. Но модификации других неконсервативных аминокислотных остатков могут не привести к нарушению активности высокоаффинного переносчика D-аллозы.

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу те же белки, которые являются компонентами переносчика D-аллозы, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, кодирующих компоненты переносчика D-аллозы (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:5 соответственно), например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут вовлечены в делецию, замену, инсерцию или добавление. Фрагменты ДНК, модифицированные как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов мутагенной обработки. Такая обработка включает в себя обработку гидроксиламином молекул ДНК, кодирующих белки согласно настоящему изобретению или обработку бактерий, содержащих указанную ДНК, УФ-лучами или реагентом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота,

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу те же белки, которые являются компонентами переносчика D-аллозы, могут быть получены путем экспрессирования фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, в соответствующей клетке, и установления активности экспрессируемого продукта. Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу те же белки, которые являются компонентами переносчика D-аллозы, могут быть также получены путем выделения фрагментов ДНК, которые гибридизовали с зондами, имеющими нуклеотидную последовательность, которая содержит, например, любую из нуклеотидных последовательностей, приведенных в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, и SEQ ID NO:5 в жестких условиях, и кодирует белки, обладающие активностью компонентов переносчика D-аллозы. "Жесткие условия", в том значении, которое приписывается этому выражению в рамках настоящего изобретения, означает такие условия, при которых так называемые специфические гибриды образуются, а неспецифические гибриды не образуются. Например, демонстрацией жестких условий могут быть такие условия, при которых фрагменты ДНК, имеющие высокую гомологию, например фрагменты ДНК, имеющие гомологию не менее чем 50%, предпочтительней не менее чем 60%, более предпочтительней не менее, чем 70%, еще более предпочтительней не менее чем 80%, еще более предпочтительней не менее чем 90% и наиболее предпочтительней не менее чем 95% способны гибридизоваться друг с другом, а фрагменты ДНК, имеющие гомологию более низкую, чем описано выше, неспособны гибридизоваться друг с другом. Кроме того, демонстрацией жестких условий могут служить такие условия, при которых фрагменты ДНК гибридизуются при концентрации соли, эквивалентной условиям однократной отмывки при гибридизации по Саузерну, которые составляют 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от типа мембраны, используемой для блотинга и, как правило, рекомендуется производителем набора. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для мембраны Hybond™ N+ nylon (Amersham, США), в жестких условиях составляет приблизительно 15 минут. Желательно отмывку повторять 2-3 раза. В качестве зондов могут быть также использованы неполные нуклеотидные последовательности, приведенные в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5. Зонды могут быть приготовлены с помощью ПЦР с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидных последовательностей, приведенных в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 и на основе фрагментов ДНК, содержащих нуклеотидные последовательности, приведенные в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 в качестве матрицы. В тех случаях, когда фрагмент ДНК, имеющий длину около 300 п.о., используется в качестве зонда, условия отмывки в процессе гибридизации включают, например, 50°С, 2×SSC и 0.1% SDS.

Замена, делеция, инсерция или добавление нуклеотидов, так как они описаны выше, также включает мутацию, которая имеет место в природе (мутант или вариант), например, обусловленную изменчивостью видов или родов бактерий, которые содержат компоненты переносчика D-аллозы.

«Трансформация бактерии с помощью фрагмента ДНК, кодирующего белок» означает введение фрагмента ДНК в бактерию, например, хорошо известными методами. Трансформация этой ДНК приведет к усилению экспрессии гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению и к увеличению активности белка в бактериальной клетке. Методы трансформации включают любые известные методы, которые описаны до настоящего времени. Например, метод обработки реципиентных клеток хлоридом кальция для того, чтобы увеличить проницаемость клеток для ДНК, был описан для штамма Escherichia coli К-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) и может быть использован.

Способы усиления экспрессии гена включают увеличение количества копий гена. Встраивание гена в вектор, который способен функционировать в бактерии семейства Enterobacteriaceae увеличивает количество копий этого гена. Предпочтительней использовать низкокопийные вектора. Примерами низкокопийных векторов могут служить, но не ограничиваются только ими, плазмиды pSC101, pMW118, pMW119 и подобные им. Термин «низкокопийный вектор» применяется для обозначения векторов, количество копий которых не превышает пяти копий на клетку.

Усиление экспрессии гена может также быть достигнуто путем внедрения множественных копий гена в хромосому бактерии с помощью, например, метода гомологичной рекомбинации, Mu интеграции и подобными им. К примеру, один цикл Mu интеграции позволяет встроить до трех копий гена в хромосому бактерии.

Усиление экспрессии генов оперона alsABC может быть также достигнуто путем внедрения множественных копий генов оперона alsABC в хромосому бактерии. Для внедрения множественных копий указанного оперона в хромосому бактерии проводится гомологичная рекомбинация с использованием последовательности, чьи множественные копии присутствуют в качестве мишеней в хромосомной ДНК. Последовательности, имеющие множественные копии в хромосомной ДНК, включают, но не ограничиваются только ими, повторяющиеся ДНК или инвертированные повторы, присутствующие на конце транспозабельного элемента. Так же, как это описано в патенте США 5,595,889, возможно внедрить оперон alsABC в транспозон и благодаря этому переносить и внедрять множество копий гена в хромосомную ДНК.

Усиление экспрессии генов указанного оперона может быть также произведено путем контроля экспрессии генов с помощью сильного промотора. Например, промоторы lac, trp и trc, а также промоторы P_R или P_L фага лямбда, известны в качестве сильных промоторов. Использование сильного промотора может сочетаться с увеличением числа копий гена.

С другой стороны, промотор может быть усилен, например, путем введения мутации в указанный промотор с целью повышения уровня транскрипции гена, расположенного на хромосоме после промотора. Далее, известно, что замена нескольких нуклеотидов в участке между местом связывания рибосомы (RBS) и старт кодоном, а в особенности, в последовательности непосредственно перед старт-кодоном, в значительной степени влияет на транслируемость мРНК. Например, было обнаружено 20-кратное изменение уровня экспрессии в зависимости от природы трех нуклеотидов, предшествующих старт кодону (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984), Как описано выше, авторы настоящего изобретения установили, что мутация rhtA23 является заменой А на G в положении -1 относительно старт кодона ATG (ABSTRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.457). Поэтому было высказано предположение, что мутация rhtA23 усиливает экспрессию гена rhtA и, как следствие, увеличивает уровень устойчивости к треонину, гомосерину и некоторым другим субстратам, экспортируемым из клетки.

Более того, возможно ввести нуклеотидные замены в промоторный участок гена ВСАТ в хромосоме бактерии таким образом, что указанный промотор станет более сильным. Изменение последовательности, контролирующей экспрессию, может быть осуществлено, например, таким же методом, как замена гена с использованием плазмиды, чувствительной к температуре, как это описано в международной патентной заявке WO 00/18935 или в выложенной патентной заявке Японии №1-215280 А.

Методами получения плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобными им могут являться обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Описанные выше способы и руководства для увеличения активности переносчика аллозы также применимы для увеличения активности изомеразы ксилозы и глюкокиназы.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем внедрения вышеуказанных фрагментов ДНК в бактерию, которая уже обладает способностью продуцировать L-аминокислоты. Более того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, содержащей указанные фрагменты ДНК, способности продуцировать L-аминокислоты.

Бактерия-продуцент L-аминокислоты

В качестве бактерии согласно настоящему изобретению, модифицированной таким образом, что экспрессия генов alsABC усилена, может быть использована бактерия, способная к продукции L-аминокислот.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем усиления экспрессии генов alsABC в бактерии, уже обладающей способностью к продукции L-аминокислот. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, в которой экспрессия генов alsABC уже усилена, способности к продукции L-аминокислот.

Бактерия-продуцент L-треонина

Примеры родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli TDH-6/pVIC40 (VKPM В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е.coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е.coli FERM ВР-3756 (патент США 5474918), штаммы Е.coli FERM ВР-3519 и FERM ВР-3520 (патент США 5376538), штамм Е.coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобные им.

Штамм TDH-6 является дефектным по гену thrC, способен ассимилировать сахарозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 7 апреля 1987 года с инвентарным номером VKPM В-3996.

Штамм Е.coli VKPM В-5318 (ЕР 0593792 В) может также быть использован в качестве родительского штамма для получения L-треонин-продуцирующей бактерии согласно настоящему изобретению. Штамм В-5318 является прототрофным в отношении изолейцина, а температурочувствительный репрессор фага лямбда С1 и промотор PR заменяет регуляторную область треонинового оперона в плазмиде pVIC40. Штамм VKPM В-5318 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 03 мая 1990 года с инвентарным номером VKPM В-5318.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована таким образом, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих генов:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;

- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок;

- гена asd, кодирующего аспартат-β-семиальдегиддегидрогеназу, и

- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу).

Нуклеотидная последовательность гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrA расположен на хромосоме штамма Е.coli К-12 между генами thrL и thrB. Нуклеотидная последовательность гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrB расположен на хромосоме штамма Е.coli К-12 между генами thrA и thrC. Нуклеотидная последовательность гена thrC, кодирующего треонинсинтазу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrC расположен на хромосоме штамма Е.coli К-12 между геном thrB и открытой рамкой считывания уааХ. Все три указанных гена функционируют как один треониновый оперон. Для усиления экспрессии треонинового оперона, область аттенуатора, который нарушает транскрипцию, желательно удалить из оперона (заявки по РСТ WO 2005/049808, WO 2003/097839).

Мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, так же, как и гены thrB и thrC, могут быть получены в виде единого оперона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая представлена в штамме-продуценте Е.coli VKPM В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5,705,371.

Ген rhtA расположен на 18 минуте хромосомы Е.coli около оперона glnHPQ, который кодирует компоненты транспортной системы глутамина, ген rhtA идентичен ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА218541 в базе данных GenBank, gi:440181), расположен между генами рехВ и ompX. Участок ДНК, экспрессирующийся с образованием белка, кодируемого рамкой считывания ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine). Также было показано, что мутация rhtA13 представляет собой замену А-на-G в положении -1 по отношению к старт кодону ATG (ABSTRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.457, EP 1013765 A).

Нуклеотидная последовательность гена asd из E.coli известна (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi: 16131307) и может быть получена с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности указанного гена. Гены asd из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.

Также нуклеотидная последовательность гена aspC из E.coli известна (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi:16128895) и может быть получена с помощью ПЦР. Гены aspC из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.

Бактерия-продуцент L-лизина

Примеры бактерий-продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Escherichia, включают мутанты, обладающие устойчивостью к аналогу L-лизина. Аналог L-лизина ингибирует рост бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но это ингибирование полностью или частично снимается, когда в среде также присутствует L-лизин. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваются оксализином, лизингидроксаматом, S-(2-аминоэтил)-L-цистеином (АЕС), γ-метиллизном, α-хлорокапролактамом и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к указанным аналогам лизина, могут быть получены путем обработки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, традиционными мутагенами. Конкретные примеры бактериальных штаммов, используемых для получения L-лизина, включают штамм Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL В-12185; смотри патент США 4,346,170) и штамм Escherichia coli VL611. В этих микроорганизмах аспартокиназа устойчива к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.

Штамм WC196 может быть использован в качестве бактерии-продуцента L-лизина Escherichia coli. Данный бактериальный штамм был получен путем селекции фенотипа устойчивости к АЕС у штамма W3110, производного от штамма Escherichia coli К-12. Полученный штамм был назван Escherichia coli AJ13069 и был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии (National Institute ofBioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology), в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), 6 декабря 1994 года и получил инвентарный номер FERM Р-14690. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 29 сентября 1995 года, и штамм получил инвентарный номер FERM BP-5252 (смотри патент США 5,827,698).

Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-лизин, согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-лизина, включают, но не ограничиваются ими, дигидродипиколинатсинтазу (dapA), аспартокиназу (lysC), дигидродипиколинатредуктазу (dapB), диаминопимелатдекарбоксилазу (lysA), диаминопимелатдегидрогеназу (ddh) (патент США, 6,040,160), фосфоенолпируваткарбоксилазу(ppc), аспартатсемиальдегиддегидрогеназу (asd), никотинамидадениндинуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) и аспартазу (aspA) (европейская заявка ЕР 1253195 А). Кроме того, родительские штаммы могут иметь повышенный уровень экспрессии гена, вовлеченного в процесс дыхания (cyo) (европейская заявка ЕР 1170376 А), гена, кодирующего никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) (патент США 5,830,716), гена ybjE (заявка РСТ WO 2005/073390), или комбинации этих генов.

Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-лизин, согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина, включают гомосериндегидрогеназу, лизиндекарбоксилазу (патент США 5,827,698) и малатдегидрогеназу (заявка РСТ WO 2005/010175).

Бактерия-продуцент L-цистеина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-цистеина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli JM15, трансформированный различными аллелями гена cysE, кодирующими устойчивые к ингибированию по типу обратной связи серинацетилтрансферазы (патент США 6,218,168, патентная заявка РФ 2003121601); штамм Е.coli W3110, содержащий сверхэкспрессированные гены, кодирующие белок, способный к секреции соединений, токсичных для клетки (патент США 5,972,663); штаммы Е.coli, содержащие цистеиндесульфогидразу со сниженной активностью (патент Японии JP 11155571 А2); штамм Е.coli W3110 с повышенной активностью позитивного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (международная заявка РСТ WO 0127307 A1) и подобные им.

Бактерия-продуцент L-лейцина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-лейцина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli, устойчивые к аналогам лейцина, включающих, например, β-2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин и 5,5,5-трифлуоролейцин (выложенные патентные заявки Японии 62-34397 и 8-70879), штаммы Е.coli, полученные с помощью генно-инженерных методов, описанных в заявке РСТ 96/06926; Е.coli штамм Н-9068 (JP 8-70879 A2), и подобные им.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-лейцина. Примеры таких генов включают в себя гены оперона leuABCD, и предпочтительно представлены мутантным геном leuA, кодирующим изопропилмалатсинтазу со снятым ингибированием L-лейцином по типу обратной связи (патент США 6,403,342). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, которые экспортируют L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают в себя гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (европейская заявка ЕР 1239041 А2).

Бактерия-продуцент L-гистидина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-гистидина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-гистидина, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 24 (VKPM В-5945, патент РФ 2003677); штамм Е.coli 80 (VKPM В-7270, патент РФ 2119536); штаммы Е.coli NRRL В-12116 - В12121 (патент США 4,388,405); штаммы Е.coli Н-9342 (FERM ВР-6675) и Н-9343 (FERM ВР-6676) (патент США 6,344,347); штамм Е.coli H-9341 (FERM BP-6674) (Европейский патент 1085087); штамм Е.coli AI80/pFM201 (патент США 6,258,554) и подобными им. Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-гистидин, согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-гистидина. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-гистидина, включают АТФ-фосфорибозилтрансферазу (hisG), фосфорибозил-АМФ-циклогидролазу (hisi), фосфорибозил-АТФ-фосфогидролазу (hisIE), фосфорибозилформимино-5-аминоимидазолкарбоксамидриботидизомеразу (hisA), амидотрансферазу (hisH), гистидинолфосфатаминотрансферазу (hisC), гистидинолфосфатазу (hisB), гистидинолдегидрогеназу (hisD) и т.д.

Известно, что гены, кодирующие ферменты биосинтеза L-гистидина (hisG, hisBHAFI), ингибируются L-гистидином, поэтому способность к продукции L-гистидина также может быть значительно усилена введением мутации, придающей устойчивость к ингибированию по типу обратной связи, в ген АТФ-фосфорибозидтрансферазы (hisG) (патенты РФ. 2003677 и 2119536).

Специфические примеры штаммов, обладающих способностью к продукции L-гистидина, включают Е.coli FERM-P 5038 и 5048, в которые был введен вектор, содержащий ДНК, кодирующую фермент биосинтеза L-гистидина (заявка Японии 56-005099 А), штаммы E.coli, в которые введен ген rht, для экспорта аминокислоты (европейская заявка ЕР 1016710 А), штамм Е. coli 80, которому придана устойчивость к сульфагуанидину, DL-1,2,4-триазол-3-аланину и стрептомицину (VKPM В-7270, патент РФ 2119536), и т.д.

Бактерия-продуцент L-глутаминовой кислоты

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli VL334 thrC⁺ (Европейский патент ЕР 1172433). Штамм Е.coli VL334 (VKPM В-1641) является ауксотрофом по L-изолейцину и L-треонину с мутациями в генах thrC и ilvA (патент США 4,278,765). В этот штамм была перенесена природная аллель гена thrC методом общей трансдукции с использованием бактериофага Р1, выращенного на клетках природного штамма Е.coli K12 (VKPM B-7). В результате был получен штамм, ауксотроф по L-изолейцину, VL334 thrC⁺ (VKPM В-8961). Этот штамм обладает способностью к продукции L-глутаминовой кислоты.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-глутаминовой кислоты, включают глутаматдегидрогеназу, глутаминсинтетазу, глутаматсинтетазу, изоцитратдегидрогеназу, аконитатгидратазу, цитратсинтазу, фосфоенолпируваткарбоксилазу, пируваткарбоксилазу, пируватдегидрогеназу, пируваткиназу, фосфоенолпируватсинтазу, енолазу, фосфоглицеромутазу, фосфоглицераткиназу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, фруктозобифосфатальдолазу, фосфофруктониназу и глюкозофосфатизомеразу.

Примеры штаммов, модифицированных таким образом, что усилена экспрессия гена цитратсинтетазы, гена фосфоенолпируваткарбоксилазы и/или гена глутаматдегидрогеназы, включают описанные в европейских заявках ЕР 1078989 А, ЕР 955368 А и ЕР 952221 А.

Примеры родительских штаммов для получения продуцирующих L-глутаминовую кислоту бактерий, согласно настоящему исследованию, также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют синтез отличных от L-глутаминовой кислоты соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают изоцитратлиазу, α-кетоглутаратдегидрогеназу, фосфотрансацетилазу, ацетаткиназу, синтазу ацетогидроксикислот, ацетолактатсинтазу, форматацетилтрансферазу, лактатдегидрогеназу и глутаматдекарбоксилазу. Бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, лишенные активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или обладающие сниженной активностью α-кетоглутаратдегидрогеназы и способы их получения описаны в патентах США 5,378,616 и 5,573,945. Конкретно, примеры таких штаммов включают в себя следующие штаммы:

E.coli W3110sucA::Km^R

Е.coli AJ12624 (FERM ВР-3853)

Е.coli AJ12628 (FERM BP-3854)

Е.coli AJ12949 (FERM BP-4881)

Е.coli W3110sucA::Km^R - это штамм, полученный в результате разрушения гена α-кетоглутаратдегидрогеназы (далее называемого "ген sucA") в штамме Е.coli W3110. У этого штамма активность α-кетоглутаратдегидрогеназы отсутствует полностью.

Другие примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя бактерии, принадлежащие к роду Escherichia и обладающие устойчивостью к антиметаболитам аспарагиновой кислоты и дефицитные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, например, штамм AJ13199 (FERM BP-5807) (патент США 5,908,768), или штамм FERM P-12379, дополнительно обладающий низкой активностью по расщеплению L-глутаминовой кислоты (патент США 5,393,671); штамм Е.coli AJ13138 (FERM BP-5565) (патент США 6,110,714) и подобные им.

Примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя мутантные штаммы, принадлежащие к роду Pantoea, которые лишены активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или имеют сниженную активность α-кетоглутаратдегидрогеназы, и могут быть получены описанным выше способом. Примерами таких штаммов являются штамм Pantoea ananatis AJ13356 (патент США 6,331,419), штамм Pantoea ananatis AJ13356, депонированный в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 19 февраля, 1998 и получивший инвентарный номер FERM Р-16645. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 11 января 1999 г., и штамм получил инвентарный номер PERM BP-6615. Штамм Pantoea ananatis AJ13356 не имеет α-KGDH активности в результате разрушения гена αKGDH-E1 субъединицы (sucA). Вышеупомянутый штамм при выделении был идентифицирован как Enterobacter agglomerans и депонирован как штамм Enterobacter agglomerans AJ13356. Тем не менее, позднее он был классифицирован как Pantoea ananatis на основе нуклеотидной последовательности 16S рРНК и других доказательств. Несмотря на то, что штамм AJ13356 был депонирован в указанный выше депозитарий как Enterobacter agglomerans, для целей данного описания он будет упоминаться как Pantoea ananatis.

Бактерия-продуцент L-фенилаланина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-фенилаланина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (ВКМП В-8197); штамм HW1089 (АТСС-55371), содержащий ген pheA34 (патент США 5,354,672); мутантный штамм MWEC101-b (KR8903681); штаммы NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL В-12146 и NRRL В-12147 (патент США 4,407,952) и пободные им. Также в качестве родительских штаммов могут быть использованы бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, - продуценты L-фенилаланина, такие как штамм E.coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHAB] (PERM BP-3566), штамм E.coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), штамм E.coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHA Term] (FERM BP-12662) и штамм E.coli K-12 [W3110(tyrA)/pBR-aroG4, рАСМАВ], названный как AJ12604 (FERM BP-3579) (Европейский патент ЕР 488424 В1). Кроме того, также могут быть использованы бактерии-продуценты L-фенилаланина, принадлежащие к роду Escherichia с повышенной активностью белков, кодируемых геном yedA или геном yddG (патентные заявки США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 А1).

Бактерия-продуцент L-триптофана

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-триптофана, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), лишенные активности триптофанил-тРНК синтетазы, кодируемой мутантным геном trpS (патент США 5,756,345); штамм Е.coli SV164 (pGH5), содержащий аллель гена serA, кодирующего фермент, не ингибируемый серином по типу обратной связи (патент США 6,180,373); штаммы Е.coli AGX17 (pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6 (pGX50)aroP (NRRL В-12264), лишенные активности триптофаназы (патент США 4,371,614); штамм Е.coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps, в котором усилена способность к синтезу фосфоенолпирувата (заявка РСТ WO 9708333, патент США 6,319,696), и подобные им.

Ранее было показано, что природная аллель гена yddG, кодирующего мембранный белок, не участвующий в путях биосинтеза ни одной из L-аминокислот, амплифицированная на многокопийном векторе в микроорганизме, придает этому микроорганизму устойчивость к L-фенилаланину и нескольким аналогам этой аминокислоты. Кроме того, введение в клетки бактерий-продуцентов L-фенилаланина или L-триптофана дополнительных копий гена yddG может положительно влиять на продукцию соответствующих аминокислот (международная заявка РСТ WO 03044192). Таким образом, желательно, чтобы бактерия-продуцент L-триптофана была далее модифицирована таким образом, что в этой бактерии усилена экспрессия открытой рамки считывания yddG.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана, согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых увеличена активность одного или нескольких ферментов, выбранных из группы, состоящей из антранилатсинтазы, фосфоглицератдегидрогеназы, и триптофансинтазы. И антранилатсинтаза, и фосфоглицератдегидрогеназа подвержены ингибированию L-триптофаном и L-серином по типу обратной связи, так что в эти ферменты могут быть введены мутации, снижающие чувствительность к ингибированию по типу обратной связи. Специфические примеры штаммов с такой мутацией включают Е.coli SV164, антранилатсинтаза которой не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи, и штамм-трансформант, полученный введением в Е.coli SV164 плазмиды pGH5 (заявка РСТ WO 94/08031), которая содержит мутантный ген serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана, согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которые введен триптофановый оперон, содержащий ген, кодирующий антранилатсинтазу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи (заявка Японии 57-71397 А, заявка Японии 62-244382 А, патент США 4,371,614). Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть придана путем усиления экспрессии гена (из триптофанового оперона), кодирующего триптофансинтазу (trpBA). Триптофансинтаза состоит из двух субъединиц α и β, которые кодируются trpA и trpB соответственно. Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть увеличена усилением экспрессии оперона изоцитратлиазы-малатсинтазы (заявка РСТ WO 2005/103275).

Бактерия-продуцент L-пролина

Примеры бактерий-продуцентов L-пролина, используемых в качестве родительского штамма согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 702ilvA (VKPM В-8012), дефицитного по гену ilvA и способного к продукции L-пролина (Европейский патент ЕР 1172433). Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-пролина. Предпочтительно, примеры таких генов для бактерий-продуцентов L-пролина, включают ген proB, кодирующий глутаматкиназу с десенсибилизированной регуляцией L-пролином по типу обратной связи (патент Германии 3127361). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, экскретирующие L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примерами таких генов являются гены b2682 и b2683 (ygaZH гены) (Европейская патентная заявка ЕР 1239041 А2).

Примеры бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и обладающих способностью к продукции L-пролина, включают следующие штаммы Е.coli: NRRL В-12403 и NRRL В-12404 (патент Великобритании GB 2075056), VKPM В-8012 (патентная заявка РФ 2000124295), плазмидные мутанты, описанные в патенте Германии DE 3127361, плазмидные мутанты, описанные у Bloom F.R. et al (The 15^th Miami winter symposium, 1983, p.34), и подобные им.

Бактерия-продуцент L-аргинина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 237 (VKPM В-7925) и его производные, содержащие мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм-продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (выложенная патентная заявка Японии 57-5693), и подобные им.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина, согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-аргинина. Примеры ферментов биосинтеза L-аргинина включают N-ацетилглутамилфосфатредуктазу (argC), орнитинацетилтрансферазу (argJ), N-ацетилглутаматкиназу (argB), ацетилорнитинтрансаминазу (argD), орнитинкарбамоилтрансферазу (argF), синтетазу аргининсукциниловой кислоты (argG), тазу аргининсукциниловой кислоты (argH), и карбамоилфосфатсинтетазу (carAB).

Бактерии-продуценты L-валина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий-продуцентов L-валина, согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются штаммами, которые модифицированы таким образом, что экспрессия оперона ilvGMEDA усилена (патент США 5,998,178). Желательно удалить область оперона ilvGMEDA, необходимую для аттенуации, для того, чтобы экспрессия опрерона не снижалась вырабатываемым L-валином. Кроме того, ген ilvA в опероне желательно разрушить для того, чтобы активность треониндезаминазы снизилась.

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий-продуцентов L-валина, согласно настоящему изобретению, включают также мутантные штаммы, имеющие мутацию фермента аминоацил-т-РНК-синтетазы (патент США 5,658,766). К примеру, можно использовать штамм Е.coli VL1970, несущий мутацию в гене ileS, который кодирует фермент изолейцин т-РНК синтетазу. Штамм Е.coli VL1970 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 24 июня 1988 года с инвентарным номером VKPM В-4411.

Кроме того, мутантные штаммы, требующие для своего роста присутствия липоевой кислоты и/или отсутствия Н⁺-АТФ-азы, могут быть также использованы в качестве родительских штаммов (заявка РСТ WO 96/06926).

Бактерии-продуценты L-изолейцина

Примеры родительских штаммов, используемых для выведения бактерий-продуцентов L-валина, согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются штаммами, имеющими мутации устойчивости к 6-диметиламинопурину (патентная заявка Японии JP 5-304969 А), имеющими мутации устойчивости к аналогам изолейцина, таким как тиоизолейцин и гидроксамат изолейцина и мутантными штаммами, имеющими дополнительно устойчивость к DL-этионину и/или гидроксомату аргинина (патентная заявка Японии JP 5-130882 А). Дополнительно, в качестве родительских штаммов могут быть использованы рекомбинантные штаммы, трансформированные генами, кодирующими белки, участвующие в биосинтезе L-изолейцина, такие как треониндеаминаза и ацетогидроксатсинтаза (патентная заявка Японии JP 2-458 А, патент Франции FR 0356739, и патент США 5,998,178).

Способ согласно настоящему изобретению

Оксалоацетат (ОАА) служит в качестве субстрата для реакции, которая приводит к синтезу треонина (Thr) и лизина (Lys). ОАА образуется из фосфоенолпирувата (PEP) в присутствии фосфоенолпируваткарбоксилазы (РЕРС), выступающей в качестве катализатора. Поэтому увеличение концентрации РЕРС в клетке может быть очень важным для ферментативного получения этих аминокислот. При использовании глюкозы в качестве источника углерода в процессе ферментации глюкоза усваивается клеткой через систему глюкозофосфотрансферазы (Glc-PTS). Эта система расходует PEP, а белки в PTS кодируются генами ptsG и ptsHIcrr. В процессе интернализации образуются одна молекула PEP и одна молекула пирувата (Pyr) из одной молекулы глюкозы.

Штаммы-продуценты L-треонина и L-лизина, которые модифицированы таким образом, что приобретают способность усваивать сахарозу (Scr-PTS), обладают более высокой продуктивностью в отношении этих аминокислот при выращивании на сахарозе, чем при выращивании на глюкозе (европейская патентная заявка ЕР 1149911 А2). Полагают, что три молекулы PEP и одна молекула Pyr образуются из одной молекулы сахарозы при участии Scr-PTS, увеличивая таким образом соотношение РЕР/Pyr и поэтому облегчая синтез треонина (Thr) и лизина (Lys) из сахарозы. Кроме того, сообщалось о том, что Glc-PTS регулируется несколькими системами контроля экспрессии (Postma P.W. et al., Microbiol Rev., 57(3), 543-94 (1993); dark В. et al. J. Gen. Microbiol, 96(2), 191-201 (1976); Plumbridge J., Curr. Opin. Microbiol., 5(2), 187-93 (2002); Ryu S. et al,, J. Biol. Chem., 270(6):2489-96 (1995)), и поэтому возможно, что включение глюкозы как таковой может являться стадией, лимитирующей скорость, в процессе получения аминокислоты в ходе ферментации.

Увеличение соотношения РЕР/Pyr в еще большей степени путем усиления экспрессии оперона alsABC в штамме-продуценте треонина, в штамме-продуценте лизина, в штамме-продуценте гистидина, в штамме-продуценте фенилаланина, в штамме-продуценте аргинина, в штамме-продуценте триптофана, и/или в штамме-продуценте глутаминовой кислоты должно еще больше повысить продукцию аминокислоты. Поскольку из двух молекул глюкозы образуется четыре молекулы PEP, ожидается, что соотношение РЕР/Pyr значительно вырастет. В связи с усилением экспрессии оперона alsABC ожидается, что контроль экспрессии glc-PTS ослабнет.

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в культуральной жидкости, и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма, могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и подобные им соединения.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, например при перемешивании культуральной жидкости на качалке, взбалтывании с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30°С до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды можно доводить аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1-го до 5-ти дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.

Примеры

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие неограничивающие настоящее изобретение Примеры.

Пример 1. Конструирование штамма Е.coli с нарушенной системой транспорта PTS.

1. Удаление оперона ptsHI-crr

Штамм, содержащий делецию оперона ptsHI-crr, конструировали с помощью метода, впервые разработанного Datsenko, К.А и Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645) и названного "Red-driven integration". ДНК-фрагмент, содержащий маркер Cm^R, кодируемый геном cat, получали с помощью ПЦР с использованием праймеров P1 (SEQ ID NO:7) и Р2 (SEQ ID NO:8) и плазмиды pMW118-attL-Cm-attR в качестве матрицы (заявка по РСТ WO 05/010175). Праймер Р1 содержит как область, комплементарную области из 36 нуклеотидов, локализованной на 5' конце оперона ptsHI-crr, так и область, комплементарную 24-м нуклеотидам области attL. Праймер Р2 содержит как область, комплементарную области из 36 нуклеотидов, локализованной на 3' конце оперона ptsHI-crr, так и область, комплементарную 24-м нуклеотидам области attR. Использовался следующий температурный профиль для проверки с помощью ПЦР: денатурация при 95°С в течение 3-х мин; профиль для 2-х первых циклов: 1 мин при 95°С, 30 сек при 50°С, 40 сек при 72°С; профиль для последних 25-ти циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 54°С, 40 сек при 72°С; заключительный шаг: 5 мин при 72°С.

Полученный продукт ПЦР - фрагмент длиной 1699 п.о. (Фиг.2) очищали в агарозном геле и использовали для электропорации в штамм Е.coli MG1655 (АТСС 700926), содержащий плазмиду pKD46, репликация которой чувствительна к высокой температуре. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45) содержит ДНК-фрагмент фага λ (инвентарный номер последовательности J02459 в базе данных GenBank) длиной 2,154 нуклеотида (31088-33241), а также содержит гены λ Red гомологичной системы рекомбинации (γ, β, ехо гены) под контролем промотора P_araB, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655,

Электрокомпетентные клетки приготавливали следующим образом: ночную культуру штамма Е.coli MG1655/pKD46 выращивали при 30°С в LB среде, содержащей ампициллин (100 мг/л), разводили в 100 раз при помощи 5 мл среды SOB (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), содержащей ампициллин и L-арабинозу (1 мМ). Полученную культуру выращивали с аэрацией при 30°С до достижения ею значений оптической плотности OD₆₀₀≈0.6, после чего делали клетки электрокомпетентными путем концентрирования их в 100 раз и трехкратной отмывки ледяной деионизированной H₂O. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ≈100 нг продукта ПЦР. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим хлорамфеникол в концентрации 30 мкг/мл и выращивали при 37°С для отбора Cm^R рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46, проводили 2 пассажа на L-агаре с Cm при 42°С и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину.

2. Подтверждение делении оперона ptsHI-crr с помощью ПЦР

Мутант с делегированным опероном ptsHI-crr, содержащий ген устойчивости к Cm проверяли с помощью ПЦР. Локус-специфические праймеры Р3 (SEQ ID NO:9) и Р4 (SEQ ID NO:10) использовались для проверки делении с помощью ПЦР, Использовался следующий температурный профиль для проверки с помощью ПЦР: денатурация при 94°С в течение 3-х мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 94°С, 30 сек при 54°С, 1 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма ptsHI-crr ⁺MG1655, составила ~3.0 тыс. п.о. (Фиг.3). Мутантный штамм назвали MG1655 Δ ptsHI-crr::cat.

3. Удаление гена устойчивости к хлорамфиниколу Cm (cat gene) из хромосомы штаммов Е.coli MG1655-Δ ptsHI-crr::cat

Ген устойчивости Cm (ген cat) удаляли из хромосомы штамма MG1655 Δ ptsHI-crr::cat с помощью системы int-xis. Для этой цели штамм Е.coli MG1655 ΔptsHI-crr::cat трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (заявка РСТ WO 05/010175). Трансформированные клоны отбирали на LB-среде, содержащей ампицилин в концентрации 100 мкг/мл. Клетки инкубировали при 30°С в течение ночи. Трансформированные клоны освобождали от гена cat путем выращивания отдельных колоний при 37°С (при этой температуре репрессор Cits в некоторой мере инактивируется, тогда как гены int/xis активируются) с последующей селекцией вариантов Cm^SАр^R. Удаление гена cat из хромосомы штаммов подтверждали при помощи ПЦР. Локус-специфичные праймеры Р3 (SEQ ID NO:9) и Р4 (SEQ ID NO:10) использовали для такого подтверждения путем ПЦР. Условия проведения ПЦР были такими же, как описано выше. Продукт ПЦР, полученный в случае использования в качестве матрицы клеток с удаленным геном cat, составил в длину ~0,4 тыс.п.о. Так получали штамм-продуцент L-аминокислот с инактивированным опероном ptsHI-crr, из которого удален ген cat. Этот штамм назвали MG1655 Δ ptsHI-crr.

Пример 2. Замена природного промотора оперона alsABC на гибридный промотор P_L-tac в Е.coli.

Для замены природного промотора оперона alsABC, ДНК-фрагмент, содержащий гибридный промотор P_L-tac и маркер устойчивости к хлорамфениколу (Cm^R), кодируемый геном cat, вставляли в хромосому штамма Е.coli MG1655 ΔptsHI-crr взамен природного промотора при помощи метода, описанного Datsenko К.A. and Wanner B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:6640-6645) и получившего название "Red-опосредованной интеграции" и/или "Red-зависимой интеграции", что также описано в Примере 1.

Гибридный промотор получали методом ПЦР с использованием хромосомной ДНК штамма Е.coli В-3996Р_L-tacxylE (заявка РСТ WO 2006043730) в качестве матрицы и праймеров Р5 (SEQ ID NO 11 и P6 (SEQ ID NO:12). Условия проведения ПЦР описаны в Примере 1.

Амплифицированный ДНК-фрагмент очищали при помощи электрофореза в агарозном геле, экстрагировали с использованием колонок "GenElute Spin Columns" ("Sigma", США) и переосаждали с помощью этанола. Полученный ДНК-фрагмент использовали для электропорации и Red-опосредованной интеграции в хромосому штамма Е.coli MG1655 ΔptsHI-crr/pKD46, как описано в Примере 1.

Колонии выращивали в течение 24 часов и затем тестировали на наличие маркера Cm^R вместо природного промотора оперона alsABC при помощи ПЦР с использованием праймеров Р7 (SEQ ID NO:13) и Р8 (SEQ ID NO:14). Для этого колонию суспендировали в воде (20 мкл) и полученную суспензию (1 мкл) использовали для ПЦР. Условия проведения ПЦР описаны в Примере 1. Несколько тестированных Cm^R-колоний содержали искомый ДНК-фрагмент размером ~2.1 тыс. п.о., что подтвердило присутствие гибридного промотора P_L-tac и маркера Cm^R вместо природного промотора оперона alsABC размером ~0.3 тыс. п.о. (Фиг.3). Один из полученных штаммов освобождали от термочувствительной плазмиды pKD46 путем культивирования при 37°С, в результате чего получали штамм Е.coli MG1655 ΔptsHI-crr P_L-tacalsABC.

Способность к росту на минимальной среде, содержащей глюкозу (4%) в качестве источника углерода, проверяли для трех штаммов Е.coli: MG1655, MG1655ΔptsHI-crr, MG1655ΔptsHI-crr P_L-tacalsABC. Как следует из Фиг.4, штамм Е.coli MG1655ΔptsHI-crr обладал низкой скоростью роста (µ~0.06) на минимальной среде Адаме, содержащей глюкозу. Усиление экспрессии оперона alsABC значительно улучшало ростовые характеристики реципиентных штаммов на минимальной среде Адамс, содержащей глюкозу.

Пример 3. Влияние усиленной экспрессии оперона alsABC в штамме Е.coli с нарушенной системой транспорта PTS на продукцию L-треонина

Для того чтобы разрушить транспортную систему PTS в штамме-продуценте треонина Е.coli VKPM В-3996 на хромосоме этого штамма был инактивирован оперон ptsH1-crr. Для этой цели ДНК-фрагменты из хромосомы вышеописанного штамма Е.coli MG1655 ΔptsHI-crr::cat переносили в штамм Е.coli VKPM В-3996 с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab, Press, 1972, Plainview, NY), чтобы получить штамм В-3996-Δ ptsHI-crr::cat.

Мутанты с удаленным опероном ptsHI-crr, промаркированные геном устойчивости Cm, проверяли с помощью ПЦР. Локус-специфические праймеры Р3 (SEQ ID NO:9) и Р4 (SEQ ID NO:10) использовали в ПЦР для этой проверки. Условия для проверки с помощью ПЦР описаны выше. Продукт ПЦР, полученный в реакции, где в качестве матрицы использовали родительский штамм ptsHI-crr⁺ В-3996, имел в длину ~3.0 тыс. п.о. Продукт ПЦР, полученный в реакции с использованием в качестве матрицы мутантного штамма В-3996 Δ ptsHI-crr::cat имел в длину ~2.0 тыс. п.о. (Фиг.2).

Ген устойчивости Cm (ген cat) удаляли из хромосомы штамма Е.coli В-3996 ΔptsHI-crr::cat с помощью системы int-xis. Для этой цели штамм Е.coli В-3996 ΔptsHI-crr::cat трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (заявка РСТ WO 05/010175).

Трансформированные клоны отбирали на LB-среде, содержащей ампицилин в концентрации 100 мкг/мл. Клетки инкубировали при 30°С в течение ночи. Трансформированные клоны освобождали от гена cat путем выращивания отдельных колоний при 37°С (при этой температуре репрессор CIts в некоторой мере инактивируется, тогда как гены int/xis активируются) с последующей селекцией вариантов Cm^SАр^R. Удаление гена cat из хромосомы штаммов подтверждали при помощи ПЦР. Локус-специфичные праймеры Р3 (SEQ ID NO:9) и Р4 (SEQ ID NO:10) использовали для такого подтверждения путем ПЦР. Условия проведения ПЦР были такими же, как описано выше. Продукт ПЦР, полученный в случае использования в качестве матрицы клеток с удаленным геном cat, составил в длину ~0,3 тыс. п.о. Таким образом, получали штамм-продуцент L-треонина с инактивированным опероном ptsHI-crr, из которого был удален ген cat. Этот штамм назвали B-3996 ΔptsHI-crr.

Для усиления экспрессии оперона alsABC в штамме E.coli B-3996 ΔptsHI-crr природный промотор оперона alsABC заменяли на гибридный промотор Р_L-tac. Для этой цели, ДНК-фрагменты из хромосомы вышеописанного штамма Е.coli MG1655 ΔptsHI-crr P_L-tac alsABC переносили в штамм Е.coli B-3996 ΔptsHI-crr с помощью Р1 трансдукции (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1972, Plainview, NY) чтобы получить штамм Е.coli В-3996-Δ ptsHI-crr Р_L-tac alsABC.

Удаление оперона ptsHI-crr в штамме Е.coli B-3996-ΔptsHI-crr P_L-tacalsAB проверяли с помощью ПЦР. Локус-специфические праймеры Р3 (SEQ ID NO:9) и Р4 (SEQ ID NO:10) использовали в ПЦР для проверки. Условия ПЦР для проверки описаны выше. Продукт ПЦР, полученный в реакции, где в качестве матрицы использовался штамм B-3996-ΔptsHI-crr P_L-tacalsAB, составил в длину ~0.3 тыс. п.о.

Замена природного промотора оперона alsABC на гибридный промотор Р_L-tac и маркер Cm^R в штамме Е.coli B-3996-ΔptsHI-crr Р_L-tac alsABC проверяли с помощью ПЦР. Локус-специфические праймеры Р7 (SEQ ID NO:13) и Р8 (SEQ ID NO:14) использовали в ПЦР для проверки. Условия этой ПЦР приведены выше. Продукт ПЦР, полученный в реакции, где в качестве матрицы использовался штамм B-3996-ΔptsHI-crr P_L-tacalsABC имел в длину ~2.1 тыс. п.о.

Затем штаммы Е.coli B-3996, B-3996-ΔptsHI-crr и B-3996-ΔptsHI-crr P_L-tacalsABC каждый выращивали при температуре 37°С в течение 18-ти часов в питательном бульоне и затем 0.3 мл каждой из полученных культур инокулировали в 3 мл среды для ферментации следующего состава в пробирки размером 20×200 мм и культивировали при температуре 37°С в течение 72 часов на роторной качалке.

После выращивания количество накопленного в среде L-треонина определяли с помощью бумажной хроматографии, с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол: уксусная кислота: вода=4:1:1 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне использовали для визуализации. Пятно, содержащее L-треонин, вырезали; L-треонин элюировали 0.5% водным раствором CdCl₂, после чего количество L-треонина оценивали спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм. Результаты пяти независимых пробирочных ферментации приведены в Таблице 1.

Использовали ферментационную среду следующего состава (г/л):

Глюкоза 80.0 (NH₄)₂SO₄ 22.0 K₂HPO₄ 2.0 MgSO₄·7H₂O 0.8 MnSO₄·5H₂O 0,02 FeSO₄·7H₂O 0.02 Тиамин 0.002 Дрожжевой экстракт 1.0 СаСО₃ 30.0

MgSO₄·7H₂O и СаСО₃ стерилизовали раздельно.

Как следует из Таблицы 1, штамм B-3996-ΔptsHI-crr P_L-tacalsABC накапливал большее количество L-треонина по сравнению со штаммом В-3996.

Пример 4. Продукция L-лизина штаммом Е.coli AJ11442-P_L-tacalsABC

Для оценки влияния усиления экспрессии оперона alsABC на продукцию лизина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655-ΔptsHI-crr P_L-tacalsAB могут быть перенесены в штамм-продуцент L-лизина Е.coli AJ11442 с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab, Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм AJ11442-P_L-tacalsABC.

Оба штамма Е.coli, AJ11442 и AJ11442-P_L-tacalsABC, могут быть выращены в L-среде при 37°С; и по 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 20 мл ферментационной среды, содержащей необходимые антибиотики, в колбы объемом 500 мл. Культивирование может производиться при 37°С в течение 16 часов с использованием возвратно-поступательной качалки со скоростью перемешивания 115 об/мин. После выращивания количество L-лизина и остаточной глюкозы в среде может быть измерено известным способом (Biotech-analyzer AS210, производитель - Sakura Seiki Co.). Затем для каждого из штаммов может быть рассчитан выход L-лизина в пересчете на потребленную глюкозу.

Может быть использована ферментационная среда следующего состава (г/л):

Глюкоза 40 (NH₄)₂SO₄ 24 К₂HPO₄ 1.0 MgSO₄·7H₂O 1.0 FeSO₄·7H₂O 0.01 MnSo₄·5H₂O 0.01 Дрожжевой экстракт 2.0

рН доводят до 7.0 с помощью КОН, и среду автоклавируют при 115°С в течение 10 мин. Глюкозу и MgSO₄ 7H₂O стерилизуют раздельно. Также добавляют СаСО₃ до концентрации 30 г/л, предварительно простерилизованного сухим жаром при 180°С в течение 2 часов.

Пример 5. Продукция L-цистеина штаммом Е.coli JM15(ydeD)P_L-tacalsABC

Для оценки влияния усиления экспрессии оперона alsABC на продукцию L-цистеина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655-ΔptsHI-crr Р_L-tac alsABC могут быть перенесены в штамм-продуцент L-цистеина Е.coli JM15(ydeD) с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм JM15(ydeD)-P_L-tac alsABC.

Штамм Е.coli JM15(ydeD) является производным штамма Е.coli JM15 (патент США 6,218,168), который может быть трансформирован ДНК, содержащей ген ydeD, кодирующий мембранный белок, не вовлеченный в пути биосинтеза ни одной из L-аминокислот (патент США 5,972,663). Штамм JM15 (CGSC# 5042) может быть получен из генетической коллекции университета города Нью Хавен в США (The Е.coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, USA), (http://cgsc.biology.yale.edu/).

Условия ферментации для оценки продукции L-цистеина детально описаны в Примере 6 патента США 6,218,168.

Пример 6. Продукция L-лейцина штаммом Е.coli 57-P_L-tacalsABC

Для оценки влияния усиления экспрессии оперона alsABC на продукцию L-лейцина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655-ΔptsHI-crr P_L-tacalsABC могут быть перенесены в штамм-продуцент L-лейцина Е.coli 57 (VKPM В-7386, патент США 6,124,121) с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм 57-P_L-tacalsABC. Штамм 57 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 19 мая 1997 года с инвентарным номером VKPM В-7386.

Оба штамма Е.coli, 57 и 57-P_L-tacalsABC могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры указанные штаммы могут быть выращены на роторной качалке (250 об/мин) при 32°С в течение 18 часов в пробирках размером 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% сахарозы. Затем в ферментационную среду может быть внесено по 0.21 мл (10%) посевной культуры. Ферментацию можно проводить в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках размером 20×200 мм. Клетки могут быть выращены в течение 48-72 часов при 32°C с перемешиванием (250 об/мин). Количество L-лейцина может быть измерено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол - уксусная кислота - вода=4:1:1).

Может быть использована ферментационная среда (рН 7.2) следующего состава (г/л):

Глюкоза 60.0 (NH₄)₂SO₄ 25.0 К₂HPO₄ 2.0 MgSO₄·H₂O 1.0 Тиамин 0.01 СаСО₃ 25,0

Глюкозу и мел стерилизуют раздельно.

Пример 7. Продукция L-гистидина штаммом Е.coli 80-P_L-tacalsABC

Для оценки влияния усиления экспрессии оперона alsABC на продукцию L-гистидина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655-ΔptsHI-crr P_L-tacalsABC могут быть перенесены в штамм-продуцент L-гистидина Е.coli 80 с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм 80-P_L-tacalsABC. Штамм 80 описан в патенте РФ 2119536 и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 15 октября 1999 года с инвентарным номером VKPM B-7270. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 12 июля 2004 года.

Оба штамма Е.coli, 80 и 80-P_L-tacalsABC могут быть выращены в L-бульоне при 29°С в течение 6 часов. Затем по 0.1 мл полученных культур может быть внесено в 2 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 29°С в течение 65 часов на роторной качалке (350 об/мин). После выращивания количество накопленного в среде гистидина может быть определено с помощью бумажной хроматографии. Может быть использована подвижная фаза следующего состава: п-бутанол - уксусная кислота - вода=4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (0.5%) в ацетоне может быть использован для визуализации.

Может быть использована ферментационная среда (рН 6.0) следующего состава (г/л):

Глюкоза 100.0 Мамено (гидролизат соевых бобов) 0.2 общего азота L-пролин 1.0 (NH₄)₂SO₄ 25.0 KH₂PO₄ 2.0 MgSO₄·7H₂O 1.0 FeSO₄·7H₂O 0.01 MnSO₄ 0.01 Тиамин 0.001 Бетаин 2.0 СаСО₃ 60.0

Глюкозу, пролин, бетаин и СаСО₃ стерилизуют раздельно. рН доводят до 6.0 перед стерилизацией.

Пример 8. Продукция L-глутаминовой кислоты штаммом Е.coli VL334thrC⁺-P_L-tac alsABC

Для оценки влияния усиления экспрессии оперона alsABC на продукцию L-глутаминовой кислоты ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655-ΔptsHI-crr Р_L-tac alsABC могут быть перенесены в штамм-продуцент L-глутаминовой кислоты Е. VL334thrC⁺ (ЕР 1172433) с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм VL334thrC⁺-P_L-tac alsABC. Штамм VL334thrC⁺ был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 6 декабря 2004 года с инвентарным номером VKPM В-8961. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 8 декабря 2004 года.

Оба штамма, VL334thrC⁺ и VL334thrC⁺-P_L-tacalsABC, могут быть выращены на чашках с L-агаром при 37°С в течение 18-24 часов. Далее, одна петля клеток может быть перенесена в пробирки, содержащие 2 мл ферментационной среды. Ферментационная среда может содержать глюкозу - 60 г/л, сульфат аммония - 25 г/л, KH₂PO₄ - 2 г/л, MgSO₄ - 1 г/л, тиамин - 0.1 мг/мл, L-изолейцин - 70 мкг/мл и СаСО₃ - 25 г/л (рН 7.2). Глюкозу и мел стерилизуют раздельно. Выращивание может производиться при 30°С в течение 3 дней с перемешиванием. После выращивания количество полученной L-глутаминовой кислоты может быть определено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол - уксусная кислота - вода=4:1:1) с последующим окрашиванием нингидрином (1% раствор в ацетоне) и дальнейшим элюированием полученных соединений в 50% этаноле с 0.5% CdCl₂.

Пример 9. Продукция L-фенилаланина штаммом Е.coli AJ12739-P_L-tac alsABC

Для оценки влияния усиления экспрессии оперона alsABC на продукцию L-фенилаланина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655-ΔptsHI-crr P_L-tacalsABC могут быть перенесены в штамм-продуцент L-фенилаланина Е.coli AJ12739 с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм AJ12739-P_L-tacalsABC. Штамм AJ12739 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1^й Дорожный проезд, 1) 6 ноября 2001 года с инвентарным номером VKPM B-8197. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 23 августа 2002 года.

Оба штамма, AJ12739-P_L-tacalsABC и AJ12739, могут быть выращены при 37°С в течение 18 часов в питательном бульоне; по 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке. По окончании ферментации количество накопленного в среде фенилаланина может быть определено с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), Для этой цели могут быть использованы ТСХ-пластинки размером 10×15 см, покрытые 0.11 мм-слоем силикагеля Сорбфил без флуоресцентного индикатора (Акционерное Общество Сорбполимер, Краснодар, Россия). Пластинки Сорбфил могут быть экспонированы в подвижной фазе следующего состава: пропан-2-ол: этилацетат: 25% водного аммиака: вода=40:40:7:16 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации.

Может быть использована ферментационная среда следующего состава (г/л):

Глюкоза 40.0 (NH₄)₂SO₄ 16.0 K₂HPO₄ 0.1 MgSO₄·7H₂O 1.0 FeSO₄·5Н₂О 0.01 MnSO₄·5H₂O 0.01 Тиамин 0.0002 Дрожжевой экстракт 2.0 Тирозин 0.125 СаСО₃ 20.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизуют раздельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.

Пример 10. Продукция L-триптофана штаммом Е.coli SV164 (pGH5)-P_L-tac alsABC

Для оценки влияния усиления экспрессии оперона alsABC на продукцию L-триптофана ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655-ΔptsHI-crr P_L-tac alsABC могут быть перенесены в штамм-продуцент L-триптофана Е. coli SV164 (pGH5) с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм SV164(pGH5)-P_L-tac alsABC. Штамм SV164 (pGH5) подробно описан в патенте США 6,180,373 или Европейском патенте ЕР 0662143.

Оба штамма, SV164(pGH5)-P_L-tacalsABC и SV164(pGH5), могут быть выращены с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона с добавлением тетрациклина (маркера плазмиды pGH5, 20 мг/мл). По 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды, содержащей тетрациклин (20 мг/мл), в пробирках размером 20×200 мм; и культуры могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке при 250 об/мин. После выращивания количество накопленного в среде триптофана может быть определено с помощью ТСХ, как описано в Примере 10.

Компоненты ферментационной среды, которая может быть использована, представлены в Таблице 2; группы компонентов А, В, С, D, Е, F и Н стерилизуют раздельно, как и показано в Таблице 2, чтобы избежать нежелательных взаимодействий во время стерилизации.

Пример 11. Продукция L-пролина штаммом Е.coli 702ilvA-P_L-tacalsABC

Для оценки влияния усиления экспрессии оперона alsABC на продукцию L-пролина ДНК-фрагменты из хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655-ΔptsHI-crr Р_L-tac alsABC могут быть перенесены в штамм-продуцент L-пролина Е.coli 702ilvA с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм 702ilvA-P_L-tac alsABC. Штамм 702ilvA депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1^й Дорожный проезд, 1) 18 июля 2000 года с инвентарным номером VKPM В-8012. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 18 мая 2001 года.

Оба штамма Е.coli, 702ilvA и 702ilvAP_L-tacalsABC, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Затем ферментация с использованием этих штаммов может производиться в тех же условиях, как описано в Примере 8.

Пример 12. Продукция L-аргинина штаммом Е.coli 382-Р_L-tac alsABC

Для оценки влияния усиления экспрессии оперона alsABC на продукцию L-аргинина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655-ΔptsHI-crr P_L-tac alsABC могут быть перенесены в штамм-продуцент L-аргинина Е.coli 382 с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм 382 -Р_L-tac alsABC. Штамм 382 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1^й Дорожный проезд, 1) 10 апреля 2000 года с инвентарным номером VKPM B-7926. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 18 мая 2001 года.

Оба штамма, 382-Р_L-tac alsABC и 382, могут быть выращены с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона; по 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 2 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 32°С в течение 48 часов на роторной качалке.

После выращивания количество накопленного в среде L-аргинина может быть определено с помощью бумажной хроматографии, при этом может быть использован следующий состав подвижной фазы: бутанол: уксусная кислота: вода=4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (2%) в ацетоне может быть использован для визуализации. Пятно, содержащее L-аргинин, может быть вырезано; L-аргинин может быть элюирован 0.5% водным раствором CdCl₂, после чего количество L-аргинина может быть определено спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм.

Может быть использована ферментационная среда следующего состава (г/л):

Глюкоза 48.0 (NH₄)₂SO₄ 35.0 КН₂PO₄ 2.0 MgSO₄·7H₂O 1.0 Тиамин 0.0002 Дрожжевой экстракт 1.0 L-изолейцин 0.1 СаСО₃ 5.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизуют раздельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения. Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.

Таблица 1 Влияние P_L-tacalsABC на продукцию треонина штаммом B3996ΔptsHI-crr в пробирках Штамм 48 часов 72 часа OD₅₄₀ Треонин, г/л OD₅₄₀ Треонин, г/л B3996ΔptsHI-crr 0.53±0.01 следы 0.72±0.01 следы B3996ΔptsHI-crr P_L-tacalsABC 4.4±0.2 0.5±0.1 6.2±0.1 1.4±0.1

Таблица 2 Группы Компонент Конечная концентрация, г/л А КН₂PO₄ 1.5   NaCl 0.5   (NH₄)₂SO₄ 1.5   L-Метионин 0.05   L-Фенилаланин 0.1   L-Тирозин 0.1   Мамено (общий азот) 0,07 В Глюкоза 40.0   MgSO₄·7H₂O 0.3 С CaCl₂ 0.011 D FeSO₄·7H₂O 0.075   Цитрат натрия 1.0 Е Na₂MoO₄·2H₂O 0.00015   Н₃ВО₃ 0.0025   CoCl₂·6H₂O 0.00007   CuSO₄·5H₂O 0.00025   MnCl₂·4H₂O 0.0016   ZnSO₄·7H₂O 0.0003 F Тиамин 0.005 G СаСО₃ 30.0 Н Пиридоксин 0.03 Группа А имеет рН 7.1, который доводится аммиаком. Каждая группа стерилизуется раздельно.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения L-треонина путем ферментации глюкозы с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, которая модифицирована таким образом, что в указанной бактерии увеличена активность высокоаффинного переносчика D-аллозы, кодируемого опероном alsABC. Изобретение позволяет получать L-треонин с высокой степенью эффективности. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл.

1. Бактерия-продуцент L-треонина, принадлежащая к роду Escherichia, модифицированная таким образом, что в указанной бактерии усилена экспрессия оперона alsABC.

2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что в указанной бактерии экспрессия оперона alsABC усилена путем модификации последовательности, контролирующей экспрессию оперона alsABC, таким образом, что экспрессия гена усилена, или путем увеличения количества копий оперона alsABC.

3. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанный оперон кодирует:
(A) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, или его вариант;
(Б) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, или его вариант;
(B) белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, или его вариант;
отличающийся тем, что в случае, когда указанные варианты присутствуют в указанном опероне, такие варианты обладают активностью высокоаффинного переносчика D-аллозы, когда указанные варианты объединяются вместе.

4. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанный оперон включает:
(А) фрагмент ДНК, включающий последовательность нуклеотидов с номерами нуклеотидов с 1 по 936 в SEQ ID NO:1, или фрагмент ДНК, способный гибридизоваться в жестких условиях с указанной последовательностью, или зондом, синтезированным на основе указанной последовательности;
(Б) фрагмент ДНК, включающий последовательность нуклеотидов с номерами нуклеотидов с 1 по 1533 в SEQ ID NO:3, или фрагмент ДНК, способный гибридизоваться в жестких условиях с указанной последовательностью, или зондом, синтезированным на основе указанной последовательности;
(В) фрагмент ДНК, включающий последовательность нуклеотидов с номерами нуклеотидов с 1 по 981 в SEQ ID NO:5, или фрагмент ДНК, способный гибридизоваться в жестких условиях с указанной последовательностью, или зондом, синтезированным на основе указанной последовательности, и отличающийся тем, что в случае, когда в указанном опероне присутствуют указанные фрагменты ДНК, которые гибридизуются с указанными последовательностями или с указанными зондами, такие фрагменты ДНК кодируют белки, обладающие активностью высокоаффинного переносчика D-аллозы, когда указанные белки объединяются вместе.

5. Бактерия по п.4, отличающаяся тем, что указанными жесткими условиями включаются такие условия, при которых отмывка производится при температуре 60°С при концентрации соли 1×SSC и 0,1% SDS в течение приблизительно 15 мин.

6. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что в ней усилена активность глюкокиназы.

7. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что в ней усилена активность изомеразы ксилозы.

8. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что усилена экспрессия гена, выбранного из группы, состоящей из мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи; гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу; гена thrC, кодирующего треонинсинтазу; гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок; гена asd, кодирующего аспартат-р-семиальдегиддегидрогеназу; гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу); и комбинации этих генов.

9. Бактерия по п.8, отличающаяся тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что усилена экспрессия указанного мутантного гена thrA, указанного гена thrB, указанного гена thrC и указанного гена rhtA.

10. Способ получения L-треонина, включающий выращивание бактерии по п.1 в питательной среде, содержащей глюкозу в качестве источника углерода, и выделение L-треонина из культуральной жидкости.