ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАТУСА БЕРЕМЕННОСТИ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/48 G01N33/53 G01N33/68 

Область изобретения

Изобретение относится к способам, позволяющим установить беременность у животных. В частности, изобретение относится к способам выявления беременности у некопытных, копытных и жвачных животных.

Предпосылки к созданию изобретения

При разведении крупного рогатого скота важным является точное установление статуса беременности у животных, которых подвергают осеменению. В частности, точное и раннее установление неудавшейся беременности животного, которое подвергают осеменению, имеет большое экономическое значение. В настоящее время беременность у животного, которое подвергают осеменению, например коровы, определяют такими способами, как пальпация, которые не дают возможности точно установить статус беременности до 30 дней после осеменения. Поскольку эстральный цикл у крупного рогатого скота составляет приблизительно 21 день, это означает, что при доступных в настоящее время способах имеется по крайней мере одна возможность для осеменения животного, которому не удалось забеременеть, не пропустить период течки непосредственно после неудачного осеменения.

Это имеет важные экономические последствия для промышленного животноводства, особенно для молочной индустрии. Для эффективной продукции молока необходимо, чтобы коров успешно осеменяли, и они становились беременными через 80-100 дней после отела. Однако молочные коровы имеют низкую способность к зачатию при искусственном осеменении, и для успешного осеменения требуется в среднем от 2,5 до 3 осеменений на зачатие. Поэтому до сих пор существует значительная потребность в способе, с помощью которого фермер на молочной ферме сможет точно определить, что животное не является беременным, чтобы не упустить возможности вновь осеменить животное в следующий период течки после неудавшегося осеменения.

Sasser в патенте США №4705748, включенном в текст посредством ссылки, раскрывает способ определения беременности путем обнаружения белка, продуцируемого оплодотворенным яйцом. Посредством данного способа устанавливают, что коровы являются беременными уже на 27-й день после осеменения. У Sasser не описана возможность диагностики беременности до начала последующего периода течки у небеременных коров и не описана ранняя диагностика отсутствия беременности.

Механизм «материнского» распознавания беременности у копытных животных включает в себя локальную и системную генную регуляцию, осуществляемую оплодотворенным яйцом, которая приводит к снижению или изменению выработки лютеолитического сигнала, простагландина F2α ((PGF2α); Yankey et al., Expression of the antiviral protein Mx in peripheral blood mononuclear cells of pregnant and bred, non-pregnant ewes. Journal of Endocrinology 170, R7-R11 (2001); Bazer et al., Regulation of endometrial responsiveness to estrogen and progesterone by pregnancy recognition signals during the peri-implantation period. In Molecular and Cellular Aspects of Peri-implantation Processes, pp.27-47. Ed. S.K.Dey. Springer-Verlag, New York, Inc. (1995)). Механизм распознавания беременности у копытных животных отличается от механизма распознавания у приматов, который включает в себя прямое лютеотропное действие на желтое тело (CL) хорионического гонадотропина, производимого оплодотворенным яйцом (Bazer et al., 1995). Сигналом для «материнского» распознавания беременности у копытных животных служит секреция оплодотворенным яйцом интерферона-тау (IFNτ) в течение второй и третьей недели беременности (Bazer et al., 1995; Godkin et al., J.Reprod. Fert. 65:141-150 (1982)). IFNτ препятствует увеличению уровней рецепторов эстрогена и окситоцина в эндометрии, при этом индуцируемые окситоцином лютеолитические импульсы PGF2α не возникают, и сохраняется функция CL (Spencer et al., Endocrinology 136:4932-4944 (1995)).

IFNτ является членом семейства интерферона типа I, которое также включает IFN α, β и ω (Samuel, Virology 183:1-11 (1991)), и совсем недавно обнаружен интерферон δ (Lefevre, F., et al., Biochimie 80:779-788 (1998)). IFNτ передает сигналы через рецептор интерферона типа I и сигнальный трансдуктор янус-киназы (JAK) и активатор пути поступления сигнала транскрипции (STAT) (Stewart et al., Endocrinology 142:98-107 (2001)), при этом он индуцирует ряд генов в матке овцы, включая 2',5'-олигоаденилатсинтетазу (Johnson et al., Biol. Reprod. 64:1392-1399 (2001)), β2-микроглобулин (Vallet et al., J. Endocrin. 130:R1-4 (1991)), регуляторный фактор 1 интерферона (IFN) (Spencer et al., 1998), белок, реагирующий с убиквитином (Johnson et al., Biol. Reprod. 62:622-627 (2000)), и белок Mx (Charleston and Stewart, Gene 137:327-331 (1993); Ott et al., Biol. Reprod. 59:784-794 (1998)). В то время как участие большинства из указанных белков в антивирусном ответе доказано и хорошо охарактеризовано, роли, которые указанные белки играют при беременности на ранних сроках, не выяснены.

Белки Mx являются мономерными GTPазами, которые, в зависимости от вида животного и типа вируса, являются потенциальными ингибиторами вирусной репликации (Samuel, Virology 183:1-11 (1991)). Последовательности Mx-белков, выделенных из различных видов, включая овец, коров, свиней и лошадей, находятся в открытом доступе банка генов и получили инвентарные номера в указанном банке генов Х66093, U88329, M65087 и U55216 соответственно. Хотя антивирусное действие Mx-белков в основном направлено против РНК-вирусов с отрицательной цепью (например, ортомиксовирусы), их экспрессия индуцируется во всех клетках, которые имеют рецепторы интерферона типа I, и используется для того, чтобы можно было различать между бактериальной и вирусной инфекциями (Haller et al., Rev. Sci. Tech. 17:220-230 (1998)). В последнее время было показано, что уровень белка Мх и его мРНК повышается от эпителия (на 13-й день) к миометрию (на 15-й день) в стенке матки беременных овец, и уровни остаются повышенными на 25-й день (Ott et al., Biol. Reprod. 59:784-794 (1998)). Кроме того, уровни мРНК белка Мх повышаются в желтом теле в ответ на введение интерферона roIFNτ в полость матки (Spencer et al., Biol. Reprod. 61:464-470 (1999)).

Полученные результаты указывают, что интерферон IFNτ либо 1) действует непосредственно на все типы клеток матки (т.е., эпителиальные, стромальные и миометриальные) и на желтое тело CL, либо 2) индуцирует вещества (цитокины), которые проявляют паракринное/эндокринное действие на клетки матки и другие органы, включая яичники, либо 3) воздействует на компоненты слизистой матки и на циркулирующую иммунную систему, которая, в свою очередь, воздействует на различные клетки матки и желтое тело CL.

Однако измерение уровня Мх-белка в ткани матки в качестве теста на беременность невозможно осуществить. Кроме того, разрушение тканей матки, необходимое для определения уровней белка Мх в матке, носит деструктивный характер и требует затрат времени и труда и при этом оказывает неблагоприятное воздействие на беременность.

Таким образом, нужен надежный, воспроизводимый и недеструктивный способ определения наличия беременности или отсутствия беременности у домашнего крупного рогатого скота.

Краткое описание сущности изобретения

Было обнаружено, что экспрессия генов, кодирующих некоторые белки, которые здесь называют «белками, индуцируемыми при беременности», включая 2',5'-олигоаденилатсинтетазу, β2-микроглобулин, регуляторный фактор 1 интерферона, белок, перекрестно реагирующий с убиквитином (также названный «генным фактором 17, стимулируемым интерфероном ("ISG-17")), и Мх-белок, увеличивается в значительной степени у определенных животных в течение первого месяца беременности. Также было обнаружено, что увеличения экспрессии индуцируемых при беременности белков не происходит у животных, у которых беременность отсутствует.

У многих животных увеличение экспрессии индуцируемых при беременности белков происходит в результате секреции эмбрионом гормона, интерферона типа I, который служит сигналом наличия эмбриона, передаваемым от эмбриона к матери, также называемым сигналом для «материнского» распознавания беременности. Различные интерфероны типа I, включающие интерферон альфа (IFNα), интерферон бета (IFNβ), интерферон омега (IFNω), интерферон дельта (IFNδ) и интерферон тау (IFNτ), секретируются эмбрионами различных видов. Например, IFNτ секретируется как гормон распознавания беременности у жвачных животных и IFNδ секретируется у свиньи. Хотя индуцируемый при беременности белок Мх и определяется в матке других видов животных, таких как лошади и другие представители семейства лошадиных, в ранние сроки беременности, секреция интерферона типа I оплодотворенным яйцом лошади до настоящего времени не была обнаружена. Скорее всего, у лошадей и других видов, у которых оплодотворенные яйца не продуцируют интерферон типа I, матка, возможно, продуцирует интерферон типа I в ответ на наличие эмбриона.

В одном аспекте изобретение представляет собой способ определения беременности у животных. Согласно данному аспекту изобретения, определяют уровень экспрессии индуцируемого при беременности белка в ранние сроки беременности, и полученные результаты сравнивают с уровнем экспрессии такого индуцируемого при беременности белка в такой же период времени у небеременной самки того же вида. Предпочтительно, когда индуцируемый при беременности белок, который определяют и сравнивают, является белком, индуцируемым интерфероном типа I. Более предпочтительно, когда индуцируемый при беременности белок является белком Мх или белком ISG-17.

Употребляемый в тексте термин «индуцируемый при беременности белок» относится к белку, который экспрессируется на основе материнского гена, и указанная экспрессия индуцируется в ответ на наличие беременности. Индуцируемый при беременности белок отличается от белка, который продуцируется оплодотворенным яйцом, если только такой белок также не экспрессируется на основе материнского гена и указанная экспрессия не индуцируется в ответ на наличие беременности.

Употребляемый в тексте термин «ранняя беременность» относится к такому сроку, в течение которого или по прошествии которого поступает сигнал о наличии беременности, используемый для ее распознавания, при котором уровень индуцируемого при беременности белка повышается у беременного животного по сравнению с небеременным животным такого же вида. Хотя у животных, у которых осеменение прошло безуспешно, т.е. они не забеременели, срок возникновения сигнала для распознавания беременности может и не наступить, термин «ранняя беременность» употребляется здесь в отношении небеременных животных для обозначения периода времени, в течение которого при успешном проведении осеменения наблюдалась бы беременность на ранних сроках. Обычно период ранней беременности, упоминаемый в связи со способом согласно изобретению, кончается приблизительно в конце первого месяца после зачатия.

Употребляемый в тексте термин «период поступления сигнала для распознавания беременности» относится к такому времени, в течение которого эмбрион секретирует белок или гормон, секреция которого приводит к тому, что мать узнает о существовании эмбриона. Хотя для животных, которых безуспешно осеменили, т.е. они не забеременели, период поступления сигнала для распознавания беременности может наступить или не наступить, термин «период поступления сигнала для распознавания беременности» употребляют здесь в отношении небеременных животных для обозначения периода времени, в который при успешном проведении осеменения животного биохимическая сигнализация должна происходить между оплодотворенным яйцом и маткой.

В соответствии с изобретением, у беременного животного явно будет наблюдаться более высокий уровень экспрессии одного или более из индуцируемых при беременности белков, таких как Mx-белок или белок ISG-17, в ранний срок беременности, такой как период поступления сигнала для распознавания беременности, чем у небеременных животных такого же вида. У небеременного животного, независимо от того, осеменяли его или нет, наблюдали почти исходный (базовый) уровень экспрессии индуцируемого при беременности белка, включая Mx-белок, в течение указанного периода.

В другом аспекте, изобретение относится к набору для определения репродуктивной функции животного таких видов, у которых оплодотворенное яйцо секретирует белок или гормон в качестве сигнала для «материнского» распознавания беременности. Согласно данному аспекту изобретения, набор включает в себя резервуар для хранения тестируемого образца, один или более одного реагентов, которые, после объединения с тестируемым образцом позволяют оператору визуально определить в тестируемом образце уровень одного или более из индуцируемых при беременности белков, таких как Mx-белок или белок ISG-17, и инструкции, с помощью которых определяют уровень белка в образце. Предпочтительно, когда набор также включает в себя инструкции, которые позволяют оператору установить беременность животного на основании установленного уровня белка в образце.

Изобретение также иллюстрируется ниже со ссылкой на Мх-белок. Специалист в данной области сможет оценить, что описанные далее результаты применимы к другим индуцируемым при беременности белкам, таким как другие индуцируемые интерфероном типа I белки, такие как индуцируемые IFNτ белки, включая 2',5'-олигоаденилатсинтетазу, β2-микроглобулин, IFN регуляторный фактор 1 и белок, реагирующий с убиквитином, а также к иллюстрируемому Mx-белку. Поэтому в последующем описании при упоминании термина «Mx-белок», следует иметь в виду, что может быть использован любой другой индуцируемый при беременности белок.

Краткое описание фигур

Фигура 1 представляет собой картину, иллюстрирующую результаты нозерн-блоттинга мРНК белка Mx из РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) на 26-й день после искусственного осеменения овец. Дорожки 1-6 относятся к беременным овцам, а дорожки 8-13 относятся к небеременным овцам. мРНК белка Mx по продвижению соответствует ˜ 2,5 т.п.н.

Фигура 2 представляет собой график, показывающий результаты слот-блоттинга тотальной клеточной РНК, выделенной из РВМС на 26-й день после искусственного осеменения овец. Уровни мРНК белка Mx были в 4 раза выше у беременных овец, чем у осемененных небеременных овец на 26-й день (Р<0,01). Уровни (◆) PSPB (специфический для беременности белок В) подтвердили наличие статуса беременности и коррелировали с числом родившихся ягнят. (CNTS на фиг.2 относится к интенсивности фотонов при хемилюминесцентном нозерн-блоттинге).

Фигура 3 представляет собой графическое изображение уровня экспрессии мРНК белка Мх в РВМС у искусственно осемененных беременных и небеременных овец от дня 0 до 30-го дня после искусственного осеменения. (CNTS на фиг.3 относится к интенсивности фотонов при хемилюминесцентном слот-блоттинге).

Фигура 4 представляет собой картину, иллюстрирующую полученную методом вестерн-блоттинга экспрессию Mx-белка из РВМС у беременных и небеременных овец на 15-й и 18-й дни после искусственного осеменения.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение применимо к любому виду животных, которые секретируют повышенные уровни одного или более из индуцируемых при беременности белков на ранней стадии беременности. Предпочтительно, вид животного является видом, который секретирует интерферон типа I в качестве сигнала для «материнского» распознавания беременности. Наиболее предпочтительно, вид животного является видом, который секретирует гормон IFNτ в качестве сигнала для "материнского" распознавания беременности. У этих животных повышенные уровни интерферона типа I, такого как IFNτ, вызывают повышенную экспрессию белка Mx в течение периода поступления сигнала для распознавания беременности. Согласно изобретению, отсутствие увеличения экспрессии индуцируемого при беременности белка, такого как Mx-белок, у подходящего животного на ранней стадии беременности, предпочтительно в период времени, который должен охватывать период поступления сигнала для распознавания беременности после осеменения, является положительным признаком того, что животное не является беременным. Наоборот, отрицательный результат, то есть выявление увеличения экспрессии белка в течение указанного периода, является признаком того, что животное является беременным.

При указанном применении отсутствие повышенной экспрессии индуцируемого при беременности белка, такого как Mx-белок, называют положительным результатом, тогда как наличие повышенной экспрессии белка называют отрицательным результатом. Данную терминологию, которая, на первый взгляд, покажется противоречащей обычному применению терминов «положительный» и «отрицательный», употребляют в тексте потому, что она отражает отсутствие беременности скорее, чем наличие беременности, и касается в основном фермера или хозяина ранчо или другого лица, занимающегося скотоводством. Если при проведении такого анализа выявляется, что животное беременное, то дополнительной работы для доказательства действительной беременности самки не требуется, помимо наблюдения за ней в ожидании признаков, свидетельствующих о том, что беременность закончилась. И наоборот, если при проведении такого анализа выявляется, что животное небеременное, то следует провести дальнейшую оценку начала следующего периода течки самки и вновь подвергнуть ее осеменению. Поэтому обнаружение отсутствия беременности у животного заставляет затратить дополнительный труд на животное, чтобы убедиться в том, что животное действительно оказалось беременным.

Как установлено выше, изобретение применимо к любой самке животного, принадлежащего к виду, который продуцирует повышенные уровни индуцируемого при беременности белка на ранней стадии беременности, такому виду, как вид животного, у которого интерферон типа I, такой как IFNτ, является единственным сигналом или одним из более чем один сигнал «материнского» распознавания беременности. Животные, подходящие для осуществления способа согласно изобретению, включают в себя копытных и некопытных жвачных животных. Копытные могут быть жвачными животными, такими как крупный рогатый скот, овца, коза, як, водяной буйвол и зубр. Среди включенных копытных жвачных животных, подходящих для осуществления изобретения, также являются не прирученные копытные животные, такие как антилопы, газели, благородный олень, северный олень, лось, снежный баран, жирафы и другие члены семейств, включающих крупный рогатый скот, овец и коз. Жвачные некопытные животные, подходящие для осуществления способа согласно изобретению, включают в себя верблюда двугорбого и верблюда одногорбого и другие типы верблюдов, такие как ламы, альпаки и викуньи. Копытные нежвачные животные, подходящие для осуществления изобретения, включают в себя прирученных и не прирученных свиней и лошадей. Животные, подходящие для осуществления способа согласно изобретению, включают в себя животных, отличных от копытных и некопытных жвачных животных. Например, полагают, что приматы, такие как человек, а также собаки и кошки, являются подходящими для осуществления способа согласно изобретению.

В соответствии со способом согласно изобретению, в течение соответствующего периода времени после осеменения животное подвергают проверке на присутствие или точнее на отсутствие повышенной экспрессии индуцируемого при беременности белка, примером которого далее служит Mx-белок. Проверка может быть осуществлена с использованием любой клетки, в которой Mx-белок экспрессируется, или любой жидкости организма, в которой обнаружен Mx-белок.

При определении того, имеет ли животное повышенную экспрессию Mx-белка или не имеет таковой, исследователи проводят сравнительные анализы уровня экспрессии у животных, которые, как известно, не являются беременными. Сравнение может быть осуществлено, например, с помощью проведения параллельного сравнения тестируемого образца, взятого у животного, которое было подвергнуто осеменению и у которого не установлена беременность. Иным, предпочтительным путем сравнение проводят с помощью тестирования образца, взятого у животного, которое было подвергнуто осеменению и беременность которого не установлена, и сравнения уровня Mx-белка в образце с уровнем Mx-белка, который, как известно, имеется у небеременных животных, то есть с использованием исторического контроля.

Изобретение иллюстрируют со ссылкой на определение повышенной экспрессии Мх-белка в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС). Однако любая клетка, в которой Mx-белок экспрессируется, включая другие ядросодержащие клетки, присутствующие в кровотоке, может быть использована вместо РВМС. Более того, полагают, что повышенную экспрессию Мх-белка в соответствии с изобретением можно определять с помощью анализа жидкостей, таких как молоко, слюна, моча, или выделения из носа, глаз и вагинальные выделения, или цельная кровь, плазма или сыворотка.

Хотя период «материнского» распознавания у большинства видов охватывает приблизительно одно и то же время, например, от 12 до 14 дня после осеменения овец и от 15 до 18 дня после осеменения коров, период поступления сигнала от эмбриона, который приводит к «материнскому» распознаванию беременности, варьирует отчасти среди различных видов. Таким образом, фактические числа после осеменения, во время которых способ согласно изобретению может быть эффективно осуществлен на практике, будут различаться. Например, период поступления сигнала для «материнского» распознавания беременности у прирученной овцы обычно начинается приблизительно на 11-й день после осеменения и продолжается приблизительно до 21 дня. У крупного рогатого скота указанный период обычно начинается приблизительно на 13-й день и продолжается приблизительно до 35 дня.

При сравнении уровня экспрессии Мх-белка в тестируемом образце с исходным уровнем экспрессии Мх-белка (у небеременных животных) обычно увеличенный вдвое или более уровень экспрессии Мх-белка над исходным уровнем является отрицательным тестом, то есть не установлено, что животное не является беременным. Обычно, при высших уровнях экспрессии Мх-белка в течение периода поступления сигнала для распознавания беременности, у беременного животного уровни экспрессии Мх-белка будут в четыре или пять раз выше, или еще выше исходного уровня.

В соответствии с изобретением способ может быть осуществлен на практике в любое время, начиная от начала периода поступления сигнала до того времени, когда уровень индуцируемого при беременности белка больше не повышается у беременных животных по сравнению с небеременными животными такого же вида. Это такое время, в течение которого беременные животные имеют повышенную экспрессию Мх-белка по сравнению с небеременными животными. Таким образом, у овец и крупного рогатого скота предпочтительный период времени для сравнения уровня экспрессии Мх-белка с целью выявления беременности находится между 12 и 30 днями после осеменения. Более предпочтительный период времени находится между 12 и 21 днями после осеменения. Наиболее предпочтительный период времени находится между 15 и 21 днями, и наиболее предпочтительным временем является 18-й день для крупного рогатого скота и 15-й день для овец.

Уровень экспрессии Мх-белка может быть определен любым способом, который позволяет осуществить указанное определение. Подходящие способы включают в себя определение Мх-белка как такового таким способом как ELISA-анализ, способом, основанным на функции Мх-белка, или с помощью вестерн-блоттинга. Подходящие способы также включают в себя определение повышенных уровней мРНК белка Мх таким способом как нозерн-блоттинг, слот-блоттинг или ПЦР. В предпочтительном аспекте уровень экспрессии Мх-белка устанавливают путем обнаружения уровня экспрессии Мх-белка в образце с помощью колориметрического анализа, основанного, например, на связывании антитела с Мх-белком, подобно способам, которые применяют для установления беременности у женщины с помощью портативных диагностических наборов.

Способ согласно изобретению является точным, воспроизводимым тестом, который позволяет с определенностью устанавливать, что животное не является беременным, и также может быть применен для определения наличия беременности у животного. Что касается, в частности, Мх-белка, но не обязательно относится к другим индуцируемым при беременности белкам, единственным источником ошибочных отрицательных результатов, которые неверно указывают на наличие беременности у животного на основании обнаружения повышенного уровня экспрессии Мх-белка, является состояние животного, страдающего от острой вирусной инфекции.

Набор согласно изобретению предпочтительно основан на иммуноферментном анализе (ELISA), известном как «иммунометрический», или «сэндвич»-анализ. Такой анализ включает в себя «прослаивание» лиганда (такого как антиген) двумя или более рецепторными молекулами (такими как антитела), которые беспрепятственно образуют комплекс с различными сайтами лигандного эпитопа. Примеры таких анализов описаны в патенте США №4486530, принадлежащем David et al. В качестве альтернативы, набор может быть основан на хемилюминесцентных анализах, усиленных люминесцентных анализах и радиоиммуноанализах. В предпочтительном аспекте набор включает в себя упаковку, которая вмещает тестируемую поверхность, такую как предметное стекло или многолуночные планшеты, где указанная поверхность связана с антителом, которое будет связываться с эпитопом исследуемого белка, такого как Мх-белок, контейнер, содержащий вторичное антитело, которое будет связываться со вторичным эпитопом белка, причем вторичное антитело является меченым, контейнер, содержащий стандартный образец с исходной концентрацией белка, реагент, который при контакте с меченым вторичным антителом способствует визуальному определению относительного количества присутствующего белка, и инструкции к применению набора с целью определения того, содержит ли тестируемый образец количество Мх-белка, указывающее на наличие или отсутствие беременности.

Набор согласно изобретению для определения статуса беременности с помощью определения относительного уровня индуцируемого при беременности белка, такого как Мх-белок, в тестируемом образце по сравнению с контролем может быть получен различными способами, которые будут очевидны специалистам в данной области при прочтении данного описания. Следует иметь в виду, что эти различные способы получения набора согласно изобретению включены в изобретение.

Изобретение также описывается с помощью следующих иллюстративных неограничивающих примеров. Примеры описывают способ согласно изобретению со ссылкой на Мх-белок. Однако способ согласно изобретению применим к другим индуцируемым при беременности белкам.

Пример 1. Модели животных

Шестьдесят (60) взрослых белых овец, взятых из овцеводческой экспериментальной фермы США (USSES, Dubois ID), синхронизировали и подвергали осеменению путем трансцервикального или лапароскопического искусственного осеменения ("AI"). Лапароскопическое AI проводили согласно процедуре, описанной у Stellflug et al., J. Anim. Sci. 79:568-573 (2001). День искусственного осеменения был обозначен днем 0 (D0). На 26-й день после AI (D26) отбирали образцы крови (10 мл) посредством венепункции яремной вены в пробирки "vacutainer", содержащие EDTA (Sherwood Medical, St. Louis MO). Клетки PBMC выделяли, как описано ниже в примере 2. Беременность устанавливали путем исследования сыворотки на специфический для беременности белок В (PSPB; Biotracking Inc, Moscow ID) и записывали дату рождения ягнят и количество родившихся ягнят.

Пример 2. Выделение клеток РВМС

Образцы крови содержали на льду до обработки. Образцы центрифугировали при 300 × g в течение 20 минут при 4°С. Светлый слой кровяного сгустка удаляли и вновь суспендировали в 0,87% Tris-NH₄Cl-буфере для лизиса при соотношении 1 к 5. Образцы инкубировали в течение 5 минут при 37°С и центрифугировали при 300 × g в течение 10 минут. Супернатант удаляли, и осадки промывали 10 мл 1Х PBS (забуференный фосфатом физраствор) и центрифугировали в течение 10 минут при 300 × g. После удаления супернатанта клеточные осадки либо замораживали при -80°С для экстракции белка, либо лизировали с 2 мл TRIZOL (Life Technologies, Grand Island NY) и хранили при -80°С для экстракции РНК.

Пример 3. Экстракция РНК, нозерн-блоттинг и слот-блоттинг

Тотальную клеточную РНК экстрагировали, используя TRIZOL согласно инструкциям. РНК количественно оценивали по отношению А260:280. Для того, чтобы установить размер и число транскриптов для белка Мх в клетках РВМС, РНК (5 мкг) подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле с 0,615 М формальдегидом и переносили на нейлоновую мембрану (Nytran, Schleicher & Schuell, Keene NH) путем капилляроблоттинга. Для количественной оценки уровней мРНК белка Мх в клетках РВМС, РНК (5 мкг) переносили на нейлоновую мембрану с помощью вакуум-фильтрации (Minifold II, Schleicher & Schuell, Keene NH). Пятна исследовали с помощью меченного биотином зонда антисмысловой кРНК, кодирующей овечий Мх-белок (Ott et al., Biol. Reprod. 59:784-794 (1998)), используя набор тестов для нозерн- и саузерн-гибридизации (Pierce, Rockford IL), и хемилюминесцентный сигнал количественно оценивали с помощью системы Bio-Rad Fluor-S MultiImager и программы Quantity One (Bio-Rad, Hercules CA). Пятна после слот-блоттинга снимали и вновь исследовали с помощью кРНК-зонда для овечьей 18s рРНК, чтобы корректировать колебания в нагрузке РНК.

С помощью нозерн-блоттинга, результаты которого показаны на фиг.1, была обнаружена единственная, приблизительно 2,5 кДа, полоса в клетках РВМС, выделенных из крови беременных и осемененных небеременных овец, которая соответствовала известному размеру кДНК белка Мх матки овцы (Charleston and Stewart, Gene 137:327-331 (1993); Ott et al., Biol. Reprod. 59:784-794 (1998)).

Исследование посредством слот-блоттинга, результаты которого представлены на фиг.2, тотальной клеточной РНК, выделенной из клеток РВМС, собранных на день D26 после AI, выявило четырехкратное увеличение уровней мРНК белка Мх у беременных против осемененных небеременных (n=26) овец (Р<0,01). Кроме того, у овец, вынашивающих много ягнят (троих или четверых; n=10), уровни мРНК белка Мх были выше, чем уровни мРНК белка Мх у овец, вынашивающих одного (n=10) или двоих (n=9; P<0,05). Результаты исследования PSPB (специфического для беременности белка В) подтвердили статус беременности и, как сообщалось ранее, уровни PSPB коррелировали с количеством родившихся ягнят (Willard et al., J. Anim. Sci. 73:960-966 (1995)).

Пример 4. Временная экспрессия мРНК белка Мх на стадии ранней беременности у овец

С помощью второго исследования проверяли временную экспрессию мРНК белка Мх на стадии ранней беременности у овец, результаты исследования представлены на фиг.3. Тридцать четыре (34) взрослые овцы из Суффолка были синхронизированы и подвергнуты осеменению путем лапароскопического AI. Образцы крови (20 мл) собирали с помощью венепункции яремной вены на день 0 (D0) и каждые три дня от 9-го дня (D9) до 30-го дня (D30), и клетки РВМС выделяли. Беременность подтверждали с помощью производимой в реальном времени ультразвуковой эхографии и анализа PSPB на 30-й день (D30). Результаты, представленные на фиг.3, характеризуют субпопуляцию всех овец и отражают результаты, полученные от четырех беременных и четырех осемененных небеременных овец в течение первых 30 дней после осеменения. Это позволило проанализировать все реплики на одном пятне, чтобы исключить проблемы, связанные с интенсивностью сигнала между пятнами. Полученные результаты показывают, что уровни мРНК белка Мх увеличивались у беременных овец, начиная с 15-го дня (D15) (Р<0,01). Уровни достигали максимума на 21-й день (D21) и постепенно снижались после этого. На 30-й день (D30) уровни белка Мх у беременных овец оставались повышенными в два раза по сравнению с осемененными небеременными овцами (Р<0,01).

Пример 5. Выделение белка и исследование методом вестерн-блоттинга

Тотальный клеточный белок экстрагировали с помощью M-PER реагента (Pierce, Rockford IL), согласно инструкциям производителей. Концентрацию белка в образцах оценивали количественно ВСА-методом (Pierce, Rockford IL), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин. Белки (8 мкг/образец) из клеток РВМС, полученных из крови беременных и осемененных небеременных овец на 15-й день (D15) и на 18-й день (D18), разделяли с помощью электрофореза в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и электрофоретическим способом переносили на нитроцеллюлозную мембрану (ВА83, Schleicher & Schuell, Keene NH). После блокирования неспецифических связывающих участков с помощью 5% обезжиренного сухого молока в забуференном Tris физиологическом растворе и Tween 20 (TBST) в течение 2 часов при 25°С мембраны инкубировали в разведении 1:1000 с поликлональной антисывороткой кролика к Мх-пептиду овцы (#90618-2; 0,7 мкг/мл) при 4°С в течение ночи. Антикроличий IgG (иммуноглобулин G) козы (0,8 мкг/мл), меченный пероксидазой хрена, использовали при разведении 1:200000 в качестве вторичного антитела. Хемилюминесцентный сигнал появлялся при использовании West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce, Rockford IL), и его количественно оценивали с помощью системы Fluor-S MultiImager и программы Quantity One.

Как показано на фиг.4, белок Мх (˜75 кДа) не определялся на 15-й день (D15) или на 18-й день (D18) у небеременных овец, но его уровень был в значительной степени повышен в клетках РВМС беременных овец в оба дня. Две дополнительные полосы (˜48 и 36 кДа) были обнаружены в РВМС беременных овец.

Пример 6. Анализ

Хемилюминесцентный сигнал анализировали, используя GLM процедуры SAS (Version 8.1, SAS Inc. Gary NC). Модель включала в себя, где уместно, состояние (беременное животное против осемененного небеременного животного), овцу, находящуюся в определенном состоянии, день (0, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27 и 30) и соответствующие взаимодействия. Величины ошибок в F-тесте соответствовали математическому ожиданию среднеквадратичных ошибок. Сигнал относительно 18s рРНК проходил как ковариант в модели для того, чтобы корректировать колебания в нагрузке. В результате анализа получены наименьшие среднеквадратичные (LSM) и суммарные, стандартные ошибки.

Пример 7. Крупный рогатый скот

Тридцать три молочные коровы подвергали осеменению путем искусственного осеменения, и уровни мРНК белка Мх определяли способом, описанным выше в примерах 2 и 3. Было обнаружено, что на 15-й день уровни мРНК белка Мх были приблизительно такими же, как у коров, у которых позже была установлена беременность, и у коров, у которых позже было установлено отсутствие беременности. Как было обнаружено, на 18-й день уровни мРНК белка Мх были значительно увеличены у коров, у которых позже была установлена беременность, приблизительно в три раза выше уровня, обнаруженного у коров, у которых позже было установлено отсутствие беременности.

Полученные результаты свидетельствуют о быстрой и непрерывной активации экспрессии гена, кодирующего Мх-белок, в ответ на поступление сигнала для распознавания беременности, и указывают на то, что, кроме локального действия IFNτ, существует быстрый системный ответ у овец и крупного рогатого скота. Кроме того, экспрессия Мх-белка не увеличивается в клетках РВМС в случае, когда беременность не установлена (осемененные небеременные животные). Полученные данные представляются важными, поскольку ранее рассматривали, что поступление сигнала для распознавания беременности посредством IFNτ является результатом исключительно локальной регуляции генной экспрессии в эндометрии (Stewart et al., Endocrinology 142:98-107 (2001); Johnson et al., Biol. Reprod. 64:1392-1399 (2001); Vallet et al., J. Endocrinol. 130:R1-4 (1991); Spencer et al., Biol. Reprod. 58:1154-1162 (1998); Johnson et al., Biol. Reprod. 62:622-627 (2000); Charleston and Stewart, Gene 137:327-331 (1993); Ott et al., Biol. Reprod. 59:784-794 (1998); Spencer et al., Biol. Reprod. 61:464-470 (1999)) и подавления экспрессии рецепторов эстрогена и окситоцина с целью отмены лютеолитических импульсов PGF_2α. Поэтому способы и наборы тестов согласно изобретению представляют собой новые и практически важные методы выявления отсутствия беременности и наличия беременности у крупного рогатого скота.

Все статьи и патенты, цитированные в данной заявке, включены в данный текст в виде ссылки.

Кроме того, модификации, использование и применение изобретения, описанные в данном тексте, будут очевидны специалистам в данной области. Предполагается, что такие модификации включены в формулу изобретения.

Изобретение относится к способам, позволяющим установить беременность у животных, в частности у некопытных, копытных и жвачных животных. Изобретение раскрывает способ и набор тестов для выявления того, является ли животное небеременным или беременным после осеменения. Уровень экспрессии индуцируемого при беременности белка определяют у животного, для которого статус беременности является желательным, и уровень экспрессии белка у такого животного сравнивают с уровнем экспрессии указанного белка у животных, которые не являются беременными. Изобретение обеспечивает создание надежного, воспроизводимого и недеструктивного способа определения наличия беременности или отсутствия беременности у домашнего крупного рогатого скота и достигается, если проводят определение уровня экспрессии индуцируемого при беременности 2,5-олигоаденилатсинтетазы, β2-микроглобулина, регуляторного фактора 1 интерферона, белка, перекрестно реагирующего с убихиноном (ISG-17), и Мх-белка. 3 н. и 33 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Способ определения статуса беременности у копытного или некопытного жвачного животного, согласно которому определяют уровень внематочной экспрессии индуцируемого при беременности белка в жидкости организма животного, взятой у животного в течение периода ранней беременности после осеменения животного, и сравнивают уровень экспрессии у животного указанного белка с таковым у небеременных животных того же вида, при этом животное считается небеременным, если уровень экспрессии белка у животного в течение периода ранней беременности не повышается по сравнению с уровнем экспрессии белка у небеременных животных того же вида, тогда как животное считается беременным, если уровень экспрессии белка у животного в течение периода ранней беременности повышается по сравнению с уровнем экспрессии белка у небеременных животных того же вида.2. Способ по п.1, где индуцируемым при беременности белком является белок, индуцируемый интерфероном типа I.3. Способ по п.1, где белком, индуцируемым интерфероном типа I, является белок, индуцируемый интерфероном тау (IFNτ).4. Способ по п.1, где животным является жвачное животное.5. Способ по п.4, где некопытное жвачное животное выбрано из группы, состоящей из двугорбого верблюда, одногорбого верблюда, ламы, альпаки и викуньи.6. Способ по п.4, где животным является копытное животное.7. Способ по п.6, где животное выбрано из группы, состоящей из крупного рогатого скота, овцы, коз, яков, водяных буйволов, зубров, антилоп и оленя.8. Способ по п.7, где животным является овца или корова.9. Способ по п.1, где животным является копытное животное.10. Способ по п.9, где животным является лошадь или свинья.11. Способ по п.1, где белок выбран из группы, состоящей из 2',5'-олигоаденилатсинтетазы, β2-микроглобулина, регуляторного фактора 1 интерферона, белка, перекрестно реагирующего с убиквитином, и Мх-белка.12. Способ по п.11, где белком является Мх-белок.13. Способ по п.1, где уровень экспрессии белка оценивают путем определения уровня мРНК, кодирующей белок.14. Способ по п.13, где определение мРНК проводят посредством метода нозерн-блоттинга, метода слот-блоттинга или метода полимеразной цепной реакции.15. Способ по п.1, где уровень экспрессии белка оценивают путем определения уровня белка.16. Способ по п.15, где определение уровня экспрессии белка проводят путем оценки связывания антитела с белком или методом анализа на основе функции этого белка.17. Способ по п.15, где уровень экспрессии белка определяют колориметрическим методом.18. Способ по п.1, где уровень экспрессии белка оценивают путем определения экспрессии белка в клетке животного.19. Способ по п.18, где клеткой является ядросодержащая клетка крови.20. Способ по п.19, где клеткой является мононуклеарная клетка периферической крови.21. Способ по п.1, где уровень экспрессии белка определяют путем анализа жидкости организма животного.22. Способ по п.21, где жидкость организма выбрана из группы, состоящей из молока, слюны, мочи, выделений из носа, выделений из глаз или вагинальных выделений.23. Способ по п.21, где жидкостью организма является кровь, плазма или сыворотка.24. Способ по п.1, где животное считается беременным, если уровень экспрессии белка у животного в течение периода ранней беременности в два раза или более превышает уровень экспрессии белка у небеременного животного того же вида.25. Способ по п.24, где животное считается беременным, если уровень экспрессии белка у животного в течение периода ранней беременности в четыре раза или более превышает уровень экспрессии белка у небеременных животных того же вида.26. Способ по п.1, где сравнение проводят путем параллельного сравнения уровня экспрессии белка у данного животного с уровнем экспрессии у животного, у которого установлено наличие или отсутствие беременности.27. Способ по п.1, который выполняют в течение периода поступления сигнала для распознавания беременности.28. Способ по п.1, который выполняют в течение периода между 12 и 30 днями после осеменения животного.29. Способ по п.28, который выполняют в течение периода между 12 и 21 днями после осеменения животного.30. Способ по п.29, который выполняют в течение периода между 18 и 21 днями после осеменения животного.31. Набор для установления статуса беременности у копытного или некопытного жвачного животного, включающий в себя контейнер для тестируемого образца, один или более реагентов, которые при объединении с тестируемым образцом в контейнере дают возможность оператору визуально определить внематочный уровень индуцируемого при беременности белка, который экспрессирован материнским геном в тестируемом образце, где индуцируемым при беременности белком является белок, индуцируемый IFNτ, и инструкции для установления статуса беременности животного по уровню белка в образце.32. Набор по п.31, где индуцируемым IFNτ белком является Мх-белок.33. Набор по п.31, где индуцируемым IFNτ белком является ISG-17.34. Набор для установления статуса беременности у копытного или некопытного жвачного животного, включающий в себя тестируемую поверхность, связанную с антителом, которое будет связываться с эпитопом индуцируемого при беременности белка, контейнер, содержащий второе меченое антитело, которое будет связываться со вторым эпитопом белка, где индуцируемым при беременности белком является белок, индуцируемый IFNτ, контейнер, содержащий стандартный образец, имеющий исходную концентрацию белка, реагент, который при контакте с меченым вторым антителом способствует визуализации относительного количества присутствующего белка, и инструкции к применению набора с целью определения того, содержит ли тестируемый образец количество белка, указывающее на наличие или отсутствие статуса беременности.35. Набор по п.34, где белком, индуцируемым IFNτ, является Мх-белок.36. Набор по п.34, где белком, индуцируемым IFNτ, является белок ISG-17.