Изобретение относится к применению гельминтных антигенов в вакцинах для борьбы с заболеванием, вызываемым паразитами, в особенности у домашних животных, и, в частности, изобретение относится к использованию указанных антигенов для борьбы с паразитарным заболеванием, связанным с подавлением или изменением естественного иммунитета, например так называемым "предродовым ростом" или остертагиозом типа II.
Паразитические гельминты вызывают большое число заболеваний и инвазий домашних и других животных, которые приводят к потере продуктивности и даже гибели животных, и потому борьба с ними имеет важное экономическое значение. В случае человека гельминтные инфекции могут приводить к тяжелому истощению и смерти. В отношении домашних животных особое внимание уделяется Haemonchus, питающейся кровью нематоде, которая поражает сычуг жвачных животных, вызывая анемию и потерю веса, и при отсутствии лечения наступает быстрая гибель животного, а также не питающейся кровью нематоде Ostertagia (Teladorsagia), вызывающей сходные тяжелые заболевания и гибель животных, в особенности крупного рогатого скота и овец.
К другим гельминтам, имеющим экономическое значение, относятся Trichostrongylus, Cooperia, Chabertia, Oesophagostomum, Nematodirus, Dictiocaulus и различные двуустки (например, Fasciola).
Естественный иммунитет к гельминтам, например Haemonchus, может развиваться в стадах животных, постоянно выгоняемых на инфицированные гельминтами пастбища, однако контроль гельминтных инфекций традиционно осуществлялся путем применения антигельминтных препаратов и соблюдения определенного режима выпаса. Противогельминтные вакцины имеют очевидные преимущества перед лекарственными препаратами, требующими частого применения и к которым может развиться устойчивость, и в последние годы усилия исследователей были направлены на разработку иммунологических методов контроля.
В настоящее время многообещающие результаты получают главным образом при использовании белков, экстрагированных из кишечника Haemonchus, которые являются потенциальными защитными антигенами не только против Haemonchus, но и против широкого спектра других гельминтов. В частности, показано, что двойной белок, названный H110D, обнаруженный на внутренней поверхности кишечника H.contortus, генерирует защитный иммунитет против гемонхоза овец (см. например, заявку WO 88/00835).
Так называемый "предродовый рост" или "послеродовый рост", однако, вызывает особые проблемы. Для заболевания характерно увеличение количества яиц гельминтов (особенно нематод), обычно относящихся к различным видам, включая H. contortus, которое обнаруживается в фекалиях животных на последних стадиях беременности и в особенности перед родами и в течение начального периода лактации. Несмотря на то что указанное заболевание не до конца изучено, считается, что оно обусловлено временным ослаблением иммунитета, связанным с изменением уровня содержания в крови гормона пролактина, которое наблюдается у животных во время беременности, или с уменьшением количества секреторных иммуноглобулинов на слизистой поверхности кишечника, вызванным их переносом с плазмой крови к эпителию молочных желез и последующей секрецией в молоко. Ослабление иммунитета организма-хозяина приводит к увеличению образования яиц взрослыми особями гельминтов, развившимися или из недавно попавших в желудок инфекционных личинок, или же из вновь начавших развиваться личинок, которые в свое время остались инактивированными в организме животного, а также из тех и других личинок вместе, что в свою очередь приводит к высокому содержанию яиц (и последующей генерации инфекционных личинок) на пастбище как раз в то время, когда рождается новое поколение животных, и следовательно, новые восприимчивые организмы-хозяева, что обеспечивает выживание и размножение гельминтов. Таким образом продолжается инфекционный цикл.
Для адекватной защиты восприимчивых животных и для предотвращения регулярных вспышек гельминтных инвазий желательно прервать указанный цикл инфекции на околородовой стадии. Как отмечалось выше, в этот критический период естественный иммунитет ослабляется и это является основанием для контролирования околородового подъема путем введения антигельминтных лекарственных средств главным образом до случки. Однако во время беременности животные обычно продолжают заражаться инфекционными личинками и цикл развития паразитов вновь восстанавливается. Таким образом, более настоятельная необходимость заключается в разработке улучшенного метода контроля околородового роста и уменьшения вероятности последующего инфицирования гельминтами восприимчивых молодых животных в послеродовой период. Более того, снижение естественного иммунитета к желудочно-кишечным нематодам у небеременных животных связана с сезонными изменениями в питании и содержании, и контакт с паразитами может привести к заболеванию, часто смертельному, например к остертагиозу типа II крупного рогатого скота.
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что определенная схема вакцинации при использовании скрытых антигенов гельминтов, как описано ниже, эффективно уменьшает образование яиц гельминтов в организме животных со сниженным естественным иммунитетом, в особенности у инфицированных беременных животных и, таким образом, предотвращает предродовой рост и прерывает цикл инфекции.
Один аспект изобретения соответственно заключается в применении скрытого антигена гельминтов или антигенных фрагментов, предшественников, функционально-эквивалентных производных или вариантов антигена, имеющих иммуногенную активность по отношению к одному или более паразитическим гельминтам, в приготовлении вакцинной композиции для введения животным по меньшей мере один раз до и/или во время периода утраты или ослабления естественного иммунитета к паразитическим гельминтам желудочно-кишечного тракта с целью стимуляции защитного иммунитета против указанных паразитов во время периода, когда естественный иммунитет поставлен под угрозу.
Более конкретно, изобретение относится к применению скрытого антигена гельминтов или антигенных фрагментов, предшественников или функционально-эквивалентных производных или вариантов антигена, имеющих иммуногенную активность по отношению к одному или более паразитическим гельминтам, в приготовлении вакцинной композиции для введения самкам животных по меньшей мере однократно во время периода, предшествующего случке, и/или до начала третьего триместра беременности ("триместр" - это период длительностью в три месяца) с целью стимуляции иммунитета против указанных паразитических гельминтов в околородовой период и, в частности, с целью предотвращения или ослабления околородового подъема.
С другой стороны, изобретение может быть отнесено к способу стимуляции иммунного ответа против паразитических гельминтов у животных во время ослабления естественного иммунитета. Данный способ предусматривает введение указанным животным по меньшей мере однократно до и/или во время периода утраты или снижения естественного иммунитета к желудочно-кишечным паразитическим гельминтам вакцинной композиции, содержащей один или более скрытых антигенов гельминтов или антигенных фрагментов, предшественников и функционально-эквивалентных производных или вариантов антигена, обладающих иммуногенной активностью по отношению к одному или более паразитическим гельминтам.
Более определенно, изобретение относится к способу стимуляции иммунного ответа против паразитических гельминтов у самок животных в течение околородового периода и, в частности, для предотвращения или ослабления "околородового роста". Данный способ включает введение указанным животным по меньшей мере однократно во время периода, предшествующего случке, и/или до начала третьего триместра беременности вакцинной композиции, содержащей один или более скрытых антигенов гельминтов или антигенных фрагментов, предшественников и функционально-эквивалентных производных или вариантов антигенов, обладающих иммуногенной активностью по отношению к одному или более паразитическим гельминтам.
Используемый здесь термин "поставленный под угрозу естественный иммунитет" означает потерю или ослабление естественного иммунитета, которое приводит к неэффективной или неадекватной защите.
Таким образом, согласно настоящему изобретению вакцину вводят в течение периода, когда иммунная система животного остается компетентной и способна обеспечить генерацию иммунологической памяти по отношению к определенному антигену. В случае околородовой иммунизации предпочтительно, чтобы вакцина была введена по меньшей мере однократно во время периода, предшествующего случке, и/или непосредственно перед началом второго триместра беременности. Как подробнее будет описано ниже, наиболее предпочтительно проводить иммунизацию один или более раз во время беременности в соответствии с практикой скотоводства.
Ослабление естественного иммунитета к желудочно-кишечным нематодам может быть обусловлено:
1) возобновлением созревания в свое время прекративших развитие личинок;
2) увеличением количества инфекционных личинок, поступающих в желудок через рот;
3) снижением количества изгоняемых взрослых червей;
4) увеличением плодовитости существующей популяции взрослых особей.
Считается, что все четыре фактора способствуют возникновению "околородового роста". Что же касается других заболеваний, ассоциированных с потерей или ослаблением естественного иммунитета, например остертагиоза типа II, то здесь основную роль играет процесс возобновления созревания личинок.
Более того, гипобиотические или иммунологически "заблокированные" личинки, например те, которые подверглись сезонной задержке развития, что свойственно некоторым видам нематод, начинают созревать весной, практически в период разрешения от бремени животных-хозяев, и этот весенний подъем созревания личинок может вносить определенный вклад в развитие околородового подъема. Естественный иммунитет к гельминтам, например Haemonchus, действует главным образом на ранней личиночной стадии L4, которая является стадией задержки развития, свойственной данному виду гельминтов. Как только личинка успешно возобновляет свое развитие, она может больше не контролироваться естественным иммунитетом. В противоположность этому скрытые антигены эффективно стимулируют защитный иммунитет против личинок на поздних стадиях развития и взрослых червей, которые обычно избегают воздействия механизмов естественного иммунитета хозяина.
Таким образом, технический результат изобретения заключается в стимулировании защитного иммунного ответа у животных, когда естественный иммунитет к гельминтам ослаблен, например во время беременности, и будучи направленным на предотвращение или ослабление "околородового роста" является неожиданным и ранее не предсказанным. Прежние исследования показали, что не дает эффекта вакцинация овец и крупного рогатого скота при использовании антигенов, для которых методом иммуноскрининга показано их участие в развитии естественного иммунного ответа. В случае околородовой иммунизации не ожидалось, что первичная иммунизация животных перед случкой или непосредственно после нее и необязательная повторная иммунизация во время беременности будут успешно способствовать ответной иммунной реакции, способной предотвратить "околородовой рост". Сходным образом оказалось неожиданным, что другие состояния, ассоциированные с утратой или ослаблением естественного иммунитета, такие как остертагиоз типа II, могут контролироваться иммунизацией, которую осуществляют в течение периода снижения естественного иммунитета.
Не желая быть связанными теорией, авторы изобретения считают, что указанный результат в первую очередь обусловлен предотвращением созревания гипобиотически или иммунологически задержанных в развитии личинок во взрослые особи и вследствие этого затуханием инфекции. Уменьшение количества яиц, откладываемых взрослыми особями, также может играть существенную роль. Это может иметь определенное значение в случае таких гельминтов, как Ostertagia, когда созревание задержанных в развитии личинок у беременных животных или последующие сезонные климатические изменения как у самцов, так и у самок крупного рогатого скота часто приводят к смертельному заболеванию, например остертагиозу типа II.
Другим важным фактором предотвращения "околородового роста" может быть перенос с молозивом новорожденным животным защитных материнских антител, образовавшихся в результате иммунизации скрытыми антигенами, что может иметь существенное значение для уменьшения инфекции, например вызванной Haemonchus, у молодняка в результате поступления в желудок через рот личинок, образовавшихся из яиц, которые откладываются во время "околородового роста". Это полностью противоречит природе естественного иммунитета, который не передается от матери к потомству.
Используемый здесь термин "скрытый антиген" относится к антигенам, также называемым "зашифрованными", "спрятанными" или "закрытыми" антигенами, которые при обычном инфекционном процессе не контактируют с иммунной системой организма-хозяина и соответственно не распознаются сывороткой животных, которые приобрели естественный иммунитет к данному паразиту. Такие антигены в основном происходят из внутренних структур гельминтов, которые при инфекции не "видны" для иммунной системы хозяина. Например, показано, что особенно богатым источником такого рода антигенов является кишечник гельминтов.
Предшественником антигена может быть более крупный белок, который обрабатывают, например, протеолизом с образованием антигена как такового. Указанные предшественники могут иметь форму зимогенов, т.е. инактивированных предшественников ферментов, активированных протеолитическим расщеплением, например, аналогично тому, как это происходит в системе пепсин/пепсиноген или в случае хорошо изученных зимогенов, вовлеченных в каскадные реакции свертывания крови.
Поскольку скрытые антигены проявляют свое действие, вызывая в кровотоке животного-хозяина образование вызывающих иммунитет молекул, таких как антитела и комплемент, которые поступают в организм паразита при питании кровью хозяина, первоначально считалось, что концепция скрытых антигенов применима только к паразитам, питающимся кровью. Авторы изобретения показали, однако, что скрытые антигены могут использоваться как основа вакцин, предназначенных для использования против паразитов, не питающихся кровью.
Используемый здесь термин "иммуногенная активность" относится к антигенам и их фрагментам, предшественникам, производным и вариантам, которые способны генерировать протективный иммунный ответ организма-хозяина, т.е. ответ, приводящий к образованию иммунных эффекторных молекул, антител или клеток, которые способны уменьшить или прекратить репродукцию паразитов, а также ингибировать их функциональную активность, повредить паразитов или вызвать их гибель и тем самым снизить выход яиц паразитов и "защитить" хозяина от клинического или субклинического заболевания и потери продуктивности.
Такого рода защитный иммунный ответ к скрытым антигенам наиболее часто может обеспечиваться генерацией антител, способных ингибировать метаболические функции паразитов, приводя к прекращению продукции яиц и/или гибели гельминтов. Образование протективных главным образом IgG-антител, которые обнаруживаются в сыворотке крови хозяина, представляет собой важный фактор, отличающий иммунный ответ, вызванный скрытыми антигенами, от реакций естественного иммунитета. В то время как скрытые антигены вызывают преимущественно гуморальный иммунный ответ, т.е. антительный ответ, естественный иммунитет к паразитам, по-видимому, является в первую очередь клеточно-опосредованным, т.е. основанным на функционировании эозинофилов и тучных клеток, которые высвобождают вещества, повреждающие паразитов; в этом случае гуморальная система иммунитета менее важна.
Указанные отличия индуцированного скрытыми антигенами иммунитета считаются важным фактором успешного применения таких антигенов для контроля гельминтных заболеваний в периоды ослабления естественного иммунитета, например при околородовом подъеме и остертагиозе типа II крупного рогатого скота.
Как отмечалось выше, данное изобретение включает функционально-эквивалентные фрагменты, производные и варианты скрытых антигенов гельминтов. Используемый здесь термин "функционально-эквивалентный" относится к белкам, включая гликопротеины, родственные нативным белкам, или их производные, аминокислотная последовательность которых может быть модифицирована одной или множественными аминокислотными заменами, добавлениями и/или делециями, а также указанная последовательность может включать химически модифицированные аминокислоты, например, полученные путем гликозилирования или дегликозилирования, но данные белки не теряют протективной антигенной (иммуногенной) активности, т.е. способны усиливать образование протективных антител хозяина и/или функциональную иммунологическую активность против гельминтов. Указанные функционально эквивалентные варианты могут представлять собой природные биологические варианты белков или же быть получены с помощью известных технологий. Например, функционально-эквивалентные рекомбинантные белки можно получить путем сайт-направленного мутагенеза, случайного мутагенеза, а также энзиматическим расщеплением и/или лигированием нуклеиновых кислот.
Как отмечалось выше, околородовая иммунизация вакцинными композициями на основе скрытых антигенов осуществляется по отношению к самкам животных по меньшей мере однократно в течение периода, предшествующего случке, и/или перед началом третьего триместра беременности, более предпочтительно перед началом второго триместра. В большинстве случаев, однако, вакцина применяется более одного раза, например первоначальную инъекцию проводят до случки и одну или более бустерных инъекций проводят в течение периода перед началом третьего, более предпочтительно второго триместра беременности.
Соответственно, вакцина может быть применена, во-первых, в течение периода, составляющего 60 дней до или 20 дней или более, предпочтительно 10 дней, после случки, например в пределах 45 дней до случки или более предпочтительно в течение 40-5 дней, особенно 40-10 дней, до случки. В то время как предпочтительно проводить первую инъекцию вакцины непосредственно перед случкой, различная скотоводческая практика на различных фермах может, однако, показать, что более удобна иммунизация в другое время, например за 6 месяцев до случки или даже непосредственно после рождения молодняка.
Бустерную (или "ударную") иммунизацию можно проводить в любое время после случки перед началом третьего триместра беременности. Например, бустерную инъекцию осуществляют один или более раз в течение периода непосредственно перед вторым триместром или непосредственно перед третьим триместром беременности.
Как обсуждалось выше, вакцинация указанным иммуногеном может осуществляться более одного раза в течение соответствующего периода, при этом в случае различных животных и вакцин могут оказаться подходящими различные комбинации. С другой стороны, однако, использование системы, контролирующей высвобождение и доставку антигена, могло бы индуцировать длительный иммунный ответ при одной вакцинации (O'Hagan et al., 1991, Immunology, 73: 239-242). Если первичная инъекция осуществляется прежде чем за 6 месяцев до случки, как правило требуется последующая инъекция в пределах 6 месяцев перед случкой. Ежегодной бустерной инъекции может оказаться достаточно в некоторых случаях, например после зимнего периода, когда риск возникновения инфекции небольшой. Обнаружено, что введение вакцины на основе антигена H110D дважды в течение периода, составляющего 40-10 дней до случки и в течение 90 дней после случки, эффективно иммунизирует животных против Haemonchus, что может служить примером подходящей схемы иммунизации.
Несмотря на то что иммунизация животных только на стадиях поздней беременности оказались неэффективной, когда не используется вакцинный препарат с контролируемым высвобождением антигена, предпочтительно осуществлять однократное или многократное (более одного раза) введение вакцины во время беременности перед началом ее третьего триместра, например у овец примерно на 50-100-ый день, скажем 45-90-ый день текущей беременности.
Животные, которые получают преимущество при осуществлении изобретения, могут быть с человеком или нет, но в любом случае - это близкие человеку животные, в частности собаки, кошки или другие домашние животные, в особенности жвачные. Особого внимания заслуживают овцы, олени, козы и крупный рогатый скот.
"Околородовой рост" отмечается у многочисленных видов гельминтов и они, таким образом, являются подходящими объектами для применения вакцинной композиции. К указанным гельминтам относятся наиболее хорошо изученные виды Haemonchus, Ostertagia, Trichostrongylus, Chabertia, Oesophagostomum, Hyostrongylus, Nematodirus, Toxocara и Cooperia. Скрытые антигены могут быть получены при использовании многочисленных представителей указанных гельминтов.
Предпочтительными являются так называемые антигены широкого спектра, которые способны стимулировать протективный иммунный ответ хозяина не только к тому гельминту, из которого они были получены, но и по отношению ко многим другим паразитическим гельминтам.
Скрытые антигены, используемые в соответствии с настоящим изобретением, могут представлять собой интегральные мембранные белки, изолированные из кишечника гельминтов, в том числе, например, ферменты, структурные белки или какие-либо другие функциональные белки, необходимые для сохранения и/или развития гельминтов, например белки, задействованные в работе механизмов питания гельминтов. К таким белкам относятся, в частности, ферменты, например протеазы или экзо- и эндопептидазы, расщепляющие поступившие в кишечник гельминта белки до свободных аминокислот.
Подходящими скрытыми антигенами являются, как указано выше, антигены H110D, полученные в виде рекомбинантных белков, как описано в заявке WO 93/23542. Заслуживают внимания и белковый комплекс H45, описанный в заявке WO 90/11086, а также антигены, описанные в заявке WO 94/02169. В последнем случае антигены представляют собой интегральные мембранные белки, имеющие природную локализацию в кишечнике паразита и способные связывать пепстатин, лектины земляного ореха, зародышей пшеницы и другие лектины, специфичные для β-связанного-N-ацетилгалактозамина. Указанные антигены могут быть протеолитическими ферментами, в частности ферментами, имеющими активность аспартил-протеазы и/или нейтральной эндопептидазы. Особое значение могут иметь антигены H-gal-GP и O-gal-GP, подробно описанные в заявке WO 94/02169.
Антигены и их ферменты, предшественники и функционально эквивалентные варианты и производные могут представлять собой нативные антигены, изолированные непосредственно из гельминтов, а также могут быть получены с помощью технологии рекомбинантной ДНК при использовании стандартных методик, например, описанных Sambrook et al., 1989 (Молекулярное клонирование, лабораторное руководство, 2-е издание, издательство Колд-Спринг-Харбор), или же путем химического синтеза, такого как хорошо известная методика твердофазного синтеза Меррифилда.
Вакцинная композиция, вводимая животным, может быть поливалентной, содержащей ряд антигенных компонентов, например, тех, которые активны в отношении многих видов гельминтов.
Вакцинная композиция по изобретению может быть приготовлена с помощью методов, хорошо известных в производстве вакцин. Традиционные прописи вакцин включают в себя один или более антигенов или антител в соответствии с изобретением, при необходимости с добавлением одного или более подходящих адъювантов, например гидроксида алюминия, калиево-алюминиевых квасцов, сапонина или его производных, мурамилдипептида, минеральных или растительных масел, N AGO, Novasomes или неионных блок-сополимеров DEAE-декстрина или контролируемой системы высвобождения и доставки антигена, такой как биологически деградируемые микрочастицы, а также фармацевтически приемлемых носителей или растворителей. К подходящим носителям относится жидкая среда, например физиологический раствор, пригодный для введения пептидов или полипептидов в организм человека или животного. В состав вакцины могут быть включены дополнительные композиции, например консерванты.
Альтернативная вакцинная композиция может содержать вирус или клетки хозяина, например микроорганизм, который может быть живым, убитым или аттенуированным, содержащим вставки в молекуле нуклеиновой кислоты (например, ДНК) для стимуляции иммунного ответа, направленного по отношению к полипептидам, кодируемым измененной вставками молекулой нуклеиновой кислоты.
Введение вакцинной композиции может осуществляться любым удобным способом, например через рот или парентерально, внутримышечной, подкожной или внутрикожной инъекцией. Инъекция в большой степени предпочтительнее.
Более детально изобретение будет описано ниже в отношении предотвращения "околородового роста" Haemonchus у овец с помощью антигена H110D. При том, что изобретение в целом не ограничивается указанным выше аспектом, следует понимать, что применение антигенов Haemonchus для предупреждения околородового роста у овец паразитов Haemonchus, при котором наблюдается усиленный выход с фекалиями яиц паразитов, является только одним из предпочтительных вариантов изобретения.
Фиг. 1 иллюстрирует количество яиц паразитов в фекалиях (тысячи яиц на 1 г фекалий) у вакцинированных и невакцинированных беременных и небеременных овец, которым вводили инфекционные личинки Haemonchus на 110-й день беременности.
Группа D - 17 беременных овец, вакцинированных H110D и клостридиальной вакциной (COVEXIN 8).
Группа E - 18 беременных овец, вакцинированных H110D.
Группа F - 5 небеременных овец, вакцинированных H110D и COVEXIN 8.
Группа G - 3 небеременных овцы, вакцинированных H110D.
Группа C - 17 беременных овец, вакцинированных ферритином в качестве контроля.
Стрелками обозначено время вакцинации.
Фиг. 2 иллюстрирует защитное действие по отношению к Haemonchus передаваемых с молозивом материнских антител к H110D у ягнят в возрасте 5 недель с течением времени (в днях после средней даты рождения ягнят). Учитывалось количество яиц в фекалиях (тысячи яиц на 1 г фекалий).
Пример 1.
Назначение примера.
(1) Показать эффективность H110D вакцины в контролировании выхода яиц паразитических червей, связанного с инфицированием овец H. contortus в течение околородового периода.
(2) Путем определения уровня антител у беременных и небеременных овец показать влияние беременности на иммуногенность антигена H110D.
(3) Показать влияние клостридиальной вакцины COVEXIN 8 на эффективность вакцины H110D при совместном введении. Совместимость существующих бактериальных вакцин с новыми паразитарными вакцинами является необходимым условием успешного применения последних на практике.
Введение.
Настоящее исследование показывает эффективность вакцины H110D в контролировании выхода яиц паразитических червей у овец-двухлеток, дважды вакцинированных до оплодотворения и бустированных во время беременности и получавших определенную дозу инфекционных личинок H. contortus в течение последнего триместра беременности. Указанных овец-двухлеток сравнивали с контрольными вакцинированными небеременными животными разного возраста (табл. 1).
Методика и описание эксперимента.
Шестидесяти овцематкам вводили левамизол (NILVERM GOLD) для изгнания возможных червей и помещали в загоны, начиная с первых чисел сентября. По истечении минимального семидневного периода акклиматизации овец произвольным образом разделили на три группы A, B и C, содержащие 35, 8 и 17 животных соответственно. Овцы в группах A и B были вакцинированы препаратом H110D (день -40), в то время как животные группы C получали ферритин в качестве контроля. Через 30 дней (день -10) проводили вторую вакцинацию и затем животных сразу же разделяли еще на одни группы: овец группы A - на новые группы D и E, а животных группы B с образованием групп F и G. Во время последней недели октября баранов ссаживали с овцематками в группах C, D и E, чтобы средняя дата оплодотворения по группе была как можно ближе ко дню "0", а предполагаемое время окота пришлось на последнюю неделю марта - первую неделю апреля. К овцам в группах F и G не подпускали баранов, чтобы оставить их в качестве контрольных вакцинированных небеременных животных. Примерно через шесть недель баранов удаляли из загона, и всем овцам разрешали собраться в одно стадо. На 80-й день всем животным вводили ивермектин (ORAMEC DRENCH) для того, чтобы изгнать всех взрослых червей и задержать развитие личинок, и помещали их в кошару. Третью вакцинацию препаратом H110D проводили всем овцам в группах D, F, E и G на 90-й день (90 дней беременности ± 10 дней). Животные групп D и F в это же время получали также инъекцию препарата COVEXIN 8. На 110-й день беременности ± 10 дней всем животным вводили примерно 10000 инфекционных личинок H. contortus. Количество нематод определяли в образцах фекалий. Отсутствие возможного подавления иммунного ответа на скрытый антиген H110D во время беременности выявляли по уровню антител (табл. 2).
Исследуемые материалы.
Описание.
Вакцину против Haemonchus contortus (H110D) получают из Института физиологии животных и генетических исследований в Бабрахэме, Кембридж. Для первой вакцинации используют полный адъювант Фрейнда в комплексе с гидроксидом алюминия (ПАФ/Al/OH/3), а для второй и третьей вакцинации - неполный адъювант Фрейнда в комплексе с гидроксидом алюминия (НАФ/Al/OH/3).
Контрольную вакцину на основе ферритина лошади получают из Института физиологии животных и генетических исследований в Бабрахэме, Кембридж. Используют те же самые адъюванты, что описаны выше.
Исследование паразитов.
Виды и штаммы.
В исследованиях используют бензимидазол - устойчивый штамм H. contortus (штамм H/CR). Он получен из личинок третьей стадии развития в Центральной ветеринарной лаборатории, Уэйбридж. Устойчивость к бензимидазолу определяют по тесту на жизнеспособность яиц с последующим проверочным тестом /Caw thorne RJG and Cheong FH 1984, Veterinary Record 114:562).
Культуры личинок.
Достаточное количество личинок третьей стадии развития получают путем пассирования в организме ягнят, свободных от взрослых червей. Содержащие яйца фекалии собирают и культивируют до инфекционной стадии. Инфекционные личинки собирают и очищают в аппарате Бермана.
Инфекционные дозы.
Инокулят, содержащий около 10000 инфекционных личинок, готовят методом стандартных разведений. Личинок вводят через рот с помощью чистых пластмассовых трубок.
Контрольное заражение.
Для проведения контрольного заражения на последнем триместре беременности всем овцам-двухлеткам вводили ивермектин (ORAMEC DRENCH) для изгнания возможных червей и сразу же на 80-й день помещали в кошару. Все овцы-двухлетки получали около 10000 инфекционных личинок H. contortus на 110 день беременности, которые использовались для имитации развития околородового подъема.
Постановка эксперимента.
Контроль статистической ошибки.
Всех овец-двухлеток случайным образом объединяли в группы на основе массы тела в определенное время.
Процедура вакцинации.
Овец-двухлеток в группах A и B вакцинировали путем внутримышечной инъекции в задние ноги (1 мл в ногу, в целом 2 мл) 150 мкг антигена H. contortus (H110D), на 40-й день и затем в передние ноги (1 мл в ногу, в целом 2 мл) на 10 день. На 90-й день после формирования групп D, E, F и G все овцы в этих четырех группах получали третью дозу вакцины путем внутримышечной инъекции в задние ноги (процедуру осуществляют как и в случае первой инъекции). Одновременно животным в группах D и F вводили подкожно в шею (согласно инструкции производителя) клостридиальную вакцину COVEXIN 8. Овцы в группе C оставались контрольными и получали инъекции ферритина лошади (процедура и объем препарата такие же, как в случае вакцины H110D) на -40-й день, -10-й день и 90-й день и COVEXIN 8 (подкожно) на 90-й день.
Оценка защитного действия вакцины.
Определение количества яиц в фекалиях.
Образцы фекалий отбирались у всех овец через прямую кишку с недельными интервалами примерно в течение 6 недель перед окотом до получения выводов исследования. Количество яиц в фекалиях подсчитывали с помощью метода Mc. Мастера с точностью до 10 яиц на грамм фекалий (я/г). Образцы фекалий культивировали каждые две недели в течение 7 дней при 27oC для идентификации личинок и подтверждения чистоты контрольного заражения.
Антительный ответ после вакцинации.
Образцы крови отбирали у всех овец из яремной вены в обыкновенные пробирки для крови каждые две недели после первой вакцинации. Для получения контрольных сывороток отбирали кровь в день первой иммунизации. Уровень антител измеряли методом ELISA.
Результаты.
Результаты исследований приведены на фиг. 1. Они явным образом показывают, что в организме невакцинированных беременных овец (группа C) образуется большое количество яиц нематод во время периода, предшествующего рождению ягнят после искусственного заражения. В фекалиях всех вакцинированных животных обнаруживается значительно меньшее количество яиц. Защитный эффект не был снижен у животных, которые получали еще и клостридиальную вакцину.
В табл. 3 приведены результаты ELISA по определению содержания антител в крови исследованных животных. Можно видеть, что уровень антител у всех вакцинированных животных был выше по сравнению с контрольными невакцинированными животными. Содержание антител в крови вакцинированных беременных и небеременных овец было сходным, подтверждая отсутствие подавления антительного ответа на скрытые антигены. Введение клостридиальной вакцины COVEXIN 8 совместно с основной не влияло на образование антител.
Пример 2.
Передача опосредованного H110D иммунитета с молозивом.
Цель эксперимента.
Цель эксперимента состоит в том, чтобы подтвердить возможность защиты молодых ягнят путем передачи иммунитета через молозиво. Соответственно, защитное действие иммунитета определяли у ягнят примерно 5-недельного возраста, питающихся молоком овцематок, иммунизированных H110D. В качестве контроля использовали ягнят, родившихся у неиммунизированных овцематок. Защитное действие выявляли по уменьшению количества яиц в фекалиях и взрослых червей после контрольного заражения.
Описание эксперимента.
Методика в целом приведена в табл. 4.
Подробная схема иммунизации беременных овец H110D описана в примере 1. Сначала было отобрано 10 ягнят от иммунизированных H110D овцематок и 10 контрольных ягнят в возрасте 2-3 недель. Сыворотку крови указанных животных исследовали методом ELISA для определения уровня антител к H110D. Затем отобрали 6 ягнят с наиболее высоким уровнем антител от иммунизированных овец и 6 контрольных ягнят сходного возраста. Указанным животным в возрасте 8-11 недель вводили 3000 личинок H. contortus (штамм H/CR). У 8-11-недельных ягнят в фекалиях определяли количество яиц паразитов. В возрасте 11 недель ягнят забивали, и в трупном материале выявляли количество взрослых червей.
Результаты.
Передача анти-H110D-антител с молозивом была выявлена по их высокому уровню в сыворотке крови 6 ягнят, родившихся от иммунизированных H110D овцематок (см. табл. 5). В противоположность этому у контрольных ягнят не были выявлены анти-H110D-антитела.
Разведение сыворотки составляет 1/1000.
Общее количество яиц гельминтов в фекалиях ягнят 8-11-недельного возраста от иммунизированных овцематок было примерно на 50% меньше (P < 0,05) по сравнению с контрольными (см. фиг. 2), что соответствовало и меньшему содержанию самок взрослых червей (см. ниже). Среднее количество червей в организме ягнят через 5 недель после контрольного заражения приведено в табл. 6.
Уменьшение количества взрослых червей не было существенным (P > 0,05). Однако было выявлено значительное уменьшение соотношения самки/самцы (P < 0,05), что отражает эффективность иммунизации с помощью H110D у более взрослых ягнят.
Выводы.
У ягнят, родившихся от иммунизированных H110D овцематок и вскормленных ими, был выявлен значительный уровень антител к H110D, обусловленный их передачей с молозивом.
Указанные антитела обеспечивают защитное действие, которое проявляется в уменьшении количества яиц гельминтов в фекалиях и взрослых червей после контрольного заражения ягнят в возрасте 5 недель.
Изобретение касается предотвращения гельминтных инвазий у сельскохозяйственных животных. Способ включает иммунизацию самок перед случкой и/или до начала третьего триместра беременности по крайней мере однократно гельминтной вакциной. Вакцина содержит скрытый антиген гельминтов или антигенные фрагменты, предшественники, функционально-эквивалентные производные или варианты антигена, обладающие иммуногенной активностью в отношении одного или более паразитических гельминтов. В частности, вакцина содержит из антигенов интегральный мембранный антиген кишечника, или фермент, или транспортный белок: H110D, Н45, H-gal-GP, O-gal-GP. Иммунизация животных на ранних стадиях беременности позволит контролировать "околородовый рост" гельминтов и уменьшить вероятность инфицирования восприимчивых молодых животных в послеродовой период. Изобретение имеет особое значение для борьбы с "околородовым ростом" паразитической нематоды Halmonchus у овец, а также с остертагиозом типа II. 13 з.п.ф-лы, 6 табл., 2 ил.
| Домовый номерной фонарь, служащий одновременно для указания названия улицы и номера дома и для освещения прилежащего участка улицы | 1917 |
|
SU93A1 |
| Пожарный двухцилиндровый насос | 0 |
|
SU90A1 |
| Экономайзер | 0 |
|
SU94A1 |
| Пожарный двухцилиндровый насос | 0 |
|
SU90A1 |
