СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПЕРЕКРЕСТНОРЕАГИРУЮЩИХ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МЕЛИОИДОЗА, САПА, ЧУМЫ, ТУЛЯРЕМИИ И ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2006 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к медицине и касается разработки эффективного способа выявления у Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei, Yersinia pestis, Francisella tularensis и Mycobacterium tuberculosis общих и перекрестнореагирующих антигенов с одновременным определением их основных физико-химических характеристик. Данное направление обусловлено проявлением перекрестного иммунитета при вакцинации указанными микроорганизмами экспериментальных животных, а также отсутствием должной специфичности идентификационных иммунодиагностических методов за счет общности антигенных эпитопов клеток указанных видов микроорганизмов.

Известны различные способы обнаружения перекрестнореагирующих антигенов. Так, при помощи реакции агглютинации были отмечены положительные серологические реакции мелиоидозной сыворотки с Pseudomonas aeruginosa (Legroux R., Blanc G. Nouveaux elemants de rapprochement des bacillus de la morve de Whitmore et pyocynique// Ann. Inst. Pasteur. - 1943. - V.69. - P.49-52). Применение преципитирующих сывороток в реакции иммунодиффузии и иммуноэлектрофорезе позволили обнаружить при исследовании культур возбудителя мелиоидоза два общих с возбудителем чумы антигена (Fournier J., Dodin A. Les communautes antigeniques du bacille de la morve. Essai d'analise par immunofluorescens// Bull. Soc. Path. Exot. - 1971. - V.64. - P.832-836).

Известен также способ выявления перекрестнореагирующих антигенов возбудителя мелиоидоза с возбудителями сапа, туляремии, чумы, псевдотуберкулеза, холеры, бруцеллеза, а также с тканями чувствительных к мелиоидозу животных, для чего были использованы преципитирующие иммунные сыворотки в реакции иммунодиффузии в геле и иммуноэлектрофорезе (Гонтарь И.П., Фарбер С.М., Ефременко В.И. и др. К природе антигенов Pseudomonas pseudomallei, общих для некоторых видов микроорганизмов//Журн.микробиол., эпидемиол., иммунобиол. - 1984. - №3. - С.55-57).

Наиболее близким решением является способ выявления индивидуальных, общих и перекрестнореагирующих антигенов у P.pseudomallei, P.cepacia, P.aeruginosa, P.fluorescens и P.stutzeri при помощи двумерного иммуноэлектрофореза (Пивень Н.Н. Перспективы исследования общих, перекрестнореагирующих и видовых антигенов у некоторых видов бактерий рода Pseudomonas//Микробиол. журнал. - 1987. - Т.49. - №3. - С.6-10). В прототипе автором предложена схема поиска общих, видовых и перекрестнореагирующих антигенов указанных выше видов микроорганизмов, включающая в себя перекрестные постановки иммунологических реакций с гомологичными и гетерологичными сыворотками и анализ их идентичности по электрофоретической подвижности; при этом были установлены видовые, общие и перекрестнореагирующие антигены.

Однако, как в аналогах, так и в прототипе, описаны приемы выявления перекрестнореагирующих антигенов, не позволяющие в рамках одного исследования определить их истинное количество, химическую природу, молекулярную массу и специфическую адсорбционную способность, являющуюся одним из доказательных факторов наличия общих антигенных эпитопов.

Целью изобретения является разработка высокочувствительного способа выявления кластера перекрестнореагирующих антигенов возбудителей мелиоидоза, сапа, чумы, туляремии и туберкулеза с одновременным установлением их основных физико-химических характеристик, являющихся базовыми для последующего методического подхода при препаративном получении отдельных антигенных комплексов - потенциальных кандидатов для конструирования иммунопрофилактических и иммунодиагностических средств.

Цель достигается тем, что проводят адсорбцию перекрестнореагирующих антигенов на иммунокомплексоне. Комплексон готовят путем добавления 270 мг Al(ОН)₃ в 10 мл бидистиллированной воды и перемешивания. Полученную суспензию в объеме 200 мкл вносят в пробирки типа "Eppendorf" и добавляют 200 мкл препарата IgG против B.pseudomallei 100, с концентрацией 32.5 мг/мл (Berggiust, Schilling. Preparation of antihuman immunoglobulin for indirect fluorescent tracing of antibodies//Standartisation in immunofluorescence. Oxford. - 1970. - P.19-65). После экспозиции в течение 16 ч при 4°С центрифугируют при 1000 об/мин (ротор r-9 см) в течение 15 мин, надосадок удаляют.В пробирки, содержащие осадок комплексона, добавляют 100 мкл антигенного препарата исследуемых бактерий, представляющего собой водносолевой экстракт антигенов изучаемых видов микроорганизмов, перемешивают и выдерживают при 4°С в течение 16 ч. Далее, по 70 мкл надосадка переносят в чистые пробирки и добавляют равное количество 10% препарата стафилококкового реагента, содержащего белок А, для осаждения свободных от комплексона IgG. Выдерживают в течение 16 ч при 4°С и центрифугируют при 5000 об/мин 20 мин. Образовавшийся супернатант переосаждают двумя объемами охлажденного ацетона (-20°С), подсушивают при комнатной температуре и растворяют в 50 мкл буфера. Полученные адсорбированные антигенные препараты исследуют в 11% ДСН-ПААГ электрофорезе. Критерием выявления перекрестнореагирующих антигенов является исчезновение или резкое уменьшение интенсивности электрофоретических полос антигенов адсорбированных ВСЭ в сравнении с контрольными (неадсорбированными) препаратами ВСЭ.

Пример 1. Получение водносолевых экстрактов изучаемых видов микроорганизмов.

В работе используют следующие штаммы возбудителей: B.mallei 10230, Ц-5М, В-120; B.pseudomallei 100, 111, 57576, 100-16-1 - авирулентный мутант, дефектный по гликопротеину 200 kDa; В. thailandensis E251, 264, 265, 295, 299; Y.pestis 231, EV; F. tularensis 15 НИИЭГ, 503; M. bovis (БЦЖ), M.tuberculosis H37Rv.

Для инкубирования буркхольдерий (37°С, 48 ч) используют Nutrient Broth и Nutrient Agar ("Difco"). Штаммы возбудителя чумы выращивают на агаре и бульоне Хоттингера рН 7.2 (28°С, 48 ч). F.tularensis инкубируют на агаровой среде с сердечно-мозговым экстрактом ("Difco") с добавлением цистеина 0.1%, глюкозы 1% и дефибринированной крови кролика 5-7%, микобактерии туберкулеза - на среде Bacto Middlebrook Agar 711-10 ("Difco") в течение 9 сут при 37°С в атмосфере 5% CO₂.

Выращенную биомассу инактивируют и высушивают охлажденным до -30°С ацетоном. Сухие клетки в количестве 50.0 мг суспендируют в 3.5 мл 0.15 М раствора NaCl с фосфатным буфером рН 7.2. Суспензию гомогенизируют на магнитной мешалке в течение 3 ч при температуре 4°С, после чего при помощи дезинтегратора Artek-150 ("Artek", США) подвергают воздействию ультразвука частотой 20 кГц и мощностью 75 Вт в течение 3 мин трехкратно с охлаждением, осаждают центрифугированием при 20000 g в течение 1 ч при 4°С. Супернатант отделяют и фильтруют через мембрану ДР-0.45 ("Amicon"), концентрируют и диализуют против дистиллированной воды на мембране РМ-10. Полученный водно-солевой экстракт исследуют на наличие перекрестнореагирующих антигенов.

Пример 2. Дифференциальная адсорбция перекрестнореагирующих антигенов на комплексоне IgG против В. pseudomallei 100×Al(ОН)₃.

Для выявления перекрестнореагирующих антигенов используют препараты водно-солевых экстрактов исследуемых видов микроорганизмов: B.pseudomallei 100, В. mallei 10230, B.thailandensis E299, Y. pestis EV, F. tularensis 15, M.tuberculosis H37RV.

Для адсорбции водно-солевых экстрактов используют IgG против В. pseudomallei 100×Al(ОН)₃ комплексен, приготовление которого и методика адсорбции описаны выше. На 11% ДСН-ПААГ наносят параллельно по 10-15 мкл адсорбированных и неадсорбированных препаратов водно-солевых экстрактов исследуемых видов бактерий и проводят электрофорез (Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. - Nature. - 1970. - V. 227. - P.680-685). Электрофорез проводят при стабилизированном токе 5 mA в течение 18 ч. В качестве эталонов молекулярных масс используют наборы маркерных белков 10-78 кД (LKB) и 25-92.5 кД (Serva). Окрашивание электрофореграмм проводят с помощью кумасси бриллиантового синего G-250 (Serva).

Далее проводят компьютерный анализ электрофореграмм, который позволяет установить, что мелиоидозные IgG перекрестно реагируют с антигенами возбудителя чумы (протеины с молекулярной массой 44, 42, 38, 32, 23 и 19 кД), возбудителя туляремии (34 и 30 кД) и возбудителя туберкулеза (81, 46, 29, 17 и 15 кД). Что касается близкородственных видов В. mallei и B.thailandensis, то их антигенный спектр весьма схож с B.pseudomallei, однако данный методический подход позволяет выявлять у них и индивидуальные протеиновые антигены (см. чертеж). Примененный высокочувствительный метод детекции перекрестнореагирующих антигенов позволяет достаточно точно определить их количественный состав и молекулярные массы. В качестве верификационного теста применяют иммунноблоттинг.

Таким образом, предлагаемый способ выявления перекрестнореагирующих антигенов возбудителей мелиоидоза, сапа, чумы, туляремии, туберкулеза позволяет достоверно с высокой чувствительностью выявлять не только перекрестнореагирующие, но и общие, и индивидуальные антигены, что делает возможным конструирование адекватных иммунодиагностических препаратов, а также использование отдельных антигенов в составе химической вакцины, возможно, универсальной для указанной группы возбудителей инфекционных заболеваний.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, а именно к разработке эффективного способа выявления у Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei, Yersinia pestis, Francisella tularensis и Mycobacterium tuberculosis общих и перекрестнореагирующих антигенов с одновременным определением их основных физико-химических характеристик. Сущность изобретения состоит в том, что проводят адсорбцию перекрестнореагирующих антигенов на иммунокомплексоне IgG×Al(OH)₃ с дополнительным осаждением IgG стафилоккоковым реагентом с протеином А и последующим определением молекулярных масс перекрестнореагирующих антигенов путем анализа полученных адсорбированных и неадсорбированных препаратов в ДСН-ПААГ электрофорезе и иммуноблоттинге. Техническим результатом является разработка высокочувствительного способа выявления кластера перекрестнореагирующих антигенов возбудителей мелиоидоза, сапа, чумы, туляремии и туберкулеза с одновременным установлением их основных физико-химических характеристик. 1 ил.

Способ выявления перекрестнореагирующих антигенов возбудителей мелиоидоза, сапа, чумы, туляремии и туберкулеза, включающий получение антигенного препарата исследуемых бактерий, специфическую адсорбцию, ДСН-ПААГ электрофорез, отличающийся тем, что для эффективного выявления перекрестнореагирующих антигенов адсорбируют антигенный препарат исследуемых бактерий на иммунокомплексоне, приготовленном на бидистиллированной воде путем смешивания 200 мкл суспензии Al(ОН)₃ в концентрации 27 мг/мл и 200 мкл препарата IgG против В. pseudomallei 100 в концентрации 32,5 мг/мл, выдерживают 16 ч при 4°С, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 15 мин, к осадку комплексона добавляют 100 мкл антигенного препарата исследуемых бактерий, экспонируют в течение 16 ч при 4°С, к 70 мкл надосадка добавляют равное количество 10% стафилококкового реагента, содержащего белок А, после экспозиции в течение 16 ч при 4°С препарат центрифугируют при 5000 об/мин 20 мин, супернатант переосаждают охлажденным ацетоном (-20°С) и анализируют в ДСН-ПААГ электрофорезе параллельно с неадсорбированным антигенным препаратом исследуемых бактерий, по разнице антигенного состава устанавливают наличие перекрестнореагирующих антигенов.