СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА ПРЕЦИПИТИРУЮЩЕЙ АНТИСЫВОРОТКОЙ Российский патент 2007 года по МПК A61K39/00 G01N33/00 

Изобретение относится к медицине и касается лабораторной диагностики возбудителей особо опасных инфекций сапа (Burkholderia mallei) и мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei).

Микроорганизмы В.mallei и В.pseudomallei имеют важное медицинское значение, так как являются возбудителями тяжелых заболеваний человека и животных - сапа и мелиоидоза. Их относят ко второй группе бактериологической опасности. Изучение патогенных свойств В.mallei и В.pseudomallei выявило значительные отличия в инфекционном процессе, вызванном этими микроорганизмами. Различаются возбудители сапа и мелиоидоза по чувствительности к антибактериальным препаратам. Однако по антигенному составу, по многим фенотипическим признакам - это очень схожие микроорганизмы. Неоднократно высказывалось предложение считать возбудителей сапа и мелиоидоза биоварами одного вида. Поэтому диагностика этих видов идентична до установления факта, что исследуемый микроорганизм относится к группе pseudomallei (в нее входят возбудители сапа и мелиоидоза). Далее, для определения вида применяют бактериологические методы, основанные на различиях в фенотипических свойствах бактерий В.pseudomallei и В.mallei. Возбудитель мелиоидоза способен расти на твердых питательных средах при температуре 42°С и при концентрации в питательной среде антибиотика гентамицина более 4 мкг/мл. Возбудитель сапа при этих условиях не растет. Возбудитель мелиоидоза, имея на поверхности клетки жгутик (лофотрих), подвижен. В.mallei неподвижен, так как не имеет жгутиков (Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы, М.: Наука, 1994 г.)

Микроорганизмы Burkholderia thailandensis, ранее называемые B.pseudomallei like spp., по фенотипическим признакам, в том числе и по составу клеточных антигенов, очень близки B.pseudomallei. В 1995 году P.Brett и соавт. на основе стабильных дифференцирующих признаков (авирулентности к морским свинкам и ассимиляции L-арабинозы (Vir^- и Ara⁺)) в сочетании с наличием минорных различий нуклеотидных последовательностей при секвенировании фрагментов 16SpPHK отнесли микроорганизмы B.pseudomallei like spp к отдельному виду B.thailandensis.

Ранее антисыворотки против клеточных антигенов В.mallei и B.pseudomallei применяли в диагностике этих микроорганизмов на основе различных серологических реакций (агглютинации, реакции связывания комплемента, реакции непрямой гемагглютинации). Однако дифференцировать B.mallei и B.pseudomallei при этом не удалось. Применение иммунолюминесцентного метода на основе полученной по гибридомной технологии антисыворотки (моноклональные антитела) против клеточного антигена B.mallei позволили дифференцировать возбудителей сапа и мелиоидоза (Сап//Сборник научных трудов под редакцией Н.Г.Тихонова/ Волгоград: Нижневолжское кн. из-во, 1995 г. - 128 с.).

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа дифференциации является способ дифференциации этих видов бактерий мелиоидозной антижгутиковой сывороткой в реакции агглютинации, описанный в ряде статей Алексеева В.В, Бондарева И.Н., Зыкина Л.Ф. под общим названием «Индикация возбудителя мелиоидоза на основе антител к жгутиковому антигену», опубликованных в сборнике «Вопросы противоэпидемической защиты» НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. - 1977 г., вып.27. - С.54-71. Для постановки реакции агглютинации авторами была применена кроличья мелиоидозная антисыворотка, полученная иммунизацией кроликов-продуцентов сыворотки трудновыделяемыми жгутиками бактериальных клеток B.pseudomallei. С целью повышения специфичности сыворотку адсорбировали ацетонвысушенными клетками B.mallei и гомологичного штамма. Эти манипуляции значительно усложняют процесс производства диагностического препарата и сам способ.

Целью изобретения является разработка способа дифференциации возбудителей сапа B.mallei и мелиоидоза B.pseudomallei приципитирующей антисывороткой.

Поставленная цель достигается постановкой реакции иммунодиффузии в геле с живыми культурами анализируемых штаммов B.mallei и B.pseudomallei и использованием в качестве иммунной сыворотки полученную кроличью антисыворотку против внеклеточных антигенов штамма Burkholderia thailandensis 264.

Анализируемые штаммы В.mallei, B.pseudomallei сеют бляшками на чашки с твердой питательной средой (F - агар "Difco"), инкубируют в течение 18 ч при 37°С. В агаре около выросших бляшек пробивают лунки и вносят в них кроличью антисыворотку против внеклеточных антигенов штамма В.thailandensis 264. Результаты реакции учитывают после экспозиции чашек 18 часов при 24°С. Наличие между бляшками посеянных культур и лунками с антисывороткой линий преципитации указывает на посев бактерий B.pseudomallei. Отсутствие этих линий выявляет штаммы B.mallei. Антисыворотку получают иммунизацией кроликов внеклеточными антигенами штамма В.thailandensis 264, которые являются фильтратами от смыва бактериальной массы, выращенной на твердой питательной среде, покрытой целлофаном. Фильтраты стерилизуют в два этапа на мембранных фильтрах (размер пор 0,45 мкм и 0,22 мкм). Внеклеточные компоненты фильтратов осаждают ацетоном, высушивают и используют для иммунизации кроликов. Активность сывороток оценивают в реакции иммунодиффузии в геле. Кровь забирают при титре сыворотки равном или более 1:32.

Примеры конкретного выполнения, которые подтверждают осуществление предлагаемого способа.

Пример 1. Получение внеклеточных (экзоцеллюлярных) антигенов (ЭЦА) бактерий штамма B.thailandensis 264.

Для получения ЭЦА клетки штамма B.thailandensis 264 выращивают на твердой питательной среде (F-агар "Difco") в течение 18 часов при температуре 37°С, готовят из них 1 млрд взвесь в 0,9% растворе NaCl pH 7,0. Затем твердую питательную среду (F-агар "Difco") стерильно заливают в стерилизатор (из нержавеющей стали), покрывают стерильным целлофаном и сверху наносят 3 мл ранее полученной взвеси бактерий B.thailandensis 264. Стерилизатор помещают на 18 часов в термостат с температурой 37°С. Выращенные на целлофане клетки смывают 12 мл 0,9% раствора NaCl pH 7,0, осторожно перемешивают их до получения гомогенной смеси. Эту взвесь бактерий центрифугируют 25 мин при 8000g. Супернатант отбирают и фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм для удаления оставшихся бактериальных клеток. Окончательную стерилизацию проводят на фильтре с размером пор 0,22 мкм. ЭЦА осаждают ацетоном при конечной концентрации растворителя 75%. Контроль стерильности проводят бактериологическим и биологическим методами. Осадок, представленный внеклеточными антигенами, освобождают от ацетона центрифугированием 25 мин при 8000g и высушивают под тягой. Высушенные фильтраты хранят в холодильнике при +4°С.

Пример 2. Иммунизация кроликов внеклеточными антигенами штамма B.thailandensis 264.

Для получения гипериммунных сывороток используют кроликов массой 2-3 кг в возрасте до двух лет. Животных иммунизируют за два цикла введений антигена. Для одного введения используют 2 мл смеси раствора внеклеточных антигенов B.thailandensis 264 в 0,9% NaCl, pH 7,2 (концентрация - 1,2 мг/мл) и неполного адъюванта Фрейнда ("Difco") в соотношении 1:1. Иммунизирующую смесь животному вводят путем инъекций паравертебрально внутрикожно по 0,2 мл в 10 точек. Интервалы между введениями составляют 7 суток, между циклами - 30 суток. Активность сывороток оценивают после каждого цикла в реакции двойной иммунодиффузии в геле с ЭЦА. Животных обескровливают при титре сыворотки, равном или более 1:32. В сыворотку для подавления роста микрофлоры добавляют мертиолят натрия в соотношении 1:10000. Часть сыворотки, ампулируемой по 0,2-0,5 мл, сублимационно высушивают, часть хранят в холодильнике при +4°С.

Пример 3. Дифференциация B.mallei и B.pseudomallei с использованием сыворотки против ЭЦА штамма B.thailandensis 264 в реакции иммунодиффузии с живыми культурами.

Для постановки реакции иммунодиффузии с живыми культурами анализирумые штаммы микрорганизмов В.mallei, B.pseudomallei и взятые в качестве положительного контроля четыре штамма B.thailandensis и в качестве отрицательного контроля клинический штамм Staphylococcus.aureus сеют бляшками на твердую питательную среду (F-агар "Difco") и помещают в термостат с температурой 37°С. Через 18 часов чашки вынимают из термостата и на расстоянии в 6,5 мм от выросших бляшек в агаре пробивают лунки диаметром 5 мм, в которые вносят антисыворотку. Через 18 часов выдерживания чашек с агаром при комнатной температуре производят учет результатов - фактов образования линий преципитации между лунками и бляшками культур. Для оформления протокола чашки с агаром фотографируют в проходящем свете. Из Фиг.1 и Фиг.2 видно, что линии преципитации образуются в агаре между лунками и бляшками штаммов B.pseudomallei и B.thailandensis (положительный контроль) и не образуются между лунками и бляшками штаммов В.mallei, S.aureus (отрицательный контроль).

Пример 4. Характеристика внеклеточных антигенов штамма B.thailandensis 264 методом электрофоретического анализа в ПААГ с ДСН.

Для анализа состава внеклеточных белков штамма B.thailandensis 264 проводят разделение их на фракции электрофорезом в 10% ПААГ с ДСН по Laemmli (1970 г.) в пластинах размером 6×8 см, толщиной 0,75 мм, используя прибор для вертикального электрофореза. При подготовке проб сухие фильтраты растворяют в лизирующем растворе рН-6,8 (0,0625М трисаминометан-Cl, 2% ДСН, 10% глицерин, 5% 2-меркаптоэтанол) в концентрации 8 мг/мл, кипятят 10 мин, центрифугируют 25 мин при 8000g. Супернатант используют в опытах. В качестве эталонов молекулярной массы используют набор маркерных белков фирмы Pharmacia (мол.м. от 14 до 94 kDa). Белки окрашивают красителем Кумасси ярко-голубым (СВВ G-250) и серебром (метод Oakley et al., 1980). Электрофореграммы фотографируют и денситометрируют. Анализ полученных электрофореграмм позволяет установить, что в составе белкового спектра внеклеточного фильтрата имеются 2 белковые фракции, окрашиваемые Кумасси G-250 с мол.м. 28 и 34 kDa (Фиг.3., трек 2). При применении метода окраски серебром выявляются две фракции с мол.м. 28 и 34 kDa, как и при окраске Кумасси, и две дополнительные фракции с мол. м. 18 и 24 kDa. Различия в количестве фракций связаны с тем, что метод окрашивания серебром позволяет окрашивать белки и липополисахариды. Окраска серебром значительно чувствительней окраски Кумасси.

Таким образом, разработан способ дифференциации B.mallei и B.pseudomallei, возбудителей сапа и мелиоидоза, относящихся к особо опасным инфекциям, за счет нового диагностического препарата - преципитирующей антисыворотки против внеклеточных антигенов B.thailandensis 264, который отличает простота исполнения, наглядность, отсутствие потребности в сложном оборудовании.

Изобретение относится к области биотехнологии. Постановку реакции иммунодиффузии в геле осуществляют с живыми культурами анализируемых штаммов В.mallei и B.pseudomallei и используют в качестве иммунной сыворотки полученную кроличью антисыворотку против внеклеточных (экзоцеллюлярных) антигенов (ЭЦА) штамма Burkholderia thailandensis 264. Анализируемые штаммы B.mallei, В.pseudomallei сеют бляшками на чашки с твердой питательной средой (F-агар «Difco»), инкубируют в течение 18 ч при 37°С. В агаре около выросших бляшек пробивают лунки и вносят в них кроличью антисыворотку против ЭЦА штамма В.thailandensis 264. Результаты реакции учитывают после экспозиции чашек 18 часов при 24°С. Наличие между бляшками посеянных культур и лунками с антисывороткой линий преципитации указывает на посев бактерий B.pseudomallei. Отсутствие этих линий выявляет штаммы B.mallei. Антисыворотку получают иммунизацией кроликов внеклеточными антигенами штамма В.thailandensis 264, которые являются фильтратами от смыва бактериальной массы, выращенной на твердой питательной среде, покрытой целлофаном. Фильтраты стерилизуют в два этапа на мембранных фильтрах (размер пор 0,45 мкм и 0,22 мкм). Электрофореграммы ЭЦА штамма В.thailandensis 264 после электрофореза имеют в своем составе 4 окрашиваемых серебром фракции (мол. м. 18, 24, 28 и 34 kDa). Внеклеточные компоненты фильтратов осаждают ацетоном, высушивают и используют для иммунизации кроликов. Активность сывороток оценивают в реакции иммунодиффузии в геле. Кровь забирают при титре сыворотки, равном или более 1:32. Способ отличается точностью и простотой исполнения. 1 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ дифференциации возбудителей сапа и мелиоидоза преципитирующей антисывороткой, включающий посев исследуемых штаммов Burkholderia mallei (возбудитель сапа) и Burkholderia pseudomallei (возбудитель мелиоидоза) бляшками на чашки Петри с твердой питательной средой, инкубацию в течение 18 ч при 37°С, внесение в пробитые в агаре около выросших бляшек микробов лунки антисыворотки, учет результатов после выдерживания 18-20 ч при 24°С, отличающийся тем, что для получения преципитирующей антисыворотки использованы внеклеточные (экзоцеллюлярные) антигены (ЭЦА) штамма Burkholderia thailandensis 264, состоящие из 4 окрашиваемых серебром фракций, выявляющихся после разделения в электрофорезе в ПААГ-ДСН (мол.м. 18, 24, 28 и 34 кДа), выделенные из смыва бактериальной массы, выращенной на агаре (F-arap «Difco»), покрытом целлофаном, в течение 18 ч при 37°С, очищенного от клеток центрифугированием при 8000g и фильтрацией через фильтр с размером пор 0,45 мкм, стерилизованного фильтрацией через фильтр с размером пор 0,22 мкм, и осажденные из смыва ацетоном (концентрация ацетона 75%), полученными ЭЦА иммунизируют кроликов в два цикла, которые включают 4-кратное в течение месяца введение антигена, каждое из которых имеет в сумме 2 мл смеси, состоящей из 1 мл раствора ЭЦА (1,2 мг/мл) и 1 мл неполного адъюванта Фрейнда, и состоит из инъекций по 0,2 мл внутрикожно паравертебрально в 10 точек каждому животному с интервалами между введениями - 7 сут, между циклами - 30 сут, кровь забирают при титре в реакции иммунодиффузии 1:32.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для дифференциации B.mallei и B.pseudomallei культуры этих микроорганизмов выращивают в течение 18 ч на F-агаре «Difco» при 37°С, затем в пробитые лунки рядом с исследуемыми культурами вносят преципитирующую антисыворотку против ЭЦА B.thailandensis 264, выдерживают при 24°С 18 ч, при этом в агаре между бляшками культур B.pseudomallei и лунками с антисывороткой образуются линии преципитации, между бляшками культур В. mallei и лунками с антисывороткой линии преципитации не образуются.