СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЯ ПАТОГЕННЫХ ОТ НЕПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ Российский патент 2010 года по МПК C12G1/04 G01N33/559 

Изобретение относится к медицине, лабораторной диагностике и касается обнаружения поверхностного антигенного комплекса 8 (Аг 8), являющегося одним из факторов патогенности возбудителей сапа (Burkholderia mallei) и мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei).

Изобретение может быть использовано для серологического дифференцирования патогенных В.pseudomallei и В.mallei от их непатогенных вариантов и других близкородственных буркхольдерий.

В последние годы интерес к этим видам микроорганизмов возрос в связи с их возможным использованием в качестве агентов биотерроризма категории В. Известно, что в почве и воде в эндемичных районах одновременно встречаются В.pseudomallei и близкородственный авирулентный вид В.thailandensis, что значительно затрудняет мониторинг за возбудителем мелиоидоза во внешней среде. Одним из признаков, позволяющих отличить эти два вида буркхольдерий, является наличие у В.pseudomallei поверхностного антигенного комплекса (Wuthiekanun V., Anuntagool N., White N.J. et al. Short report: a rapid method for the differentiation of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis // Am. J. Trop.Med. Hyg." 2002. - V.66, N6. - P.759-761). При эпидемиологических обследованиях природных объектов с помощью селективных питательных сред выделено большое число штаммов буркхольдерий, фенотипически и генотипически близких к В.pseudomallei и В.mallei, но в обычных условиях непатогенных для человека и животных. К ним относятся, наряду с В.thailandensis, микроорганизмы В.cepacia - комплекса и филогенетически им родственная Р.allicola (Илюхин В.И., Сенина Т.В., Плеханова Н.Г. и др. Burkholderia thailandensis: биологические свойства, идентификация и таксономическая позиция // Мол. генетика, микробиол., вирусол. - 2002. - №1. - С.7-11).

Ранее было установлено, что возбудители сапа и мелиоидоза близки по основным генотипическим и фенотипическим признакам, в том числе и по антигенной организации. Сравнительная оценка белкового состава бактерий мелиоидоза и сапа различной вирулентности позволила определить антигенные структуры, обусловливающие патогенетический эффект этих особо опасных возбудителей (Пивень Н.Н., Илюхин В.И. Патогенность Burkholderia pseudomallei как функция его внеклеточных и поверхностных антигенов // Журн. микробиол. - 2000.- №6. - С.94-99).

Установлено, что типичные вирулентные штаммы возбудителей мелиоидоза и сапа в отличие от авирулентных вариантов формируют капсулу, содержащую поверхностный антиген 8, обладающий катодной подвижностью, и проявляют высокую вирулентность за счет антифагоцитарной активности гликопротеина, эпитопы которого были обнаружены в ее составе (Пивень Н.Н., Алексеев В.В., Попов С.Ф. и др. Ультраструктурно-иммунохимическое изучение капсулы патогенных буркхольдерий // Журн. микробиол. - 2005. - №5. - С.19-24).

Для дальнейших исследований представляет интерес проводить первичный отбор перспективных капсульных иммуногенных с протективной активностью штаммов сапных и мелиоидозных бактерий от других видов буркхольдерий.

Близким решением является предложенная Пивень Н.Н. схема поиска общих, видовых и перекрестно-реагирующих антигенов указанных выше микроорганизмов, включающая в себя перекрестные постановки иммунологических реакций с гомологичными и гетерологичными сыворотками. Данная постановка иммунологической реакции длится не менее 24 ч и занимает иногда несколько суток (Пивень Н.Н. Перспективы исследования общих, перекрестнореагирующих и видовых антигенов у некоторых видов бактерий рода Pseudomonas // Микробиологический журнал, - 1987. - Т.49, №3. - С.19-24).

Способ выявления перекрестно-реагирующих антигенов возбудителей мелиоидоза, сапа, чумы, туляремии и туберкулеза в ДСН-ПААГ электрофорезе с одновременным определением их основных физико-химических характеристик был заявлен Пивень Н.Н. и соавт. (Пивень Н.Н., Тимошин В.Б., Алексеев В.В. и др. Способ выявления перекрестнореагирующих антигенов возбудителей мелиоидоза, сапа, чумы, туляремии и туберкулеза // Патент №2286576). Авторы указывают, что антигенный спектр близкородственных видов В.mallei и В.thailandensis весьма схож с В.pseudomallei, поэтому данный методический подход позволяет выявлять у них индивидуальные протеиновые антигены, но не дифференцировать их друг от друга.

Антиген 8 также выявляли при помощи сэндвич-варианта иммуноферментного метода, используя моноклональные антитела (Самыгин В.М., Храпова Н.П., Спиридонов В.А., Степин А.А. Биосинтез антигена 8 в процессе культивирования В.pseudomallei и В.mallei // Журн. микробиол. - 2001. - №4. - С.50-52). Авторы указывали на различия в интенсивности биосинтеза антигена 8 у патогенных буркхольдерий двух видов, близкородственные микроорганизмы при этом не исследовались.

Наиболее близким аналогом является изучение перекрестно-реагирующих антигенов у бактерий сапа и мелиоидоза и других возбудителей опасных инфекционных заболеваний, используя иммунные сыворотки к общеклеточным белкам В.pseudomallei и В.mallei с помощью двунаправленного ракетного иммуноэлектрофореза (РИЭФ). Авторы применяли буферный раствор, приготовленный из диэтилбарбитуровой кислоты, трис, лактата кальция и азида натрия с рН, равной 8,6. Ракетный иммуноэлектрофорез проводили с использованием системы охлаждения при 15°С в течение 18 ч, в градиенте потенциала 1,5 В/см. Затем выполняли процедуру отмывки, высушивания и окрашивания агарозных пластин. Показано, что белки мелиоидозных и сапных микроорганизмов в РИЭФ с гомологичными сыворотками формируют пики преципитатов как в катодной (4-5 пиков), так и в анодной (8-9 пиков) области геля. Однако сведения об антигенных взаимоотношениях В.pseudomallei, В.mallei, В.thailandensis, В.cepacia и В.gladioli отсутствуют (Изучение перекрестно-реагирующих антигенных комплексов патогенных буркхольдерий и других возбудителей опасных инфекционных заболеваний: Отчет о НИР (заключит.) / Волгогр. науч.-исслед. противочум. ин-т. - Волгоград, 2002. - №ГР 01.2.00 104720. - 44 с.).

Целью изобретения является разработка быстрого способа дифференцирования патогенных возбудителей мелиоидоза и сапа от непатогенных для людей буркхольдерий и близкородственных микроорганизмов.

Поставленная цель достигается выявлением в составе микробных клеток поверхностного антигенного комплекса (Аг 8) в ракетном иммуноэлектрофорезе с использованием сыворотки иммунной козьей, содержащей антитела к данному антигену, выделенному из В.pseudomallei 100 формамидом, с титром антител в РИД 1:16-1:32 (Пивень Н.Н., Авророва И.В., Жукова С.И. и др. Иммуногенность поверхностных и капсульных антигенов Burkholderia mallei // Журн. микробиол. - 2007. - №1. - С.47-52).

Авторами изобретения предпринимались попытки проводить дифференцирование патогенных буркхольдерий от непатогенных с помощью ракетного иммуноэлектрофореза, используя различные условия его постановки. Были испытаны несколько буферных растворов с ионной силой 0,016-0,032 (веронал-мединаловый с лактатом кальция, рН 8,6; мединал-солянокислый, рН 8,6; барбитал-трис-глициновый, рН 8,8). Варьировали величину напряженности электрического поля (2-12 В/см), длительность (2-18 ч), температуру (10-15°С).

В процессе исследований были подобраны следующие условия постановки РИЭФ: пластинку "GelBond" размером 8,5×10 см заливают 1% агарозой фирмы «Calbiochem», приготовленной на барбитал-трис-глициновом буфере с ионной силой, равной 0,016, рН 8,8. На расстоянии 3 см от края пластинки с анодной стороны пробивают ряд лунок диаметром 4 мм. Отступив 2 мм от лунок, вырезают полоску геля шириной 2,5 см. Гель растапливают на водяной бане, охлаждают до 48°С, добавляют к нему 0,5-2% по объему сыворотки, содержащей антитела к антигену 8, и снова заливают на пластинку. В лунки вносят исследуемый антигенный материал (взвесь высушенных ацетоном бактериальных клеток в физиологическом растворе, рН 7,2, или их водно-солевой экстракт). К краям геля прикладывают мостики из 6 слоев фильтровальной бумаги, обильно смоченные электродным буфером. Электрофорез проводят при ионной силе буферного раствора в электродных отсеках, равной 0,02, напряженности 10-12 В/см в течение 3,5-4 ч и температуре 12°С. После остановки электрофореза пластинки просматривают. Наличие пиков преципитатов в геле свидетельствует о присутствии антигенного комплекса 8 патогенных В.pseudomallei и В.mallei. Отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных штаммов.

Исследование по этому признаку штаммов с помощью ракетного иммуноэлектрофореза в данной модификации с антителами, полученными к антигену 8, может быть использовано при изучении антигенного материала количественно путем сравнения высоты пиков преципитатов исследуемого образца и контрольной пробы с известным содержанием Аг 8 при лабораторной диагностике сапа и мелиоидоза.

Примеры конкретного выполнения, подтверждающие осуществление предлагаемого способа.

Пример 1. Дифференцирование патогенных инкапсулированных штаммов (Аг 8⁺) В.pseudomallei и В.mallei от их бескапсульных вариантов (Аг 8⁺) и близкородственных буркхольдерий.

Ракетный иммуноэлектрофорез проводят на пластинке "GelBond" размером 8,5×10 см, которую заливают 1% агарозой фирмы «Calbiochem», приготовленной на барбитал-трис-глициновом буфере с ионной силой, равной 0,016, рН 8,8. На расстоянии 3 см от края пластинки с анодной стороны пробивают ряд лунок диаметром 4 мм. Отступив 2 мм от лунок, вырезают полоску геля шириной 2,5 см. Гель растапливают на водяной бане, охлаждают до 48°С, добавляют к нему 0,5-2% по объему сыворотки, содержащей антитела к антигену 8, и снова заливают на пластинку. В лунки вносят исследуемые микробные клетки, высушенные ацетоном, или их водно-солевые экстракты: В.pseudomallei 60913 (Аг 8⁺), 51274 (Аг 8⁺), 57576 (Аг 8⁺), 100 (Аг 8⁺), 100-6-1 (Аг 8^-), В.mallei В-120 (Аг 8⁺), 10230 (Аг 8⁺), 10230-11-2 (Аг 8⁺), В.thailandensis 264, 251, 294, 295, B. cepacia 25416, 1934, P. allicola 8495. В качестве положительного контроля используют антигенный комплекс 8, выделенный из В.pseudomallei 100 формамидом, и водно-солевой экстракт В.pseudomallei 100. К краям геля прикладывают мостики из 6 слоев фильтровальной бумаги, обильно смоченные электродным буфером. Электрофорез проводят при ионной силе буферного раствора в электродных отсеках, равной 0,02, напряженности 12 В/см, в течение 4 ч и температуре 12°С. После остановки электрофореза пластинки просматривают.

Наличие пиков преципитатов в геле свидетельствует о присутствии антигенного комплекса 8 патогенных В.pseudomallei и В.mallei, отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных буркхольдерий (фиг.1 и фиг.2).

Пример 2. Изучение патогенных и непатогенных буркхольдерий в РИЭФ при ионной силе буферного раствора в электродных отсеках 0,032.

Ракетный иммуноэлектрофорез проводят как описано в примере 1. В лунки вносят исследуемые водно-солевые экстракты микробных клеток, не содержащих антиген 8: В.thailandensis 264, 251, 294, 295, В.cepacia 25416, 1934, P. allicola 8495. В качестве положительного контроля используют антигенный комплекс 8, выделенный из В.pseudomallei 100 формамидом, и водно-солевой экстракт В.pseudomallei 100. К краям геля прикладывают мостики из 6 слоев фильтровальной бумаги, обильно смоченные электродным буфером. Электрофорез проводят при ионной силе буферного раствора в электродных отсеках, равной 0,032, напряженности 12 В/см, в течение 4 ч и температуре 12°С. После остановки электрофореза пластинки просматривают.

Наличие пиков преципитатов в геле у всех исследуемых штаммов при данных условиях РИЭФ не позволяет дифференцировать патогенные В.pseudomallei и В.mallei от непатогенных буркхольдерий (фиг.3).

Сводные результаты представлены в таблице 1.

Таким образом, разработан быстрый способ дифференцирования патогенных возбудителей сапа и мелиоидоза, относящихся к особо опасным инфекциям, от их непатогенных вариантов и близкородственных буркхольдерий за счет подбора условий РИЭФ (изменения ионной силы буферного раствора в электродных отсеках, напряженности электрического поля, длительности и температуры) с сывороткой, содержащей антитела к антигенному комплексу 8, который отличает простота и быстрота исполнения, наглядность, возможность количественной оценки результатов, отсутствие потребности в сложном оборудовании. Данный способ может применяться в комплексной диагностике сапа и мелиоидоза как дополнительный метод выявления патогенных В.pseudomallei и В.mallei.

Таблица 1
Результаты исследования патогенных и непатогенных буркхольдерий в ракетном иммуноэлектрофорезе Штаммы Патогенность Результаты РИЭФ при ионной силе в электродных отсеках 0,02 Результаты РИЭФ при ионной силе в электродных отсеках 0,032 В.pseudomallei 100 (Аг 8⁺) + + + B.pseudomallei 60913 (Аг 8⁺) + + + В.pseudomallei 51274 (Аг 8⁺) + + + В.pseudomallei 57576 (Аг 8⁺) + + + B.pseudomallei 100-6-1 (Аг 8⁺) - - + B.mallei B-120(Аг 8⁺) + + + B.wallei 10230 (Аг 8⁺) + + + B.mallei 10230-11-2 (Аг 8^-) - - + В.thailandensis 264 (Аг 8^-) - - + В.thailandensis 251 (Аг 8^-) - - + B.thailandensis 294 (Аг 8^-) - - + B.thailandensis 295 (Аг 8^-) - - + B.cepacia 25416 (Аг 8^-) - - - В.cepacia 1934 (Аг 8^-) - - + Р.allicola 8495 (Аг 8^-) - - + Примечания: «+» - наличие признака / положительный результат; «-» - отсутствие признака / отрицательный результат.

Изобретение относится к биотехнологии. Выявляют в составе микробных клеток поверхностный антигенный комплекс (Аг 8) в ракетном иммуноэлектрофорезе с использованием сыворотки иммунной козьей, содержащей антитела к данному антигену, выделенному из В.pseudomallei 100 формамидом, с титром антител в РИД 1:16-1:32. После остановки электрофореза пластинки просматривают, наличие пиков преципитатов в геле свидетельствует о присутствии антигенного комплекса 8 патогенных В.pseudomallei и В.mallei, отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных буркхольдерий. Изобретение позволяет быстро дифференцировать патогенных возбудителей мелиоидоза и сапа от непатогенных для людей буркхольдерий и близкородственных микроорганизмов. 3 ил., 1 табл.

Способ дифференцирования патогенных от непатогенных буркхольдерий, включающий получение антигенного препарата, ракетный иммуноэлектрофорез исследуемых микроорганизмов и последующий учет результатов, отличающийся тем, что для быстрого выявления антигенного комплекса (Аг 8) в штаммах с использованием сыворотки иммунной козьей, содержащей антитела к данному антигену, выделенному из В.pseudomallei 100 формамидом, с титром антител в РИД 1:16-1:32, ракетный электрофорез проводят в следующей постановке: пластинку "GelBond" размером 8,5×10 см заливают 1%-ной агарозой фирмы «Calbiochem», приготовленной на барбитал-трис-глициновом буфере с ионной силой, равной 0,016, рН 8,8, на расстоянии 3 см от края пластинки с анодной стороны пробивают ряд лунок диаметром 4 мм, отступив 2 мм от лунок, вырезают полоску геля шириной 2,5 см, гель растапливают на водяной бане, охлаждают до 48°С, добавляют к нему 0,5-2% по объему сыворотки, содержащей антитела к антигену 8, и снова заливают на пластинку, в лунки вносят исследуемый антигенный материал (взвесь высушенных ацетоном бактериальных клеток в физиологическом растворе, рН 7,2, или их водно-солевой экстракт), к краям геля прикладывают мостики из 6 слоев фильтровальной бумаги, обильно смоченные электродным буфером, электрофорез проводят при ионной силе буферного раствора в электродных отсеках, равной 0,02, напряженности 10-12 В/см в течение 3,5-4 ч и температуре 12°С, после остановки электрофореза пластинки просматривают, наличие пиков преципитатов в геле свидетельствует о присутствии антигенного комплекса 8 патогенных В.pseudomallei и В.mallei, отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных буркхольдерий.