СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МЕЛИОИДОЗА И САПА МЕТОДОМ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗА Российский патент 2009 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к медицине и касается дифференциальной диагностики возбудителей особо опасных инфекций мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) и сапа (Burkholderia mallei).

Среди более 20 видов рода Burkholderia микроорганизмы В.pseudomallei и В.mallei имеют важное медицинское значение, так как являются возбудителями тяжелых заболеваний человека и животных - мелиоидоза и сапа. Эти бактерии относятся ко второй группе бактериологической опасности. Несмотря на различия в инфекционном процессе, вызванном этими микробами, по многим фенотипическим признакам, в том числе по антигенному составу, - это очень близкие микроорганизмы. Неоднократно высказывалось предложение считать возбудителя сапа биоваром возбудителя мелиоидоза. Поэтому эти бактерии диагностируются одинаково до установления факта, что исследуемый микроорганизм относится к группе pseudomallei (в неё входят возбудители сапа и мелиоидоза). Затем, для определения вида, применяют тесты, основанные на следующих фенотипических различиях B.pseudomallei и B.mallei: возбудитель сапа не способен расти на твердых питательных средах при температуре 42°С и при концентрации в питательной среде антибиотика гентамицина более 4 мкг/мл, B.pseudomallei при этих условиях растёт; возбудитель сапа неподвижен, так как не имеет жгутиков, возбудитель мелиоидоза подвижен, так как имеет на поверхности клетки жгутик (лофотрих). (Илюхин В.И., Поповцева Л.Д., Пивень Н.Н. Идентификация Pseudomonas pseudomallei // Лаб. дело. - 1983. - №7. - С.61-62).

В диагностике инфекций мелиоидоза и сапа применялись и применяются серологические реакции (агглютинация, реакция связывания комплемента, реакция непрямой гемагглютинации), с использованием иммунных сывороток к клеточным антигенам B.pseudomallei и B.mallei. При этом дифференцировать возбудители мелиоидоза и сапа не удалось. Использование иммунолюминесцентного метода на основе полученных моноклональных антител против клеточного антигена B.mallei позволило дифференцировать возбудителей мелиоидоза и сапа (Мелиоидоз // Сборник научных трудов под редакцией Н.Г.Тихонова./ Волгоград: Нижневолжское кн. изд-во, 1995 г. - 8-26 с.).

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является применение мелиоидозной антижгутиковой сывороткой в реакции агглютинации для дифференциации B.pseudomallei и B.mallei. Этот способ описан в ряде статей Алексеева В.В, Бондарева И.Н., Зыкина Л.Ф., которые были опубликованы в сборнике «Вопросы противоэпидемической защиты» (НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. - 1977 г., вып.27. - С.54-71) под названием «Индикация возбудителя мелиоидоза на основе антител к жгутиковому антигену». Для постановки реакции агглютинации авторами была применена кроличья антисыворотка к жгутиковому антигену B.pseudomallei, который был получен с большими трудовыми затратами. Специфичность антижгутиковой сыворотки повышали адсорбцией высушенными клетками гомологичного штамма и B.mallei. Процесс производства диагностического препарата и сам способ при этом значительно усложняются. Однако описаны штаммы B.pseudomallei, не имеющие на поверхности клеток жгутиков. Вероятно дифференцирование безжгутиковых вариантов B.pseudomallei и штаммов B.mallei вышеописанной антижгутиковой сывороткой будет затруднено.

Целью изобретения является разработка способа дифференциации возбудителей мелиоидоза (B.pseudomallei) и сапа (B.mallei) на основе иммуноэлектрофореза их антигенов с иммунной кроличьей сывороткой к антигенам B.pseudomallei.

Поставленная цель достигается постановкой иммуноэлектрофореза с внеклеточными антигенами анализируемых штаммов B.pseudomallei и B.mallei и использованием в качестве иммунной сыворотки полученную кроличью антисыворотку против внеклеточных антигенов типичного штамма B.pseudomallei С141.

Для получения иммунной сыворотки используются внеклеточные (экстрацеллюлярные) антигены (ЭЦА), штамма B.pseudomalei С141, содержащие полный состав антигенов с молекулярными массами 18, 24, 28 и 34 кDа. ЭЦА выделяют из смыва бактериальной массы 0,9 М раствором NaCl, выращенной в течение 18 ч при 37°С после высева на F - агар "Difco", США, покрытый целлофаном, суточной культуры этого штамма. Смыв очищают от микробных клеток центрифугированием при 8000 g и фильтрацией через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Стерилизацию ЭЦА проводят фильтрацией через фильтр с размером пор 0,22 мкм и заливкой охлажденным до -40°С ацетоном (до концентрации ацетона 75% от общего объёма). Ацетон из осажденных ЭЦА удаляют центрифугированием при 8000 g и высушиванием под тягой. Полученные внеклеточные антигены подвергают бактериологическому и биологическому контролю на стерильность. Сухие ЭЦА хранят в холодильнике и используют для иммунизации кроликов. Животных иммунизируют в два цикла, которые включают четырехкратное в течение месяца введение антигена, каждое из которых имеет в сумме 2 мл смеси, состоящей из 1 мл раствора ЭЦА (1 мг/мл) и 1 мл неполного адъюванта Фрейнда, и состоит из инъекций по 0,2 мл внутрикожно паравертебрально в 10 точек каждому животному с интервалами между введениями - 7 суток, между циклами - 30 суток. Кровь забирают из сердца при титре в реакции иммунодиффузии 1:32 и выше. В качестве антигенов анализируемого штамма используются ЭЦА, которые получают путем посева суточной культуры анализируемого штамма на агар (F - агар "Difco", США), покрытый целлофаном, выращивания в течение 18 ч при 37°С, смывания 0,9 М раствором NaCl бактериальной массы, удаления из смыва клеток центрифугированием при 8000 g и фильтрацией через фильтр с размером пор 0,45 мкм, осаждением из смыва с одновременной стерилизацией ЭЦА охлажденным до -40°С ацетоном (концентрация ацетона 75%), удаления ацетона центрифугированием при 8000 g в течение 25 мин. Полученные ЭЦА растворяют в 0,9 М растворе NaCl, добавляют мертиолят натрия в соотношении 1:10000 и используют для анализа. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) проводят в пластинах 1% агарозы с использованим веронал-мединалового буфера с pH 8,6. В лунки вносят внеклеточные антигены анализируемых штаммов B.mallei и B.pseudomallei. ИЭФ проводят с охлаждением пластин в течение 2,5 ч при напряжении 4 в/см. Затем в траншеи вносят антисыворотку против ЭЦА B.pseudomallei С141. Наличие линий преципитации в анодной и катодной областях геля указывает на наличие в геле антигенов возбудителей мелиоидоза. Отсутствие линий преципитации в аналогичных зонах геля указывает на внесение в лунку ЭЦА возбудителей сапа.

Примеры конкретного выполнения, подтверждающие осуществление предлагаемого способа.

Пример 1. Получение ЭЦА штамма B.pseudomallei С141

Для получения внеклеточных антигенов культуру B.pseudomallei С141 выращивают на твердой питательной среде (F - агар "Difco", США) при 37°С в течение 18 часов и приготавливают из неё взвесь 10⁹ микробных клеток в 1 мл 0,9% раствора NaCl pH 7,2. F - агар "Difco", США стерильно заливают в стерилизатор, покрывают стерильным целлофаном и наносят на целлофан 8 мл ранее полученной взвеси бактерий B.pseudomallei С141. Стерилизатор помещают на 18 часов в термостат с температурой 37°С. Выросшую на целлофане бактериальную массу смывают 32 мл 0,9% раствора NaCl pH 7,2, осторожно перемешивают до получения гомогенной смеси и центрифугируют 25 мин при 8000 g. Затем супернатант отбирают и фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм для удаления оставшихся бактериальных клеток. Окончательную стерилизацию проводят на фильтре с размером пор 0,22 мкм и осаждением охлажденным до -40°С ацетоном при конечной концентрации растворителя 75%. Контроль стерильности проводят бактериологическим и биологическим методами. Осадок, представленный внеклеточными антигенами, освобождают от ацетона центрифугированием 25 мин при 8000 g и высушиванием под тягой. Высушенные фильтраты до применения хранят в холодильнике при +4°С.

Пример 2. Получение иммунной кроличьей сыворотки к внеклеточным антигенам штамма B.pseudomallei С141.

Для получения гипериммунной сыворотки используют кроликов массой 2-3 кг в возрасте до двух лет. Животных иммунизируют за два цикла введений ЭЦА. Для одного введения используют смесь 1 мл раствора внеклеточных антигенов B.pseudomallei С141 в 0,9% NaCl, рН 7,2 (концентрация - 1,0 мг/мл) и 1 мл неполного адъюванта Фрейнда ("Difco" США). Иммунизирующую смесь вводят путём инъекций паравертебрально внутрикожно в 10 точек по 0,2 мл. Интервалы между введениями составляют 7 суток, между циклами - 30 суток. Активность сывороток определяют после каждого цикла в РИД в геле с ЭЦА. Кровь забирают при титре сыворотки >=1:32. Для подавления роста микрофлоры в сыворотку добавляют мертиолят натрия в соотношении 1:10000 и ампулируют по 0,2-0,5 мл. Затем часть сыворотки сублимационно высушивают, часть хранят в холодильнике при +4°С.

Пример 3. Дифференциация B.pseudomallei и B.mallei в иммуноэлектрофорезе с использованием антисыворотки против ЭЦА штамма B.pseudomallei С141.

Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) проводят на стеклянных пластинах размером 8×8 см, предварительно покрытых пленкой агарозы, что облегчает заливку геля 1% агарозы на веронал-мединаловом буфере. В лунки, вырезанные в геле, вносят антигены. В качестве основного буфера для электрофореза используют веронал-мединалового буфер pH 8,6 с ацетатом кальция. Стекла с гелем укладывают в прибор для электрофореза на охлаждаемый до 4°С столик, к краям геля прикладывают мостики из фильтровальной бумаги (6 слоев). Мостики обильно смачивают буфером. Электрофорез проводят при стабилизированном токе при градиенте напряжения в геле 4 В/см. Рядом с лункой вводят лидирующий свидетель (бромфеноловый синий). Электрофорез проводят до тех пор, пока свидетель не отходит на 2 см от центра стекла. После остановки электрофореза в агарозном геле вдоль направления электрофореза вырезают траншеи, в которые заливают цельные сыворотки. Через 12 часов стекла анализируют «под косым» светом. Наличие линий преципитации в анодной и катодной областях геля указывает на наличие в геле антигенов возбудителей мелиоидоза. Отсутствие аналогичных антигенов в аналогичных зонах геля указывает на факт внесения в лунку возбудителя сапа. Иммуноэлектрофореграммы представлены на фиг.1.

Пример 4. Характеристика внеклеточных антигенов штамма B.pseudomallei С141 методом электрофоретического анализа в ПААГ с ДСН.

Для анализа состава внеклеточных белков штамма B.pseudomallei С141 проводят разделение их на фракции электрофорезом в 10% ПААГ с ДСН по Laemmli (1970 г.) в пластинах размером 6x8 см, толщиной 0,75 мм, используя прибор для вертикального электрофореза. При подготовке проб сухие фильтраты растворяют в лизирующем растворе рН 6,8 (0,0625 М трисаминометан-Сl, 2% ДСН, 10% глицерин, 5% 2-меркаптоэтанол) в концентрации 8 мг/мл, кипятят 10 мин, центрифугируют 25 мин при 8000 g. Супернатант используют в опытах. В качестве эталонов молекулярной массы используют набор маркерных белков фирмы «Amersham», США (мол.м. от 14 до 94 KDa). Белки окрашивают кумасси G-250 и серебром (метод Oakley et al., 1980). Электрофореграммы фотографируют и денситометрируют. Анализ полученных электрофореграмм позволяет установить, что в составе белкового спектра внеклеточного фильтрата имеются 2 белковые фракции, окрашиваемые Кумасси G-250 с мол.м. 28 и 34 Ша. При применении метода окраски серебром выявляются две фракции с мол.м. 28 и 34 Ша, как и при окраске Кумасси G-250 и две дополнительные фракции с мол. м 18 и 24 Ша (фиг.2).

Таким образом, разработан способ дифференциации B.pseudomallei и В.mallei, возбудителей мелиоидоза и сапа, относящихся к особо опасным инфекциям, за счет применения в иммуноэлектрофорезе нового диагностического препарата - преципитирующей антисыворотки против внеклеточных антигенов B.pseudomallei С141 и применения в качестве анализируемых антигенов ЭЦА, который отличает простота исполнения, наглядность, отсутствие потребности в сложном оборудовании. Может применяться как дополнительное средство диагностики в комплексе мер по выявлению возбудителей мелиоидоза и сапа.

Полученная сыворотка дает более четкие линии преципитации только с возбудителем мелиоидоза как при электрофорезе, так и при реакции иммунодиффузии.

Изобретение относится к биотехнологии. Ставят реакцию агглютинации иммунной сыворотки с клетками патогенных буркхольдерий. Для получения иммунной сыворотки используются внеклеточные (экстрацеллюлярные) антигены (ЭЦА) типичного штамма B.pseudomallei С141. ЭЦА получают из смыва бактериальной массы, выросшей на твердой питательной среде, покрытой целлофаном, освобожденной от клеток центрифугированием и фильтрацией. Затем проводят стерилизацию и отделение ЭЦА, бактериологический и биологический контроль стерильности. Для получения иммунной сыворотки ЭЦА в смеси с неполным адьювантом Фрейнда иммунизируют кроликов за два цикла. При титре не менее 1:32 кровь забирают и получают иммунную сыворотку. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) проводят в пластинах агарозы. В лунки вносят ЭЦА анализируемых штаммов B.mallei и B.pseudomallei, проводят ИЭФ. Затем в траншеи вносят антисыворотку против ЭЦА B.pseudomallei С141. Наличие линий преципитации в анодной и катодной областях геля указывает на наличие в геле антигенов возбудителей мелиоидоза. Отсутствие линий преципитации в аналогичных зонах геля указывает на внесение в лунки ЭЦА возбудителя сапа. Изобретение позволяет без сложного оборудования дифференцировать B.pseudomallei и B.mallei, возбудителей мелиоидоза и сапа, относящихся к особо опасным инфекциям. Может применяться как дополнительное средство диагностики в комплексе мер по выявлению возбудителей мелиоидоза и сапа. 2 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ дифференциации возбудителей мелиоидоза и сапа методом иммуноэлектрофореза, включающий постановку реакции агглютинации иммунной сыворотки с клетками патогенных буркхольдерий и последующую оценку результатов реакции, отличающийся тем, что для получения иммунной сыворотки используются внеклеточные (экстрацеллюлярные) антигены (ЭЦА), типичного штамма B.pseudomallei С141, содержащие полный состав антигенов с молекулярными массами 18, 24, 28 и 34 кDа, которые выделяют из смыва 0,9 М раствором NaCl бактериальной массы, выращенной в течение 18 ч при 37°С после высева на агар (F - агар "Difco", США), покрытый целлофаном, суточной культуры этого штамма, смыв очищают от микробных клеток центрифугированием при 8000 g и фильтрацией через фильтр с размером пор 0,45 мкм, стерилизуют фильтрацией через фильтр с размером пор 0,22 мкм и охлажденным до -40°С ацетоном (конечная концентрация ацетона 75%) с одновременным осаждением ЭЦА, удаления ацетона из осадка центрифугированием при 8000g и высушивания ЭЦА под тягой; выделенными высушенными ЭЦА иммунизируют кроликов, а полученную затем иммунную сыворотку применяют в иммуноэлектрофорезе.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что высушенными ЭЦА иммунизируют за два цикла кроликов, в объеме 2 мл смеси внеклеточных антигенов B.pseudomallei С141 в 0,9% NaCl, pH 7,2 (концентрация - 1,0 мг/мл) и неполного адъюванта Фрейнда ("Difco" США) в соотношении 1:1, паравертебрально внутрикожно в 10 точек по 0,2 мл с интервалами между введениями 7 сут, а между циклами 30 сут; титр полученной сыворотки должен быть не менее 1:32.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в лунки, проделанные в 1% агарозе, при постановке иммуноэлектрофореза вносят ЭЦА анализируемых штаммов, проводят электрофорез в течение 2,5 ч, при напряжении 4 В/см и стабилизированном токе, затем в геле вдоль направления электрического тока вырезают траншеи, в которые вносят цельную антисыворотку к ЭЦА B.pseudomallei С141, выдерживают 17-20 ч, отмывают в течение 1-2 ч на шейкере в 0,9 М растворе NaCl и проводят в косом белом свете визуальный анализ иммуноэлектрофореграмм - при этом у штаммов B.pseudomallei в анодной и катодной зонах на расстоянии до 3 см вдоль траншей с сывороткой образуются линии преципитации, у штаммов В.mallei - аналогичные линии преципитации отсутствуют.