СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЭНТЕРОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ НУТРИЙ Российский патент 2006 года по МПК A61K39/09 

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к способу изготовления вакцины, и может быть использовано в научно-исследовательских и производственных учреждениях, занимающихся конструированием биопрепаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Известен способ получения вакцины против эшерихиоза телят (патент РФ на изобретение №9302024613, МКИ А 61 К 39/125, 39/135, 20.04.93). Данный способ предусматривает культивирование токсигенных штаммов Е. Coli на среде Хоттингера в течение 5-7 дней, микробную массу отделяют от токсина на фильтрах со стерилизующими пластинами, далее токсин инактивируют в фильтрате формалином в 0,3-0,4%-ной концентрации при 37°С в течение 10-12 дней, затем полученный анатоксин осаждают 10%-ным раствором алюмокалиевых квасцов из расчета 1% на весь объем, после оттаивания в течение 2-3 дней надосадочную жидкость удаляют, полученный комплексный анатоксин смешивают в равных пропорциях с антигеном, полученным из штаммов эшерихий после выращивания суточных бульонных культур при 37°С в течение двух суток, и осуществляют смыв микробной массы физраствором, содержащим 0,3-0,4% формалина с добавлением до концентрации 50-60 млрд микробных тел в 1 см³ добавлением к смыву перекиси водород до содержания ее до 0,15-0,25%, причем смесь анатоксина и антигена разбавляют стерильной дистиллированной водой до концентрации 5 млрд микробных тел. Данный способ позволяет получать вакцину для профилактики эшерихиоза телят.

Известен способ получения вакцины для профилактики стрептококкоза нутрий (патент РФ на изобретение №2099081 от 30.09.94, МКИ А 61 К 39/125, 39/135). Данный способ включает выращивание штамма Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ №К-ДЕП в жидкой питательной среде с добавлением глюкозы до достижения концентрации 5-6 млрд микробных клеток в 1 см³, затем подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкую фракцию, добавляют к ней 0,3-0,4%-ный раствор формалина, выдерживают в течение 44-50 ч и вносят 3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 10% к объему культуры. Технология получения вакцины сложная, применяется для профилактики стрептококкоза нутрий.

Техническим решением задачи изобретения является устранение перечисленных недостатков, в частности повышение специфичности, эффективности способа изготовления вакцины против энтерококковой инфекции нутрий, путем введения новой культуры возбудителя, компонентов, исключая отрицательного и побочного влияния.

Решение задачи достигается тем, что способ изготовления вакцины против энтерококковой инфекции нутрий, включающий получение антигена, инактивацию, внесение адъюванта, отличается тем, что проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых готовят суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистую культуру возбудителя Streptococcus fecalis и выращивают в мясо-пептонном бульоне с добавлением 0,2% глюкозы до достижения концентрации микробных клеток 5-6 млрд в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов, затем вносят гидроокись алюминия в количестве 20% к объему культуры, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что в отличие от известных способов проводят отбор пораженных органов от павших нутрий в период заболевания и гибели нутрий от энтерококковой инфекции, из которых приготавливают суспензию, выделяют чистую культуру посевом на дифференциально-диагностические среды. Использование при выращивании чистой культуры Streptococcus fecalis в мясо-пептонном бульоне с добавлением 0,2% глюкозы позволяет получать концентрацию микробных клеток не менее 5-6 млрд в 1 см³. Способ обеспечивает получение безвредной, специфичной, высокоиммуногенной вакцины для защиты нутрий от энтерококковой инфекции.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.

Что касается критерия "промышленная применимость", то компоненты, входящие в состав вакцины, известны и широко применяются в ветеринарной практике при изготовлении инактивированных вакцин: инструкция по изготовлению и контролю формолвакцины поливалентной гидроокисьалюминиевой против колибактериоза (эшерихиоза) поросят, телят и ягнят, утвержденная ГУВ МСХ СССР 26.04.1984 г.; инструкция по изготовлению и контролю вакцины против брадзота, инфекционной энтеротоксемии, злокачественного отека овец и дизентерии ягнят, поливалентная концентрированная гидроокисьалюминиевая, утвержденная Главным управлением ветеринарии с государственной ветеринарной инспекцией 10.10.1991 г.

Методы выделения и характеристика стрептококков представлены в "Методических указаниях по лабораторной диагностике стрептококкоза животных", утвержденных 25.09.1990 г. Главным управлением ветеринарии с государственной инспекцией при Государственной комиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам, а также в справочнике "Определитель зоопатогенных микроорганизмов" под редакцией профессора Сидорова М.А., Москва. - Колос, 1995, стр.90-95.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что проводят отбор пораженных органов от павших нутрий в период эпизоотии энтерококковой инфекции, приготавливают суспензию из патологического материала, делают посевы на дифференциально-диагностические среды, инкубируют при 37°С в течение 14-18 часов и выделяют чистую культуру возбудителя энтерококковой инфекции. Выращивание чистой культуры Streptococcus fecalis проводят в мясо-пептонной питательной среде с добавлением 0,2% глюкозы до достижения концентрации микробных клеток 5-6 млрд в 1 см³, инактивируют формалином до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов, вносят гидроокись алюминия в количестве 20% к объему культуры, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Пример конкретного осуществления способа изготовления вакцины.

При изготовлении вакцины против энтерококковой инфекции нутрий проводят отбор пораженных органов от павших нутрий в период заболевания и гибели от энтерококковой инфекции, приготавливают суспензию из патологического материала и проводят бактериологические исследования. Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя готовят мазки-отпечатки из пораженных органов павших нутрий, окрашивают их по методу Грама. При микроскопии препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают мелкие кокки в виде цепочек и расположенные попарно, окрашенные в фиолетовый цвет, характерные для рода Streptococcus. Для определения культуральных свойств возбудителя энтерококковой инфекции делают посевы выделенной культуры из патматериала в мясо-пептонный бульон с добавлением 0,2% глюкозы и 10% инактивированной сыворотки лошади (МПБ), в чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА) с добавлением 0,2% глюкозы и 5% дефибринированной крови кролика. Через 18-20 часов инкубирования в термостате при температуре 37°С наблюдают в МПБ рост в виде диффузного помутнения среды. В чашках Петри с кровяным МПА наблюдают рост мелких росинчатых, слегка мутноватых с ровными краями колоний, окруженных зеленоватой зоной гемолиза, что характерно для Streptococcus fecalis.

Для дифференциации стрептококков от стафилококков используют каталазную пробу. При постановке каталазной пробы на предметное стекло наносят каплю свежеприготовленного 3%-ного раствора перекиси водорода. Бактериологической петлей снимают одну колонию исследуемой культуры и растирают ее в капле перекиси водорода. Стафилококки, в отличие от стрептококков, образуют каталазу и вызывают пенообразование. Для предварительной идентификации стрептококков и энтерококков баккультуру высевают в пробирки с 10%, 40% желчи, с 6,5% хлористого натрия, с углеводами (раффинозой, сорбитом, маннитом), учитывают рост в жидкой среде и гемолиз на МПА с кровью.

В результате в пробирках с желчью наблюдают диффузный рост баккультуры, отмечают ферментацию маннита. На МПА с кровью наблюдают неполный гемолиз эритроцитов с образованием вокруг колоний зеленоватой зоны, что характерно для стрептококков группы D.

При выделении культуры стрептококков серологической группы D необходимо определять разновидность энтерококков, так как кроме патогенных Str. fecalis в эту группу входит и Str. faecium, который является облигатным обитателем кишечника животных и человека. Для этого использовуют дифференциально-диагностическую среду. На энтерококковой дифференциально-диагностической среде через 14-18 часов инкубирования наблюдают рост колоний вишнево-красного цвета, что характерно для Str. fecalis. Для установления серогрупповой принадлежности стрептококков используют стрептококковые групповые преципитирующие сыворотки. Серогрупповую принадлежность стрептококков определяют в реакции преципитации (РП) в капиллярах. Патогенность подтверждают биопробой на молодых белых мышках.

Выращивание чистой культуры Streptococcus fecalis проводят в мясо-пептонном бульоне рН 7,6-7,8. Для заражения берут 5 мл свежей баккультуры фекального стрептококка на 1000 мл жидкой питательной среды с добавлением 0,2% глюкозы и выращивают при 37°С в течение 12-14 часов. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту мутности и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 5-6 млрд в 1 см³. Инактивацию баксырья проводят внесением формалина 0,4-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов при периодическом перемешивании, затем смешивают и добавляют 3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему и тщательно перемешивают, фасуют и укупоривают.

Таким образом, использование для изготовления вакцины против энтерококковой инфекции нутрий чистой культуры Streptococcus fecalis, выделенной из местного эпизоотического очага, позволяет получать более специфичную, высокоиммуногенную вакцину для защиты от энтерококковой инфекции. Выращивание возбудителя с содержанием 0,2% глюкозы позволяет получать концентрацию бактериальных клеток не менее 5-6 млрд в 1 см³ в течение 12-14 часов инкубирования. Использование формалина для инактивации в 0,4-0,6% ной конечной концентрации позволяет в течение 72-96 часов при температуре 37°С подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность в течение 12 месяцев хранения. Адсорбирование антигена на гидроокиси алюминия позволяет через 12-15 суток после однократного введения в дозе 1 см³ нутриям обеспечить у привитых формирование напряженного иммунитета против энтерококковой инфекции, продолжительностью не менее 9 месяцев (срок наблюдения). После однократного введения нутриям внутримышечно не вызывает у них поствакцинальных осложнений (таблица 1).

Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.

Таблица 1.
Сравнительная характеристика изготовления вакцины по предлагаемому способу и прототипу№ п/пОтличительные признакиПрототипПредлагаемый способ1.Возбудитель энтерококковой инфекцииШтамм Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ № К-ДЕПКультура Streptococcus fecalis, выделенная из пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага при энтерококковой инфекции2.Подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкую фракциюОбязательно проводитсяНе проводится3.Инактивация бактериальной массы0,3-0,4%-ный раствор формалина, выдерживают в течение 44-50 ч0,4-0,6%-ной концентрации формалина в течение 72 -96 часов при температуре 37°С4.Адъювант3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 10% к объемуГидроокись алюминия 15% к объему5.Поствакцинальные осложненияУ нутрий после введения вакцины хромата, воспалительные процессыНет6.Длительность иммунитета6 мес9 мес

Таким образом, данные таблицы 1 показывают преимущества предлагаемого способа изготовления вакцины против энтерококковой инфекции нутрий по сравнению с имеющимся прототипом.

Изобретение относится к ветеринарной медицине. Для изготовления безвредной, более специфичной, высокоиммуногенной инактивированной вакцины против энтерококковой инфекции нутрий проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию. Делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистую культуру возбудителя Streptococcus fecalis и выращивают в мясо-пептонном бульоне с добавлением 0,2% глюкозы до достижения концентрации микробных клеток 5-6 млрд в 1 см³. Инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации и выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов. Затем вносят гидроокись алюминия в количестве 20% к объему культуры, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают. Способ прост в исполнении и позволяет получить высокоэффективную и безвредную вакцину. 1 табл.

Способ изготовления вакцины против энтерококковой инфекции нутрий, включающий получение антигена, инактивацию, внесение адъюванта, отличающийся тем, что проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых готовят суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистую культуру возбудителя Streptococcus fecalis и выращивают в мясо-пептонном бульоне с добавлением 0,2% глюкозы до достижения концентрации микробных клеток 5-6 млрд. в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 ч, затем вносят гидроокись алюминия в количестве 20% к объему культуры, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.