СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ АССОЦИИРОВАННОЙ ПРОТИВ СТРЕПТОКОККОЗА, ПСЕВДОМОНОЗА И ЭНТЕРОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ НУТРИЙ Российский патент 2010 года по МПК A61K39/116 

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к способу изготовления вакцин, и может быть использовано в научно-исследовательских и производственных учреждениях, занимающихся конструированием биопрепаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Известен способ получения ассоциированной вакцины для профилактики инфекций, вызываемых условно-патогенными бактериями (патент РФ №2035189, МКИ А61К 39/125, 39/135, от 02.01.86). Данный способ включает раздельное выделение протективных антигенов, из штамма Staphylococcus aureus №Б-243 выделяют цитоплазматический антиген, из токсинопродуцирующего штамма Pseudomonas aeruginosa НИИЭМ №PA-7 получают анатоксин синегнойной палочки, из клинических штаммов Proteus mirabilis №6, 8, 40, 508, 1115, 4641 выделяют растворимые антигены путем контролируемого протеолиза, полученные антигены смешивают в физрастворе из расчета содержания их в 1 мл вакцины 0,15-0,2 мг белка, 15-30 мкг белка, 10-20 мкг белка соответственно и в смесь дополнительно добавляют коммерческий стафилококковый анатоксин и гидроокись алюминия в количестве 5-10 ЕС и 1-2 мг соответственно. Технология получения вакцины очень сложная, для профилактики нутрий не применяется.

Известен способ получения вакцины против стрептококкоза и пастереллеза нутрий (патент РФ №2099083, МКИ А61К 39/125, 39/135, от 30.09.94). Данный способ предусматривает раздельное выращивание в жидкой питательной среде с добавлением глюкозы штаммов Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ №К-ДЕП, Pasteurella multosida ВГНКИ №2394 и Pasteurella multocida ВГНКИ №1015 в течение 18-24 часов, полученные культуральные среды подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкие фракции, инактивируют 0,3-0,4%-ным раствором формалина, объединяют их в равных соотношениях по объему и последовательно вносят гидроокись алюминия. Данный способ позволяет получать вакцину против стрептококкоза и пастереллеза нутрий.

Техническим решением задачи изобретения является устранение перечисленных недостатков, в частности повышение специфичности, эффективности способа изготовления ассоциированной вакцины против стрептококкоза, псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий, путем введения новых чистых культур возбудителей, компонентов, исключая отрицательное и побочное влияние.

Решение задачи достигается тем, что способ изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза, псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий, включающий получение антигена, инактивацию, внесение адъюванта, отличающийся тем, что проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей, раздельно выращивают культуры Streptococcus uberis, Pseudomonas aeruginosa и Enterococcus fecalis в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов, смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что в отличие от известных способов проводят отбор пораженных органов от павших нутрий в период заболевания и гибели нутрий от стрептококкоза, псевдомоноза и энтерококковой инфекции, приготавливают суспензию из патологического материала, выделают чистую культуру посевом на дифференциально-диагностические среды. Используют при раздельном выращивании чистые культуры возбудителей стрептококкоза Streptococcus uberis, псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa и энтерококковой инфекции Enterococcus fecalis в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2% и получают концентрацию микробных клеток не менее 4-5 млрд в 1 см³. Инактивируют формалином до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации при температуре 37°С в течение 72-96 часов и смешивают чистые культуры в равных соотношениях, что позволяет полностью подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность против стрептококкоза, псевдомоноза и энтерококковой инфекции. Добавление гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему культуры позволяет через 12-15 суток после однократного введения в дозе 1 см³ нутриям обеспечить у привитых формирование напряженного иммунитета против двух инфекций. Способ обеспечивает получение безвредной, высокоиммуногенной, более специфичной вакцины для защиты нутрий от стрептококкоза, псевдомоноза и энтерококковой инфекции.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.

Что касается критерия «промышленная применимость», то компоненты, входящие в состав вакцины, известны и широко применяются в ветеринарной практике при изготовлении инактивированных вакцин: ассоциированная вакцина против сальмонеллеза, пастереллеза и энтерококковой инфекции поросят ТУ 10.09-62-90, утверждено 01.08.90 г., инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины утверждена Главным управлением ветеринарии 16.07.90 г.; вакцина против энтерококковой инфекции телят, ягнят и поросят ТУ 10.09-91-90, утверждено 15.12.90 г., где представлены все необходимые сведения о микроорганизмах рода Pseudomonas и рода Enterococcus. Однако для нутрий эти вакцины не применяются.

Методы выделения и характеристика микроорганизмов рода Pseudomonas описаны в «Практикуме по ветеринарной микробиологии и иммунологии», авторы: Костенко Т.С., Родионова В.Б., Скородумов Д.И. - М.: Колос, 2001, на стр.259-261; в справочнике «Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных», авторы: Скородумов Д.И., Субботин В.В., Сидоров М.А., Костенко Т.С. - М.: ИзограФъ, 2005, на стр.522-525.

Методы выделения и характеристика стрептококков представлены в «Методических указаниях по лабораторной диагностике стрептококкоза животных», утвержденных 25.09.1990 г. Главным управлением ветеринарии с государственной инспекцией при Государственной комиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам, а также в справочнике «Определитель зоопатогенных микроорганизмов» под редакцией профессора Сидорова М.А. - М., Колос, 1995, стр.90-95; в справочнике «Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных», авторы: Скородумов Д.И., Субботин В.В., Сидоров М.А., Костенко Т.С. - М.: ИзограФъ, 2005, на стр.249-257.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, приготавливают суспензию из патологического материала, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей инфекционных болезней стрептококкоза, псевдомоноза и энтерококковой инфекции, раздельно выращивают чистые культуры возбудителей Streptococcus uberis, Pseudomonas aeruginosa и Enterococcus fecalis в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов, смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Пример конкретного осуществления способа изготовления вакцины.

Для изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза, псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий проводят отбор пораженных органов от павших нутрий в период заболевания их стрептококкозом, псевдомонозом и энтерококковой инфекцией, из которых приготавливают суспензию и проводят бактериологические исследования с целью выделения чистых культур возбудителей.

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя псевдомоноза готовят мазки-отпечатки из пораженных органов павших нутрий, окрашивают их по методу Грама. При микроскопии препаратов под иммерсионной системой микроскопа видны прямые или изогнутые палочки размером 1,5-3,0 мкм, располагающиеся одиночно, парами, в виде цепочек, окрашенные в розовый цвет, характерные для Pseudomonas aeruginosa.

Для определения культуральных свойств возбудителя псевдомоноза делают посевы выделенной культуры из патматериала в мясо-пептонный бульон, в чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА), кровяной МПА и селективную среду, содержащую цетилтриметил аммония бромид, на которой другие псевдомонады не растут.

Через 24 часа инкубирования в термостате при температуре 37°С наблюдают поверхностную серебристо-белую пленку в МПБ, характерный признак и помутнение среды. В чашках Петри с кровяным МПА наблюдают рост сероватых, полупрозрачных колоний, окруженных зеленоватой зоной гемолиза, что характерно для Pseudomonas aeruginosa.

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя стрептококкоза и энтерококковой инфекции готовят мазки-отпечатки из пораженных органов павших нутрий, окрашивают их по методу Грама. При микроскопии препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают мелкие кокки в виде цепочек и расположенные попарно, окрашенные в фиолетовый цвет, характерные для рода Streptococcus. Для определения культуральных свойств возбудителя стрептококкоза и энтерококковой инфекции делают посевы выделенной культуры из патматериала в мясо-пептонный бульон с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 10% инактивированной сыворотки лошади (МПБ), в чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА) с добавлением с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 5% дефибринированной крови кролика. Через 18-20 часов инкубирования в термостате при температуре 37°С наблюдают в МПБ рост в виде диффузного помутнения среды. В чашках Петри с кровяным МПА наблюдают рост мелких росинчатых, слегка мутноватых с ровными краями колоний, окруженных зеленоватой зоной гемолиза, что характерно для рода Enterococcus.

Для дифференциации стрептококков от стафилококков используют каталазную пробу. При постановке каталазной пробы на предметное стекло наносят каплю свежеприготовленного 3%-ного раствора перекиси водорода. Бактериологической петлей снимают одну колонию исследуемой культуры и растирают ее в капле перекиси водорода. Стафилококки, в отличие от стрептококков, образуют каталазу и вызывают пенообразование. Для предварительной идентификации стрептококков и энтерококков баккультуру высевают в пробирки с 10%, 40% желчи, с 6,5% хлористого натрия, с углеводами (раффинозой, сорбитом, маннитом), учитывают рост в жидкой среде и гемолиз на МПА с кровью.

В результате в пробирках с желчью наблюдают диффузный рост баккультуры, отмечают ферментацию маннита. На МПА с кровью наблюдают неполный гемолиз эритроцитов с образованием вокруг колоний зеленоватой зоны, что характерно для стрептококков.

При выделении культуры стрептококков необходимо определять разновидность энтерококков, так как кроме патогенных Enterococcus fecalis в эту группу входит и Streptococcus faecium, который является облигатным обитателем кишечника животных и человека. Для этого использовуют дифференциально-диагностическую среду. На энтерококковой дифференциально-диагностической среде через 14-18 часов инкубирования наблюдают рост колоний вишнево-красного цвета, что характерно для возбудителя энтерококковой инфекции Streptococcus fecalis. Для установления серогрупповой принадлежности стрептококков используют стрептококковые групповые преципитирующие сыворотки. Серогрупповую принадлежность стрептококков определяют в реакции преципитации (РП) в капиллярах. Патогенность подтверждают биопробой на молодых белых мышках.

Выделенные таким образом чистые культуры возбудителей стрептококкоза Streptococcus uberis, псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa и энтерококковой инфекции Enterococcus fecalis используют для получения баксырья.

Выращивание чистых культур возбудителей проводят раздельно в мясо-пептонном бульоне. Для заражения берут 5 см³ свежей чистой культуры возбудителей стрептококкоза Streptococcus uberis, псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa и энтерококковой инфекции Enterococcus fecalis на 1000 см³ мясо-пептонной питательной среды с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации и выращивают при 37°С в течение 12-14 часов. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту мутности и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 4-5 млрд в 1 см³. Инактивацию полученного баксырья проводят внесением формалина 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов при периодическом перемешивании.

Таким образом, использование для изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза, псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий чистых культур возбудителей Streptococcus uberis, Pseudomonas aeruginosa и Enterococcus fecalis, выделенных из местного эпизоотического очага, позволяет получать специфичную, высокоиммуногенную ассоциированную вакцину для защиты от этих трех опасных инфекционных болезней: стрептококкоза, псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий. Раздельное выращивание возбудителей с содержанием 0,2% глюкозы позволяет получать концентрацию бактериальных клеток не менее 4 млрд в 1 см³ в течение 12-14 часов инкубирования. Использование формалина для инактивации в 0,4-0,5%-ной конечной концентрации позволяет в течение 72-96 часов при температуре 37°С подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность в течение 12 месяцев хранения. Адсорбирование трех антигенов на гидроокиси алюминия позволяет через 12-15 суток после однократного введения в дозе 1 см³ нутриям обеспечить у привитых нутрий формирование напряженного иммунитета против стрептококкоза, псевдомоноза и энтерококковой инфекции, продолжительностью не менее 9 месяцев (срок наблюдения). После однократного введения нутриям внутримышечно не вызывает у них поствакцинальных осложнений (таблица).

Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.

Таблица Сравнительная характеристика изготовления вакцины по предлагаемому способу и прототипу № п/п Отличительные признаки Прототип Предлагаемый способ 1 Возбудители Штаммы Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ №К-ДЕП, Pasteurella multosida ВГНКИ №2394 и Pasteurella multocida ВГНКИ №1015 Чистые баккультуры возбудителей стрептококкоза Streptococcus uberis, псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa и энтерококковой инфекции нутрий Enterococcus fecalis, выделенные из местного эпизоотического очага 2 подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкую фракцию Обязательно проводится Не проводится 3 Инактивация бактериальной массы 0,3-0,4%-ный раствор формалина, выдерживают в течение 44-50 ч 0,4-0,5%-ный раствор формалина в течение 72-96 часов при температуре 37°С 4 Адъювант 3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 10% к объему гидроокись алюминия 20% к объему 5 Поствакцинальные осложнения У нутрий после введения вакцины хромата, воспалительные процессы Нет 6 Длительность иммунитета 6 мес 9 мес

Таким образом, данные таблицы показывают преимущества предлагаемого способа изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза, псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий по сравнению с имеющимся прототипом.

Изобретение относится к области ветеринарной медицины. Способ заключается в том, что проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию. Затем делают посев на дифференциально-диагностические среды и выделяют чистые культуры возбудителей стрептококкоза, псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий. После чего раздельно выращивают культуры Streptococcus uberis, Pseudomonas aeruginosa и Enterococcus faecalis в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов. Затем смешивают культуры в равных соотношениях, вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают. Способ позволяет получить безвредную, специфичную, высокоиммуногенную вакцину. 1 табл.

Способ изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза, псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий, включающий получение антигена, инактивацию, внесение адъюванта, отличающийся тем, что проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей, раздельно выращивают культуры Streptococcus uberis, Pseudomonas aeruginosa и Enterococcus faecalis в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 ч, смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.