СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ АССОЦИИРОВАННОЙ ПРОТИВ ПСЕВДОМОНОЗА И ЭНТЕРОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ НУТРИЙ Российский патент 2010 года по МПК A61K39/116 

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к способу изготовления вакцин, и может быть использовано в научно-исследовательских и производственных учреждениях, занимающихся конструированием биопрепаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Известен способ получения ассоциированной вакцины для профилактики инфекций, вызываемых условно-патогенными бактериями (патент РФ на изобретение №2035189 от 02.01.86, МКИ A61K 39/125, 39/135). Данный способ включает раздельное выделение протективных антигенов, из штамма Staphylococcus aureus №Б-243 выделяют цитоплазматический антиген, из токсинопродуцирующего штамма Pseudomonas aeruginosa НИИЭМ №PA-7 получают анатоксин синегнойной палочки, из клинических штаммов Proteus mirabilis №6, 8, 40, 508, 1115, 4641 выделяют растворимые антигены путем контролируемого протеолиза, полученные антигены смешивают в физрастворе из расчета содержания их в 1 мл вакцины 0,15-0,2 мг белка, 15-30 мкг белка, 10-20 мкг белка соответственно и в смесь дополнительно добавляют коммерческий стафилококковый анатоксин и гидроокись алюминия в количестве 5-10 ЕС и 1-2 мг соответственно. Технология получения вакцины очень сложная, для профилактики нутрий не применяется.

Известен способ получения вакцины против стрептококкоза и пастереллеза нутрий (патент РФ на изобретение №2099083 от 30.09.94, МКИ А61К 39/125, 39/135). Данный способ предусматривает раздельное выращивание в жидкой питательной среде с добавлением глюкозы штаммов Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ №К-ДЕП, Pasteurella multosida ВГНКИ №2394 и Pasteurella multocida ВГНКИ №1015 в течение 18-24 часов, полученные культуральные среды подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкие фракции, инактивируют 0,3-0,4%-ным раствором формалина, объединяют их в равных соотношениях по объему и последовательно вносят гидроокись алюминия. Данный способ позволяет получать вакцину против стрептококкоза и пастереллеза нутрий.

Техническим решением задачи изобретения является устранение перечисленных недостатков, в частности, повышение специфичности, эффективности способа изготовления ассоциированной вакцины против псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий, путем введения новых чистых культур возбудителей, компонентов, исключая отрицательного и побочного влияния.

Решение задачи достигается тем, что способ изготовления вакцины ассоциированной против псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий, включающий получение антигена, инактивацию, внесение адъюванта, отличается тем, что проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры, раздельно выращивают культуры Pseudomonas aeruginosa и Enterococcus faecalis в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд. микробных клеток в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов, смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что в отличие от известных способов проводят отбор пораженных органов от павших нутрий в период заболевания и гибели нутрий от псевдомоноза и энтерококковой инфекции, приготавливают суспензию из патологического материала, выделают чистую культуру посевом на дифференциально-диагностические среды. Используют при раздельном выращивании чистые культуры возбудителей Pseudomonas aeruginosa и энтерококковой инфекции Enterococcus faecalis и мясо-пептонный бульон с добавлением глюкозы до 0,2% и получают концентрацию микробных клеток не менее 4-5 млрд. в 1 см³. Инактивируют формалином до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации при температуре 37°С в течение 72-96 часов и смешивают чистые культуры в равных соотношениях, что позволяет полностью подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность против псевдомоноза и энтерококковой инфекции. Добавление гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему культуры позволяет через 12-15 суток после однократного введения в дозе 1 см³ нутриям обеспечить у привитых формирование напряженного иммунитета против двух инфекций. Способ обеспечивает получение безвредной, высокоиммуногенной, более специфичной вакцины для защиты нутрий от псевдомоноза и энтерококковой инфекции.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.

Что касается критерия «промышленная применимость», то компоненты, входящие в состав вакцины, известны и широко применяются в ветеринарной практике при изготовлении инактивированных вакцин: ассоциированная вакцина против сальмонеллеза, пастереллеза и энтерококковой инфекции поросят ТУ 10.09-62-90, утверждено 01.08.90 г., инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины утверждена Главным управлением ветеринарии 16.07.90 г.; вакцина против энтерококковой инфекции телят, ягнят и поросят ТУ 10.09-91-90, утверждено 15.12.90 г., представлены все необходимые сведения о микроорганизмах рода Streptococcus. Однако для нутрий эти вакцины не применяются.

Методы выделения и характеристика микроорганизмов рода Pseudomonas описаны в «Практикуме по ветеринарной микробиологии и иммунологии», авторы: Костенко Т.С., Родионова В.Б., Скородумов Д.И., М.: «Колос», 2001, на стр.259-261; в справочнике «Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных», авторы: Скородумов Д.И., Субботин В.В., Сидоров М.А., Костенко Т.С., М.: «ИзограФъ», 2005, на стр.522-525.

Методы выделения и характеристика стрептококков представлены в «Методических указаниях по лабораторной диагностике стрептококкоза животных», утвержденных 25.09.1990 г., Главным управлением ветеринарии с государственной инспекцией при Государственной комиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам, а также в справочнике «Определитель зоопатогенных микроорганизмов» под редакцией профессора Сидорова М.А., Москва. - Колос, 1995, стр.90-95.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей, раздельно выращивают культуры Pseudomonas aeruginosa и Enterococcus faecalis в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд. микробных клеток в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов, смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Пример конкретного осуществления способа изготовления вакцины.

Для изготовления вакцины ассоциированной против псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий проводят отбор пораженных органов от павших нутрий в период заболевания их псевдомонозом и энтерококковой инфекцией, из которых приготавливают суспензию и проводят бактериологические исследования с целью выделения чистых культур возбудителей.

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя псевдомоноза готовят мазки-отпечатки из пораженных органов павших нутрий, окрашивают их по методу Грама. При микроскопии препаратов под иммерсионной системой микроскопа видны прямые или изогнутые палочки размером 1,5-3,0 мкм, располагающиеся одиночно, парами, в виде цепочек, окрашенные в розовый цвет, характерные для Pseudomonas aeruginosa.

Для определения культуральных свойств возбудителя псевдомоноза делают посевы выделенной культуры из патматериала в мясо-пептонный бульон, в чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА), кровяной МПА и селективную среду, содержащую цетилтриметил аммония бромид, на которой другие псевдомонады не растут.

Через 24 часа инкубирования в термостате при температуре 37°С наблюдают поверхностную серебристо-белую пленку в МПБ, характерный признак и помутнение среды. В чашках Петри с кровяным МПА наблюдают рост сероватых, полупрозрачных колоний, окруженных зеленоватой зоной гемолиза, что характерно для Pseudomonas aeruginosa.

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя энтерококковой инфекции готовят мазки-отпечатки из пораженных органов павших нутрий, окрашивают их по методу Грама. При микроскопии препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают мелкие кокки в виде цепочек и расположенные попарно, окрашенные в фиолетовый цвет, характерные для рода Enterococcus. Для определения культуральных свойств возбудителя энтерококковой инфекции делают посевы выделенной культуры из патматериала в мясо-пептонный бульон с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 10% инактивированной сыворотки лошади (МПБ), в чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА) с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 5% дефибринированной крови кролика. Через 18-20 часов инкубирования в термостате при температуре 37°С наблюдают в МПБ рост в виде диффузного помутнения среды. В чашках Петри с кровяным МПА наблюдают рост мелких росинчатых, слегка мутноватых с ровными краями колоний, окруженных зеленоватой зоной гемолиза, что характерно для Enterococcus faecalis.

Для дифференциации стрептококков от стафилококков используют каталазную пробу. При постановке каталазной пробы на предметное стекло наносят каплю свежеприготовленного 3%-ного раствора перекиси водорода. Бактериологической петлей снимают одну колонию исследуемой культуры и растирают ее в капле перекиси водорода. Стафилококки, в отличие от стрептококков, образуют каталазу и вызывают пенообразование. Для предварительной идентификации стрептококков и энтерококков баккультуру высевают в пробирки с 10%, 40% желчи, с 6,5% хлористого натрия, с углеводами (раффинозой, сорбитом, маннитом), учитывают рост в жидкой среде и гемолиз на МПА с кровью.

В результате в пробирках с желчью наблюдают диффузный рост баккультуры, отмечают ферментацию маннита. На МПА с кровью наблюдают неполный гемолиз эритроцитов с образованием вокруг колоний зеленоватой зоны, что характерно для стрептококков.

При выделении культуры стрептококков необходимо определять разновидность энтерококков, так как кроме патогенных Enterococcus faecalis в эту группу входит и Streptococcus faecium, который является облигатным обитателем кишечника животных и человека. Для этого используют дифференциально-диагностическую среду. На энтерококковой дифференциально-диагностической среде через 14-18 часов инкубирования наблюдают рост колоний вишнево-красного цвета, что характерно для возбудителя энтерококковой инфекции Enterococcus faecalis. Для установления серогрупповой принадлежности стрептококков используют стрептококковые групповые преципитирующие сыворотки. Серогрупповую принадлежность стрептококков определяют в реакции преципитации (РП) в капиллярах. Патогенность подтверждают биопробой на молодых белых мышках.

Выделенные таким образом чистые культуры возбудителей псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa и энтерококковой инфекции Enterococcus faecalis используют для получения баксырья.

Выращивание чистых культур возбудителей проводят раздельно в мясо-пептонном бульоне. Для заражения берут 5 см³ свежей чистой культуры возбудителя псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa на 1000 см³ мясо-пептонной питательной среды с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации и выращивают при 37°С в течение 12-14 часов. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту мутности и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 4-5 млрд. в 1 см³. Инактивацию полученного баксырья проводят внесением формалина 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов при периодическом перемешивании.

Для заражения берут 5 см³ чистой культуры возбудителя энтерококковой инфекции Streptococcus faecalis на 1000 см³ жидкой питательной среды с добавлением 0,2% глюкозы и выращивают при 37°С в течение 12-14 часов. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 4-5 млрд. в 1 см³. Инактивацию баксырья проводят раздельно внесением формалина 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов при периодическом перемешивании, смешивают инактивированные баккультуры в равных соотношениях. Затем к смеси баккультур добавляют раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему и тщательно перемешивают, фасуют и укупоривают.

Таким образом, использование для изготовления вакцины ассоциированной против псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий чистых культур возбудителей Pseudomonas aeruginosa и Enterococcus faecalis, выделенных из местного эпизоотического очага, позволяет получать более специфичную, высокоиммуногенную ассоциированную вакцину для защиты от этих двух опасных инфекционных болезней: псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий. Раздельное выращивание возбудителей с содержанием 0,2% глюкозы позволяет получать концентрацию бактериальных клеток не менее 4 млрд. в 1 см³ в течение 12-14 часов инкубирования. Использование формалина для инактивации в 0,4-0,5%-ной конечной концентрации позволяет в течение 72-96 часов при температуре 37°С подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность в течение 12 месяцев хранения. Адсорбирование двух антигенов на гидроокиси алюминия позволяет через 12-15 суток после однократного введения в дозе 1 см³ нутриям обеспечить у привитых нутрий формирование напряженного иммунитета против псевдомоноза и энтерококковой инфекции, продолжительностью не менее 9 месяцев (срок наблюдения). После однократного введения нутриям внутримышечно не вызывает у них поствакцинальных осложнений (таблица).

Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.

Сравнительная характеристика изготовления вакцины по предлагаемому способу и прототипу № п/п Отличительные признаки Прототип Предлагаемый способ 1 Возбудители Штаммы Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ № К-ДЕП, Pasteurella multosida ВГНКИ №2394 и Pasteurella multocida ВГНКИ №1015 Чистые баккультуры возбудителей псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa и энтерококковой инфекции нутрий Enterococcus faecalis, выделенные из местного эпизоотического очага 2 подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкую фракцию Обязательно проводится Не проводится 3 Инактивация бактериальной массы 0,3-0,4%-ный раствор формалина, выдерживают в течение 44-50 ч 0,4-0,5%-ной концентрации формалина в течение 72-96 часов при температуре 37°С 4 Адъювант 3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 10% к объему гидроокись алюминия 20% к объему 5 Поствакцинальные осложнения У нутрий после введения вакцины хромота, воспалительные процессы Нет 6 Длительность иммунитета 6 мес 9 мес

Таким образом, данные таблицы показывают преимущества предлагаемого способа изготовления вакцины ассоциированной против псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий по сравнению с имеющимся прототипом.

Изобретение относится к ветеринарной медицине. Способ включает получение антигена, инактивацию и внесение адъюванта. При этом проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию. Затем делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей, раздельно выращивают культуры Pseudomonas aeruginosa и Enterococcus faecalis в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд. микробных клеток в 1 см³. Инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов. Смешивают культуры в равных соотношениях. Затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают. Способ прост в исполнении, позволяет получить специфичную высокоиммуногенную вакцину. 1 табл.

Способ изготовления вакцины ассоциированной против псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий, включающий получение антигена, инактивацию, внесение адъюванта, отличающийся тем, что проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей, раздельно выращивают культуры Pseudomonas aeruginosa и Enterococcus faecalis в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 ч, смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.