СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ, АССОЦИИРОВАННОЙ ПРОТИВ СТРЕПТОКОККОЗА И ЭНТЕРОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ НУТРИЙ Российский патент 2007 года по МПК A61K39/116 A61K39/09 

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к способу изготовления вакцин, и может быть использовано в научно-исследовательских и производственных учреждениях, занимающихся конструированием биопрепаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Известен способ получения ассоциированной вакцины для профилактики инфекций, вызываемых условно-патогенными бактериями (патент РФ на изобретение №2035189 от 02.01.86., МКИ А61К 39/125, 39/135). Данный способ включает раздельное выделение протективных антигенов, из штамма Staphylococcus aureus № Б - 243 выделяют цитоплазматический антиген, из токсинопродуцирующего штамма Pseudomonas aeruginosa НИИЭМ № PA - 7 получают анатоксин синегнойной палочки, из клинических штаммов Proteus mirabilis №6, 8, 40, 508, 1115, 4641 выделяют растворимые антигены путем контролируемого протеолиза, полученные антигены смешивают в физрастворе из расчета содержания их в 1 мл вакцины 0,15-0,2 мг белка, 15-30 мкг белка, 10-20 мкг белка соответственно и в смесь дополнительно добавляют коммерческий стафилококковый анатоксин и гидроокись алюминия в количестве 5-10 ЕС и 1-2 мг соответственно. Технология получения вакцины очень сложная, для профилактики инфекционных болезней нутрий не применяется.

Известен способ получения вакцины против стрептококкоза и пастереллеза нутрий (патент РФ на изобретение №2099083 от 30.09.94., МКИ А61К 39/125, 39/135). Данный способ предусматривает раздельное выращивание в жидкой питательной среде с добавлением глюкозы штаммы Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ № К-ДЕП, Pasteurella multosida ВГНКИ №2394 и Pasteurella multocida ВГНКИ №1015 в течение 18-24 часов, полученные культуральные среды подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкие фракции, инактивируют 0,3-0,4%-ным раствором формалина, объединяют их в равных соотношениях по объему и последовательно вносят гидроокись алюминия. Данный способ позволяет получать вакцину против стрептококкоза и пастереллеза нутрий. Технология получения данной вакцины сложная. Такая вакцина после введения нутриям вызывает поствакцинальные осложнения (воспаление, абсцессы, хромату).

Техническим решением задачи изобретения является устранение перечисленных недостатков, в частности, повышение специфичности, эффективности способа изготовления вакцины против стрептококкоза и энтерококковой инфекции нутрий, путем введения новых чистых культур возбудителей, компонентов, исключая отрицательное и побочное влияния.

Решение задачи достигается тем, что способ изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза и энтерококковой инфекции нутрий, включающий получение антигенов, инактивацию, внесение адъюванта, проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей, раздельно выращивают культуры Streptococcus pneumoniae и Streptococcus fecalis в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов, смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 15% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что в отличие от известных способов проводят отбор пораженных органов от павших нутрий в период заболевания и гибели нутрий от стрептококкоза и энтерококковой инфекции, приготавливают суспензию из патологического материала, выделают чистые культуры возбудителей посевом на дифференциально-диагностические среды. Используют при раздельном выращивании чистые культуры возбудителей Streptococcus pneumoniae и Streptococcus fecalis мясо-пептонный бульон с добавлением глюкозы до 0,2% и получают концентрацию микробных клеток не менее 4-5 млрд в 1 см³. Инактивируют формалином до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации при температуре 37°С в течение 72-96 часов и смешивают чистые культуры в равных соотношениях, что позволяет полностью подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность против стрептококкоза и энтерококковой инфекции. Добавление гидроокиси алюминия в количестве 15% к объему культуры позволяет через 12-15 суток после однократного введения в дозе 1 см³ нутриям обеспечить у привитых формирование напряженного иммунитета против двух инфекций. Способ обеспечивает получение безвредной, высокоиммуногенной, более специфичной вакцины для защиты нутрий от стрептококкоза и энтерококковой инфекции.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.

Что касается критерия «промышленная применимость», то компоненты, входящие в состав вакцины, известны и широко применяются в ветеринарной практике при изготовлении инактивированных вакцин: формолквасцовая вакцина против паратифа (сальмонеллеза) телят ТУ 46-21-166-75, утверждено 10.05.75 г., инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины утверждена Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 28.03.80 г.; вакцина против паратифа (сальмонеллеза) поросят ТУ 46-21-952-74, утверждено 15.07.74 г., инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины утверждена Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 23.10.96 г.; ассоциированная вакцина против сальмонеллеза, пастереллеза и энтерококковой инфекции поросят ТУ 10.09-62-90, утверждено 01.08.90 г., инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины утверждена Главным управлением ветеринарии 16.07.90 г.; вакцина против энтерококковой инфекции телят, ягнят и поросят ТУ 10.09-91-90, утверждено 15.12.90 г. Однако для нутрий эти вакцины не применяются.

Пример конкретного осуществления способа изготовления вакцины.

Для изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза и энтерококковой инфекции нутрий проводят отбор пораженных органов от павших нутрий в период заболевания их стрептококкозом и энтерококковой инфекцией, из которых приготавливают суспензию и проводят бактериологические исследования с целью выделения чистых культур возбудителей.

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителей стрептококкоза и энтерококковой инфекции готовят мазки-отпечатки из пораженных органов павших нутрий, окрашивают их по методу Грама. При микроскопии препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают мелкие кокки в виде цепочек и расположенные попарно, окрашенные в фиолетовый цвет, характерные для рода Streptococcus. Для определения культуральных свойств возбудителя энтерококковой инфекции делают посевы выделенной культуры из патматериала в мясо-пептонный бульон с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 10% инактивированной сыворотки лошади (МПБ), в чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА) с добавлением с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 5% дефибринированной крови кролика. Через 18-20 часов инкубирования в термостате при температуре 37°С наблюдают в МПБ рост в виде диффузного помутнения среды. В чашках Петри с кровяным МПА наблюдают рост мелких росинчатых, слегка мутноватых с ровными краями колонии, окруженных зеленоватой зоной гемолиза, что характерно для рода Streptococcus.

Для дифференциации стрептококков от стафилококков используют каталазную пробу. При постановке каталазной пробы на предметное стекло наносят каплю свежеприготовленного 3%-ного раствора перекиси водорода. Бактериологической петлей снимают одну колонию исследуемой культуры и растирают ее в капле перекиси водорода. Стафилококки, в отличие от стрептококков, образуют каталазу и вызывают пенообразование. Для предварительной идентификации стрептококков и энтерококков баккультуру высевают в пробирки с 10%, 40% желчи, с 6,5% хлористого натрия, с углеводами (раффинозой, сорбитом, маннитом), учитывают рост в жидкой среде и гемолиз на МПА с кровью.

В результате в пробирках с желчью наблюдают диффузный рост баккультуры, отмечают ферментацию маннита. На МПА с кровью наблюдают неполный гемолиз эритроцитов с образованием вокруг колоний зеленоватой зоны, что характерно для стрептококков группы D.

При выделении культуры стрептококков серологической группы D необходимо определять разновидность энтерококков, так как кроме патогенных Str. fecalis в эту группу входит и Str. faecium, который является облигатным обитателем кишечника животных и человека. Для этого используют дифференциально-диагностическую среду. На энтерококковой дифференциально-диагностической среде через 14-18 часов инкубирования наблюдают рост колоний вишнево-красного цвета, что характерно для возбудителя энтерококковой инфекции Str. fecalis. Для установления серогрупповой принадлежности стрептококков используют стрептококковые групповые преципитирующие сыворотки. Серогрупповую принадлежность стрептококков определяют в реакции преципитации (РП) в капиллярах. Патогенность подтверждают биопробой на молодых белых мышках.

Выделенные таким образом чистые культуры возбудителей стрептококкоза Streptococcus pneumoniae и энтерококковой инфекции Str. fecalis используют для получения бактериального сырья.

Выращивание чистых культур проводят раздельно в мясо-пептонном бульоне. Для заражения берут по 5 см³ свежих чистых культур возбудителей стрептококкоза Streptococcus pneumoniae и энтерококковой инфекции Str. fecalis на 1000 см³ мясо-пептонной питательной среды с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации и выращивают при 37°С в течение 12-14 часов. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту мутности и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 4-5 млрд в 1 см³. Инактивацию полученного баксырья проводят внесением формалина 0,4-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов при периодическом перемешивании, смешивают инактивированные баккультуры в равных соотношениях. Затем к смеси баккультур добавляют раствор гидроокиси алюминия в количестве 15% к объему и тщательно перемешивают, фасуют и укупоривают.

Таким образом, использование для изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза и энтерококковой инфекции нутрий чистых культур возбудителей Streptococcus pneumoniae и Streptococcus fecalis, выделенных из местного эпизоотического очага, позволяет получать более специфичную, высокоиммуногенную ассоциированную вакцину для защиты от этих двух опасных инфекционных болезней: стрептококкоза и энтерококковой инфекции нутрий. Раздельное выращивание возбудителей с содержанием 0,2% глюкозы позволяет получать концентрацию бактериальных клеток не менее 4 млрд в 1 см³ в течение 12-14 часов инкубирования. Использование формалина для инактивации в 0,4-0,6% ной конечной концентрации позволяет в течение 72-96 часов при температуре 37°С подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность в течение 12 месяцев хранения. Адсорбирование двух антигенов на гидроокиси алюминия позволяет через 12-15 суток после однократного введения в дозе 1 см³ нутриям обеспечить у привитых нутрий формирование напряженного иммунитета против стрептококкоза и энтерококковой инфекции, продолжительностью не менее 9 месяцев (срок наблюдения). После однократного введения нутриям внутримышечно не вызывает у них поствакцинальных осложнений (см. таблицу).

Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.

Таблица
Сравнительная характеристика изготовления вакцины по предлагаемому способу и прототипу№ п/пОтличительные признакиПрототипПредлагаемый способ1ВозбудителиШтаммы Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ № К-ДЕП, Pasteurella multosida ВГНКИ №2394 и Pasteurella multocida ВГНКИ №1015Чистые бактериальные культуры возбудителей Streptococcus pneumoniae и Streptococcus fecalis, выделенные из местного эпизоотического очага2Подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкую фракциюОбязательно проводитсяНе проводится3Инактивация бактериальной массы0,3-0,4%-ный раствор формалина, выдерживают в течение 44-50 ч0,4-0,6%-ной концентрации формалина в течение 72-96 часов при температуре 37°С4Адъювант3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 10% к объемугидроокись алюминия 15% к объему5Поствакцинальные осложненияУ нутрий после введения вакцины хромата воспалительные процессыНет6Длительность иммунитета6 мес9 мес

Таким образом, данные таблицы показывают преимущества предлагаемого способа изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза и энтерококковой инфекции нутрий по сравнению с имеющимся прототипом.

Изобретение относится к области биотехнологии. Проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию. Затем делают посев на дифференциально-диагностические среды и выделяют чистые культуры возбудителей. Раздельно выращивают культуры Streptococcus pneumoniae и Streptococcus fecalis в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов. Смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 15% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают. Способ позволяет получить безвредную, высокоиммуногенную и высокоспецифичную вакцину. 1 табл.

Способ изготовления вакцины, ассоциированной против стрептококкоза и энтерококковой инфекции нутрий, заключающийся в том, что проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей, раздельно выращивают культуры Streptococcus pneumoniae и Streptococcus fecalis в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 ч, смешивают культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 15% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.