СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КОЛИБАКТЕРИОЗА НУТРИЙ Российский патент 2006 года по МПК A61K39/108 

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к вакцинам, и может быть использовано в учреждениях, занимающихся конструированием биологических препаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Известен способ получения вакцины против колибактериоза поросят (патент РФ на изобретение №2022563, 26.05.88, МКИ А 61 К 39/125, 39/135). Данный способ предполагает раздельное выращивание штаммов Е. coli ВГНКИ №305-37/10, 355-37/12, 357-37/12, 331-37/12, 359-37/12, 360-37/12, 299-37/10, 330-37/11 в бульоне Хоттингера, смешивают культуры в равных соотношениях, инактивируют формалином и тиомерсалом с последующим адсорбированием на гидроксиде алюминия. Применяют для профилактики колибактериоза поросят.

Известен способ получения вакцины против эшерихиоза телят (патент РФ на изобретение №2070819, 20.04.93, МКИ А 61 К 39/125, 39/135). Данный способ предусматривает культивирование токсигенных штаммов Е.coli на среде Хоттингера в течение 5-7 дней, микробную массу отделяют от токсина на фильтрах со стерилизующими пластинами, далее токсин инактивируют в фильтрате формалином в 0,3-0,4%-ной концентрации при 37°С в течение 10-12 дней, затем полученный анатоксин осаждают 10%-ным раствором алюмокалиевых квасцов из расчета 1% на весь объем, после оттаивания в течение 2-3 дней надосадочную жидкость удаляют, полученный комплексный анатоксин смешивают в равных пропорциях с антигеном, полученным из штаммов эшерихий после выращивания суточных бульонных культур при 37°С в течение двух суток и смыва микробной массы физраствором, содержащим 0,3-0,4% формалина с доведением до концентрации 50-60 млрд. микробных тел в 1 мл добавлением к смыву перекиси водорода до содержания ее до 0,15-0,25%, причем смесь анатоксина и антигена разбавляют стерильной дистиллированной водой до концентрации 5 млрд. микробных тел. Данный способ позволяет получать вакцину для профилактики эшерихиоза телят.

Техническим решением задачи изобретения является устранение перечисленных недостатков, в частности повышение эффективности способа изготовления вакцины против колибактериоза, путем введения новой культуры возбудителя, новых компонентов и исключения отрицательного и побочного влияния.

Поставленная задача достигается тем, что способ изготовления вакцины против колибактериоза нутрий, включающий получение антигена, инактивацию, внесение адъюванта, проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых готовят суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистую культуру возбудителя Escherichia coli и выращивают в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 5-6 млрд. микробных клеток в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,5-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов, затем вносят 3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему культуры, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что в отличие от известных способов проводят отбор органов от павших нутрий в период заболевания и гибели животных от колибактериоза, приготавливают суспензию из патологического материала, выделяют чистую культуру посевом на дифференциально-диагностические среды, это позволяет выделить чистую культуру возбудителя. Использование при выращивании чистой культуры Escherichia coli мясопептонной питательной среды с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации позволяет получать концентрацию микробных клеток не менее 5-6 млрд. в 1 см³. Инактивация культуры путем внесения формалина до 0,5-0,6%-ной конечной концентрации при температуре 37°С в течение 72-96 часов надежно подавляет патогенность возбудителя, сохраняя иммуногенность. Способ обеспечивает получение безвредной, высокоиммуногенной, специфичной вакцины для защиты нутрии от колибактериоза.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.

Что касается критерия «промышленная применимость», то компоненты, входящие в состав вакцины, известны и широко применяются в ветеринарной практике при изготовлении инактивированных вакцин: инструкция по изготовлению и контролю формолвакцины поливалентной гидроокисьалюминиевой против колибактериоза (эшерихиоза) поросят, телят и ягнят, утвержденная ГУВ МСХ СССР 26.04.1984 г.; инструкция по изготовлению и контролю вакцины против брадзота, инфекционной энтеротоксемии, злокачественного отека овец и дизентерии ягнят, поливалентная концентрированная гидроокисьалюминиевая, утвержденная Главным управлением ветеринарии с государственной ветеринарной инспекцией 10.10.1991 г. Предложенная вакцина против колибактериоза нутрий проста в исполнении, доступна и является промышленно применимой.

Методы выделения чистой культуры возбудителя и характеристика описаны в «Методических указаниях по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных», утвержденных 27.07.2000 г. №13-7-2/2117, Департаментом ветеринарии МСХ РФ, описана характеристика эшерихий в справочнике «Определитель зоопатогенных микроорганизмов» под редакцией профессора Сидорова М.А., М.: Колос, 1995, стр.196-201, а также в «Практикуме по ветеринарной микробиологии и иммунологии» авторы: Костенко Т.С., Родионова В.Б., Скородумов Д.И., М.: Колос, 2001, на стр.219-222.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что проводят отбор пораженных органов от павших нутрий в период эпизоотии колибактериоза, приготавливают суспензию из патологического материала, делают посев на дифференциально-диагностические среды и инкубируют в термостате при 37°С в течение 16-24 часов и выделяют чистую культуру возбудителя колибактериоза. Выращивание чистой культуры возбудителя Escherichia coli проводят в мясопептонной питательной среде с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 5-6 млрд. микробных клеток в 1 см³, к питательной среде добавляют формалин до 0,5-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов, вносят гидроокись алюминия в количестве 20% к объему культуры, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Пример конкретного осуществления способа изготовления вакцины.

При изготовлении вакцины против колибактериоза нутрий проводят отбор пораженных органов от павших нутрий в период эпизоотии колибактериоза, приготавливают суспензию из патологического материала и проводят бактериологические исследования. Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителей готовят мазки - отпечатки из пораженных органов павших нутрий путем прикосновения обезжиренным стеклом к свежему разрезу пораженной ткани и последующей фиксацией над пламенем спиртовки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают толстые палочки с закругленными концами красного цвета, расположенные одиночно, что характерно для Е.coli.

Для определения культуральных свойств возбудителя колибактериоза нутрий делают посевы выделенной культуры из патологического материала в мясопептонный бульон (МПБ), на среду Эндо, на мясопептонный агар (МПА) и инкубируют в термостате при 37°С в течение 16-24 часов. На чашках Петри с МПА вырастают влажные колонии с ровными краями и гладкой поверхностью серого цвета. В пробирках с МПБ наблюдали равномерное помутнение питательной среды с небольшим осадком, разбивающимся при встряхивании. В чашках Петри, на среде Эндо наблюдают рост колоний малиново-красного цвета с розовым ободкам диаметром 2-3 мм, характерные для E.coli.

При определении биохимической активности чистых баккультур проводят посевы на дифференциально-диагностичские среды с различным набором компонентов. Для E.coli характерно расщепление глюкозы и лактозы с образованием кислоты и газа, выделение индола, отсутствие уреазы.

Патогенность чистых выделенных культур определяют путем внутрибрюшинного заражения белых мышей массой 14-18 г. Через 2-4 суток наблюдения все зараженные лабораторные животные погибают при 100% сохранности в контроле. Для подтверждения специфичности гибели мышей из паренхиматозных органов павших мышей приготавливают мазки-отпечатки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании под иммерсионной системой микроскопа в препаратах видны толстые палочки с закругленными концами красного цвета, расположенные одиночно, характерные для E.coli. Серологическую типизацию кишечной палочки проводят в реакции агглютинации с набором типоспецифических сывороток по общепринятой методике в пробирках.

В реакции агглютинации исследуемая культура кишечной палочки реагирует с колисывороткой и виден хлопьевидный осадок (положительный результат) при отрицательном контроле.

Выращивание чистой культуры возбудителя Escherichia coli проводят в мясопептонной питательной среде с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации. Для заражения берут 1-2 см³ свежей культуры эшерихий и засевают 80-100 мл жидкой питательной среды и выращивают при 37°С в течение 12-14 часов. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту мутности и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 5-6 млрд. в 1 см³. Инактивацию полученного баксырья проводят внесением формалина 0,5-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов при периодическом перемешивании, затем вносят 3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему и тщательно перемешивают, фасуют и укупоривают.

Таким образом, использование для изготовления вакцины против колибактериоза нутрий чистой культуры Escherichia coli, выделенной из пораженных органов нутрий из местного эпизоотического очага, позволяет получать специфичную, высокоиммуногенную вакцину для защиты нутрий от колибактериоза. Выращивание чистой культуры возбудителя в мясопептонной питательной среде с внесением глюкозы до 0,2%-ной концентрации позволяет получать концентрацию бактериальных клеток не менее 5-6 млрд. в 1 см³ в течение 12-14 часов культивирования. Использование формалина для инактивации в 0,5-0,6%-ной конечной концентрации позволяет в течение 72-96 часов при температуре 37°С подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность в течение 12 месяцев хранения. Адсорбирование антигена на гидроокиси алюминия позволяет через 12-15 суток после введения нутриям обеспечить у привитых формирование напряженного иммунитета, продолжительностью не менее 9 месяцев (срок наблюдения). После однократного введения нутриям внутримышечно не вызывает поствакцинальных осложнений. Результаты по сравнительной характеристике вакцин представлены в таблице 1.

Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.

Таблица 1
Сравнительная характеристика изготовления вакцины по предлагаемому способу и прототипу№ п/пОтличительные признакиПрототипПредлагаемый способ1Возбудитель колибактериозаТоксигенные штаммы, выделенные от телятКультура возбудителя Escherichia coli, выделенная из пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага при колибактериозе2Отделение анатоксина на фильтрахОбязательно проводитсяНе проводится3Инактивация бактериальной массы0,3-0,4%-ной концентрации в течение 10-12 дней при 37°С0,5-0,6%-ной концентрации формалина в течение 72-96 ч при температуре 37°С4Осаждение анатоксинаОбязательно проводят 10%-ным раствором алюмокалиевых квасцов в течение 2-3 днейНе проводится5Смешивание компонентовОбъединение антигена и анатоксинаНе проводится6Внесение дополнительных компонентовОбязательное внесение перекиси водородаНе проводится7АдъювантАлюмокалиевые квасцы 10%3%-ный раствор гидроокиси алюминия 20% к объему8Поствакцинальные осложненияУ телят после введения вакцины отмечаютсяНет9Длительность иммунитета6 мес.9 мес.

Таким образом, предлагаемый способ изготовления вакцины против колибактериоза нутрий имеет ряд преимуществ по сравнению с прототипом.

Изобретение относится к ветеринарной медицине. Для изготовления вакцины проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага. Из этих органов приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистую культуру возбудителя Escherichia coli и выращивают в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 5-6 млрд. микробных клеток в 1 см³. Затем инактивируют путем внесения формалина до 0,5-0,6%-ной конечной концентрации и выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов. После чего вносят 3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему культуры, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают. Способ прост в исполнении, позволяет получить высокоэффективную вакцину. 1 табл.

Способ изготовления вакцины против колибактериоза нутрий, включающий получение антигена, инактивацию, внесение адъюванта, отличающийся тем, что проводят отбор пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, из которых готовят суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистую культуру возбудителя Escherichia coli и выращивают в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 5-6 млрд. микробных клеток в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,5-0,6%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 ч, затем вносят 3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему культуры, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.