СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КОЛИБАКТЕРИОЗА КРОЛИКОВ Российский патент 2010 года по МПК A61K39/108 

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к вакцинам, и может быть использовано в учреждениях, занимающихся конструированием биологических препаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Известен способ получения вакцины против колибактериоза поросят (патент РФ на изобретение №2022563, 26.05.88, МКИ A61K 39/125, 39/135). Данный способ предполагает раздельное выращивание штаммов Е. coli ВГНКИ №№305-37/10, 355-37/12, 357-37/12, 331-37/12, 359-37/12, 360-37/12, 299-37/10, 330-37/11 в бульоне Хоттингера, смешивают культуры в равных соотношениях, инактивируют формалином и тиомерсалом с последующим адсорбированием на гидроксиде алюминия. Применяют для профилактики колибактериоза поросят.

Известен способ получения вакцины для профилактики стрептококкоза нутрий (патент РФ на изобретение №2099081 от 30.09.94, МКИ A61K 39/125, 39/135). Данный способ включает выращивание штамма Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ №К-ДЕП в жидкой питательной среде с добавлением глюкозы до достижения концентрации 5-6 млрд микробных клеток в 1 см³, затем подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкую фракцию, добавляют к ней 0,3-0,4%-ный раствор формалина, выдерживают в течение 44-50 ч и вносят 3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 10% к объему культуры. Технология получения вакцины сложная, применяется для профилактики стрептококкоза нутрий.

Техническим решением задачи изобретения является устранение перечисленных недостатков, в частности повышение эффективности способа изготовления вакцины против колибактериоза кроликов путем введения новой культуры возбудителя, новых компонентов и исключения отрицательного и побочного влияния.

Поставленная задача достигается тем, что способ изготовления вакцины против колибактериоза кроликов, включающий получение антигена, инактивацию, внесение адъюванта, отличающийся тем, что проводят отбор пораженных органов от павших кроликов из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистую культуру возбудителя, выращивают культуру Escherichia coli О35 в мясо-пептонном бульоне с титром 5-6 млрд микробных клеток в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°C в течение 48-72 ч, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что в отличие от известных способов проводят отбор органов от павших кроликов в период заболевания и гибели животных от колибактериоза, приготавливают суспензию из патологического материала, выделяют чистую культуру посевом на дифференциально-диагностические среды, это позволяет выделить чистую культуру возбудителя. Использование при выращивании чистой культуры Escherichia coli О35 мясо-пептонной питательной среды позволяет получать концентрацию микробных клеток не менее 5-6 млрд в 1 см³. Инактивация культуры путем внесения формалина до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации при температуре 37°C в течение 48-72 ч, надежно подавляет патогенность возбудителя, сохраняя иммуногенность. Способ обеспечивает получение безвредной, высокоиммуногенной, специфичной вакцины для защиты кроликов против колибактериоза.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.

Что касается критерия «промышленная применимость», то компоненты, входящие в состав вакцины, известны и широко применяются в ветеринарной практике при изготовлении инактивированных вакцин: инструкция по изготовлению и контролю формолвакцины поливалентной гидроокисьалюминиевой против колибактериоза (эшерихиоза) поросят, телят и ягнят, утвержденная ГУВ МСХ СССР 26.04.1984 г.; инструкция по изготовлению и контролю вакцины против брадзота, инфекционной энтеротоксемии, злокачественного отека овец и дизентерии ягнят, поливалентная концентрированная гидроокисьалюминиевая, утвержденная Главным управлением ветеринарии с государственной ветеринарной инспекцией 10.10.1991 г.

Предложенная вакцина против колибактериоза кроликов проста в исполнении, доступна и является промышленно применимой.

Методы выделения чистой культуры возбудителя колибактериоза и характеристика описаны в «Методических указаниях по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных», утвержденных 27.07.2000 г. №13-7-2/2117, Департаментом ветеринарии МСХ РФ, описана характеристика эшерихий в справочнике «Определитель зоопатогенных микроорганизмов» под ред.проф. Сидорова М.А. - Москва: Колос, 1995, стр.196-201, а также в «Практикуме по ветеринарной микробиологии и иммунологии» авторы: Костенко Т.С., Родионова В.Б., Скородумов Д.И. - М.: Колос, 2001, стр.219-222.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что проводят отбор пораженных органов от павших кроликов из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистую культуру возбудителя, выращивают культуру Escherichia coli О35 в мясо-пептонном бульоне до концентрации с титром 5-6 млрд микробных клеток в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°C в течение 48-72 ч, вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Пример конкретного осуществления способа изготовления вакцины

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя колибактериоза готовят мазки - отпечатки из пораженных органов павших нутрий - путем прикосновения обезжиренным стеклом к свежему разрезу пораженной ткани и последующей фиксацией над пламенем спиртовки окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают толстые палочки с закругленными концами красного цвета, расположенные одиночно, что характерно для Escherichia coli.

Для определения культуральных свойств возбудителя колибактериоза нутрий Escherichia coli делают посевы выделенной культуры из патологического материала в мясо-пептонный бульон (МПБ), на среду Эндо, на мясо-пептонный агар (МПА) и инкубируют в термостате при 37°C в течение 16-24 ч. На чашках Петри с МПА вырастают влажные колонии с ровными краями и гладкой поверхностью серого цвета. В пробирках с МПБ наблюдали равномерное помутнение питательной среды с небольшим осадком, разбивающимся при встряхивании. В чашках Петри, на среде Эндо наблюдают рост колоний малиново-красного цвета с розовым ободком диаметром 2-3 мм, характерным для Escherichia coli.

При определении биохимической активности чистых баккультур проводят посевы на дифференциально-диагностические среды с различным набором компонентов. Для Escherichia coli характерно расщепление глюкозы и лактозы с образованием кислоты и газа, выделение индола, отсутствие уреазы.

Патогенность чистых выделенных культур определяют путем внутрибрюшинного заражения белых мышей массой 14-18 г. Через 2-4 сут наблюдения все зараженные лабораторные животные погибают при 100%-ной сохранности в контроле. Для подтверждения специфичности гибели мышей из паренхиматозных органов павших мышей приготавливают мазки - отпечатки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании под иммерсионной системой микроскопа в препаратах видны толстые палочки с закругленными концами красного цвета, расположенные одиночно, характерные для Escherichia coli. Серологическую типизацию кишечной палочки проводят в реакции агглютинации с набором типоспецифических сывороток по общепринятой методике в пробирках. В реакции агглютинации исследуемая культура кишечной палочки реагирует с колисывороткой O35 и виден хлопьевидный осадок (положительный результат) при отрицательном контроле.

Выращивание чистой культуры возбудителя Escherichia coli 035 проводят в мясо-пептонной питательной среде. Для заражения берут 1-2 см³ свежей культуры и засевают 80-100 мл жидкой питательной среды и выращивают при 37°C в течение 12-14 ч. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту мутности и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 5-6 млрд в 1 см³. Инактивацию полученного баксырья проводят внесением формалина 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°C в течение 48-72 ч при периодическом перемешивании, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему и тщательно перемешивают, фасуют и укупоривают.

Таким образом, использование для изготовления вакцины против колибактериоза кроликов чистой культуры Escherichia coli О35, выделенной из пораженных органов кроликов из местного эпизоотического очага, позволяет получать специфичную, высокоиммуногенную вакцину для защиты кроликов от колибактериоза. Выращивание чистой культуры возбудителя в мясо-пептонной питательной среде позволяет получать концентрацию бактериальных клеток не менее 5-6 млрд в 1 см³ в течение 12-14 ч культивирования. Использование формалина для инактивации в 0,4-0,5%-ной конечной концентрации позволяет в течение 48-72 ч при температуре 37°C подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность в течение 12 месяцев хранения. Адсорбирование антигена на гидроокиси алюминия позволяет через 12-15 сут после введения кроликам обеспечить у привитых формирование напряженного иммунитета, продолжительностью не менее 9 месяцев (срок наблюдения). После однократного введения нутриям внутримышечно не вызывает поствакцинальных осложнений. Результаты по сравнительной характеристике вакцин представлены в таблице 1.

Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.

Таблица 1 Сравнительная характеристика изготовления вакцины по предлагаемому способу и прототипу № п/п Отличительные признаки Прототип Предлагаемый способ 1. Возбудители штамм Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ №К-ДЕП культура возбудителя E.coli O35, выделенная из пораженных органов от павших кроликов из местного эпизоотического очага при колибактериозе 2. подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкую фракцию обязательно проводится не проводится 3. Инактивация бактериальной массы 0,3-0,4%-ный раствор формалина, выдерживают в течение 44-50 ч 0,4-0,5%-ной концентрации формалина в течение 48-72 часов при температуре 37°C 4. Адъювант 3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 10% к объему раствор гидроокиси алюминия 20% к объему 5. Поствакцинальные осложнения у нутрий после введения вакцины хромата, воспалительные процессы нет 6. Длительность иммунитета 6 мес. 9 мес.

Таким образом, предлагаемый способ изготовления вакцины против колибактебиоза кроликов имеет ряд преимуществ по сравнению с прототипом.

Изобретение относится к ветеринарной медицине. Способ заключается в том, что проводят отбор пораженных органов от павших кроликов из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию. Делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистую культуру Escherichia coli О35, которую выращивают в мясопептонном бульоне. Доводят концентрацию микробных клеток до титра 5-6 млрд в 1 см³ и инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации. Выдерживают при температуре 37°С в течение 48-72 ч, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают. Способ прост в исполнении, позволяет получить высокоиммуногеннную инактивированную вакцину. 1 табл.

Способ изготовления вакцины против колибактериоза кроликов, включающий получение антигена, инактивацию, внесение адъюванта, отличающийся тем, что проводят отбор пораженных органов от павших кроликов из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистую культуру Escherichia coli O35, которую выращивают в мясопептонном бульоне, доводят концентрацию микробных клеток до титра 5-6 млрд. в 1 см³, инактивируют путем внесения формалина до 0,4-0,5%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 48-72 ч, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.