СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ АССОЦИИРОВАННОЙ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА, ЭШЕРИХИОЗА И ВИРУСНОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ КРОЛИКОВ Российский патент 2013 года по МПК A61K39/116 A61K39/112 A61K39/108 A61K39/12 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к способу изготовления вакцины ассоциированной против сальмонеллеза, эшерихиоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, и может быть использовано в научно-исследовательских и производственных учреждениях, занимающихся разработкой и конструированием вакцинных препаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Известен способ получения поливалентной вакцины против кишечных инфекций (патент РФ на изобретение №2080875 от 18.03.92, МКИ A61K 39/125, 39/135). Данный способ получения поливалентной вакцины включает раздельное выращивание культур Salmonella typhi, Salmonella paratyphi B, Shigella Flexneria, Shigella Sonne, отделение биомассы от питательной среды, экстракцию антигенов проводят водно-солевым раствором при шуттелировании в присутствии антибиотика и мелкораздробленного стекла в течение 1-1,5 ч, полученные экстракты центрифугируют, очистке подвергают супернатанты и после смешивания получают целевой продукт в виде смеси клеточных стенок, содержащих О-антигены используемых культур, со жгутиками, содержащими Н-антигены, и растворимыми Vi-антигенами сальмонелл. Технология получения данной вакцины очень сложная и для профилактики инфекционных болезней кроликов не рекомендуется.

Известен способ получения вакцины против стрептококкоза и пастереллеза нутрий (патент РФ на изобретение №2099083 от 30.09.94, МКИ A61K 39/125, 39/135). Данный способ предусматривает раздельное выращивание в жидкой питательной среде с добавлением глюкозы штаммов Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ №К-ДЕП, Pasteurella multosida ВГНКИ №2394 и Pasteurella multocida ВГНКИ №1015 в течение 18-24 часов, полученные культуральные среды подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкие фракции, инактивируют 0,3-0,4%-ным раствором формалина, объединяют их в равных соотношениях по объему и последовательно вносят гидроокись алюминия. Данный способ позволяет получать вакцину против стрептококкоза и пастереллеза нутрий. Технология получения данной вакцины сложная, после введения животным вызывает поствакцинальные осложнения (воспаление, абсцессы, хромоту).

Известен способ изготовления бивалентной вакцины против миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов (патент РФ на изобретение №2064304 от 27.07.96, МКИ A61K 39/275). Данный способ заключается в том, что раздельно выращивают вакцинный вирус миксоматоза кроликов в культуре клеток куриных фибробластов с активностью не ниже 10⁴ ИД₅₀/см³, замораживают-оттаивают, смешивают с инактивированной суспензией печени кроликов, зараженной вирулентным вирусом геморрагической болезни кроликов, в соотношении 1:1, стабилизируют полученную смесь защитной средой при соотношении 10:1, фасуют и лиофилизируют после замораживания при минус 55±5°C в течение 10±2 ч путем выдерживания материала при температуре от минус 50±5°C до 0°C в течение 31±1 ч и затем от 0°C до плюс 20±1°C в течение 6±1 ч при вакууме 10±0,5 Па и досушивают в течение 3±1 ч. Данный способ позволяет получать бивалентную вакцину против миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов. Технология получения данной вакцины очень сложная.

Техническим результатом изобретения является получение безвредной, специфичной, высокоиммуногенной ассоциированной вакцины для защиты кроликов против сальмонеллеза, эшерихиоза и вирусной геморрагической болезни путем введения новых культур возбудителей, компонентов, исключая отрицательное и побочное влияние.

Поставленная задача достигается тем, что в способе изготовления вакцины ассоциированной против сальмонеллеза, эшерихиоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, включающем раздельное выращивание антигенов, смешивание культур в равных соотношениях, фасовку, согласно изобретению проводят отбор пораженных органов от павших кроликов из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию и делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей, отдельно выращивают культуры Salmonella typhimurium, Escherichia coli в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд. микробных клеток в 1 см³, затем заражают кроликов вирусом геморрагической болезни с активностью не менее 10³ ЛД₅₀/см³ и из печени павших кроликов готовят 10-15% ную суспензию, после этого раздельно инактивируют возбудителей болезней формалином до конечной концентрации не более 0,4%-ной конечной концентрации при температуре 37°C, затем в смесь инактивированных культур вносят адъювант, в качестве которого используют гель гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, перед фасовкой тщательно перемешивают конечный продукт.

Новизна заявляемого изобретения обусловлена тем, что в отличие от известных способов проводят отбор пораженных органов павших кроликов в период заболевания, гибели их от сальмонеллеза, эшерихиоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, приготавливают суспензию, выделают чистые культуры возбудителей посевом на дифференциально-диагностические среды. Используют при раздельном выращивании чистой культуры Salmonella typhimurium, Escherichia coli в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2% и получают концентрацию микробных клеток не менее 4-5 млрд. в 1 см³. Для получения специфичного вирусного сырья кроликов заражают вирусом геморрагической болезни кроликов, выделенным из местного эпизоотического очага, проводят экстрагирование вируса из 10-15%-ной суспензии печени павших кроликов при температуре 4-6°C в течение 10-12 часов при периодическом перемешивании и освобождение от клеточного детрита фильтрованием через два слоя марли, что позволяет увеличить выход вирусного сырья в два-три раза. Инактивируют культуры возбудителей раздельно формалином до 0,1-0,4%-ной конечной концентрации при температуре 37°C в течение 4 суток и смешивают инактивированные культуры в равных соотношениях, что позволяет полностью подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность против сальмонеллеза, эшерихиоза и вирусной геморрагической болезни кроликов. Добавление гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему культуры позволяет через 12-15 суток после однократного введения в дозе 1 см³ обеспечить у привитых кроликов формирование напряженного иммунитета против трех инфекций.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.

Что касается критерия «промышленная применимость», то компоненты, входящие в состав вакцины, известны и широко применяются в ветеринарной практике при изготовлении инактивированных вакцин: инструкция по изготовлению и контролю формолвакцины поливалентной гидроокисьалюминиевой против колибактериоза (эшерихиоза) поросят, телят и ягнят, утвержденной ГУВ МСХ СССР 26.04.1984 г.; ассоциированная вакцина против миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов (СТО 00495549-0044-2007); ассоциированная вакцина против пастереллеза и вирусной геморрагической болезни кроликов (ТУ утверждены 30.09.94 г., инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины утверждена 27.05.94 г.); ассоциированная вакцина против сальмонеллеза, пастереллеза и энтерококковой инфекции поросят ТУ 10.09-62-90, утверждено 01.08.90 г., инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины, утвержденная Главным управлением ветеринарии 16.07.90 г.; вакцина против геморрагической болезни кроликов тканевая инактивированная гидроокисьалюминиевая СТО 00495549-0005-2006.

Методы выделения и характеристика сальмонелл описаны в методических указаниях «Лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных, обнаружение сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней среды». Москва, ВО «Агропромиздат», 1990 г., а также в справочнике «Определитель зоопатогенных микроорганизмов» под редакцией профессора Сидорова М.А., Москва - Колос, 1995, стр.201-204. В «Практикуме по ветеринарной микробиологии и иммунологии» авторы: Костенко Т.С., Родионова В.Б., Скородумов Д.И., М.: «Колос», 2001, на стр.722-233.

Методы выделения чистой культуры возбудителя колибактериоза и характеристика описаны в «Методических указаниях по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных», утвержденных 27.07.2000 г. №13-7-2/2117, Департаментом ветеринарии МСХ РФ, описана характеристика эшерихий в справочнике «Определитель зоопатогенных микроорганизмов» под редакцией профессора Сидорова М.А., Москва - Колос, 1995, стр.196-201, а также в «Практикуме по ветеринарной микробиологии и иммунологии» авторы: Костенко Т.С., Родионова В.Б., Скородумов Д.И., М.: «Колос», 2001, на стр.219-222.

Методы выделения и характеристика вирусной геморрагической болезни кроликов описаны в «Методических указаниях по лабораторной диагностике вирусной геморрагической болезни кроликов», утвержденных ГУВ Госагропрома СССР 28.12.88 г.; в книге «Вирусная геморрагическая болезнь кроликов» авторы: Шевченко А.А., Вишняков И.Ф., Бакулов И.А., Власова Г.А. М.: «Две Короны», 1995, 48 с.; в книге «Болезни кроликов», авторы: Шевченко А.А., Шевченко Л.В., Литвинов A.M. М.: «Аквариум», 2002, стр.42-57.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что проводят отбор пораженных органов от павших кроликов из местного эпизоотического очага, приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей инфекционных болезней сальмонеллеза, эшерихиоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, раздельно выращивают чистые культуры Salmonella typhimurium, Escherichia coli в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³, а вирусом геморрагической болезни кроликов заражают кроликов, которые погибают через 48-72 ч. Затем приготавливают 10-15%-ную суспензию из печени павших кроликов, зараженных вирусом геморрагической болезни кроликов, инактивируют раздельно путем внесения формалина до конечной концентрации 0,4%-ной, выдерживают при температуре 37°C в течение 48-96 часов, смешивают инактивированные культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Пример конкретного осуществления способа изготовления вакцины.

Для изготовления вакцины ассоциированной против сальмонеллеза, эшерихиоза и вирусной геморрагической болезни кроликов проводят отбор пораженных органов от павших кроликов в период заболевания их сальмонеллезом, эшерихиозом и вирусной геморрагической болезнью, из которых приготавливают суспензию, и проводят лабораторные исследования с целью выделения чистых культур возбудителей.

Для определения морфологии и тинкюриальных свойств возбудителя сальмонеллеза готовят мазки-отпечатки из пораженных органов павших нутрий, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают тонкие палочки красного цвета, расположенные одиночно, характерные для рода Salmonella.

Для определения культуральных свойств возбудителя сальмонеллеза нутрий делают посевы выделенной культуры из патологического материала в мясопептонный бульон (МПБ), на дифференциально-диагностические среды (Эндо, Левина, висмутсульфитный агар), на мясопептонный агар (МПА) и инкубируют в термостате при 37°C в течение 16-24 часов. На чашках Петри с МПА вырастают гладкие, прозрачные бесцветные колонии с ровными краями. В пробирках с МПБ наблюдают диффузное помутнение питательной среды. В чашках Петри, на среде Эндо наблюдают прозрачные бесцветные колонии, на среде Левина - голубоватые, на висмутсульфитном агаре - черные колонии с характерным металлическим блеском, что характерно для рода Salmonella.

При определении биохимической активности чистых культур проводят посевы на дифференциально-диагностические среды с различным набором углеводов и компонентов.

Выделенная чистая культура возбудителя сальмонеллеза характерна для представителей рода сальмонелл (ферментирует глюкозу, маннит, не утилизирует лактозу, сахарозу, не расщепляет мочевину, не образует индол, не разжижает желатину).

Патогенность чистой выделенной культуры определяют путем внутрибрюшинного заражения белых мышей массой 14-18 г. Через 2-4 суток наблюдения все зараженные лабораторные животные погибают при 100% сохранности в контроле. Для подтверждения специфичности гибели белых мышей из паренхиматозных органов павших мышей готовят мазки-отпечатки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании под иммерсионной системой микроскопа наблюдают тонкие палочки красного цвета, расположенные одиночно, характерные для рода Salmonella.

Для установления серотиповой принадлежности выделенной чистой культуры Salmonella ставят реакцию агглютинации (РА) на стекле по общепринятой методике. Выделенную чистую культуру проверяют с О-комплексными и монорецепторными O- и H-агглютинирующими сыворотками в реакции агглютинации. Для этого выделенную чистую культуру выращивают на скошенном МПА в течение 18-24 ч при температуре 37°C. PA на стекле ставят с каждой из O- и H-комплексных сывороток последовательно до получения положительного результата с двумя сыворотками. Положительный результат PA наблюдают в виде с трудом разбивающихся хлопьев с выделенной культурой Salmonella typhimurium.

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя эшерихиоза готовят мазки-отпечатки из пораженных органов павших нутрий путем прикосновения обезжиренным стеклом к свежему разрезу пораженной ткани и последующей фиксацией над пламенем спиртовки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают толстые палочки с закругленными концами красного цвета, расположенные одиночно, что характерно для Escherichia coli.

Для определения культуральных свойств возбудителя эшерихиоза кроликов Escherichia coli делают посевы выделенной культуры из патологического материала в мясопептонный бульон (МПБ), на среду Эндо, на мясопептонный агар (МПА) и инкубируют в термостате при 37°С в течение 16-24 часов. На чашках Петри с МПА выростают влажные колонии с ровными краями и гладкой поверхностью серого цвета. В пробирках с МПБ наблюдали равномерное помутнение питательной среды с небольшим осадком, разбивающимся при встряхивании. В чашках Петри, на среде Эндо наблюдают рост колоний малиново-красного цвета с розовыми ободками диаметром 2-3 мм, что характерно для Escherichia coli.

При определении биохимической активности чистых баккультур проводят посевы на дифференциально-диагностичские среды с различным набором компонентов. Для Escherichia coli характерно расщепление глюкозы и лактозы с образованием кислоты и газа, выделение индола, отсутствие уреазы.

Патогенность чистых выделенных культур определяют путем внутрибрюшинного заражения белых мышей массой 14-18 г. Через 2-4 суток наблюдения все зараженные лабораторные животные погибают при 100% сохранности в контроле. Для подтверждения специфичности гибели мышей из паренхиматозных органов павших мышей приготавливают мазки-отпечатки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании под иммерсионной системой микроскопа в препаратах видны толстые палочки с закругленными концами красного цвета, расположенные одиночно, характерные для Escherichia coli. Серологическую типизацию кишечной палочки проводят в реакции агглютинации с набором типоспецифических сывороток по общепринятой методике в пробирках.

В реакции агглютинации исследуемая культура кишечной палочки реагирует с колисывороткой и виден хлопьевидный осадок (положительный результат) при отрицательном контроле.

Выращивание чистой культуры возбудителя проводят в мясопептонном бульоне. Для заражения берут 1-2 см³ культуры Escherichia coli, засевают 80-100 мл жидкой питательной среды и выращивают при 37°C в течение 12-14 часов. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту мутности и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 4-5 млрд. в 1 см³.

Для получения вирусного сырья при изготовлении вакцины используют не привитых против вирусной геморрагической болезни кроликов массой не менее 1,5 кг, заражают их вирулентным вирусом геморрагической болезни кроликов, выделенным из эпизоотического очага с инфекционной активностью 10³ ЛД₅₀/мл. Через 48-72 часа кролики погибают, от павших берут печень в целлофановые пакеты, замораживают, измельчают ножницами и на гомогенизаторе. Полученное сырье доводят физраствором (рН 7,2) до 10-15%-ной суспензии, затем экстрагируют вирус при температуре 4-6°C в течение 10-12 часов, периодически перемешивая, декантируют надосадочную жидкость, к осадку добавляют физраствор 1:1, перемешивают. Для освобождения от клеточного детрита проводили фильтрование через два слоя стерильной марли. Затем отфильтрованное биосырье сливают в емкость и проводят инактивацию внесением формалина 0,1-0,4%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°C в течение 48-96 часов при периодическом перемешивании, затем смешивают инактивированные антигены в равных соотношениях, вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему и тщательно перемешивают, фасуют и укупоривают.

Таким образом, использование для изготовления вакцины ассоциированной против сальмонеллеза, эшерихиоза и вирусной геморрагической болезни кроликов чистых культур возбудителей Salmonella typhimurium, Escherichia coli и вирусной геморрагической болезни кроликов, выделенных из местного эпизоотического очага, позволяет получать специфичную, высокоиммуногенную ассоциированную вакцину для защиты от этих двух опасных инфекционных болезней эшерихиоза и вирусной геморрагической болезни кроликов. Раздельное выращивание возбудителей позволяет получать концентрацию Salmonella typhimurium, Escherichia coli не менее 4 млрд. в 1 см³ в течение 12-14 часов инкубирования и вируса геморрагической болезни кроликов с инфекционной активностью 10³ ЛД₅₀/мл. Использование формалина для инактивации в 0,1-0,4%-ной конечной концентрации позволяет в течение 48-96 часов при температуре 37°C подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность в течение 12 месяцев хранения. Вакцина, полученная заявляемым способом, прошла апробацию. Кроликам вводили однократно в дозе 1 см³ полученную вакцину, и через 12-15 суток у привитых кроликов происходит формирование напряженного иммунитета против сальмонеллеза, эшерихиоза и вирусной геморрагической болезни кроликов продолжительностью не менее 9 месяцев (срок наблюдения). Однократное введение кроликам внутримышечно не вызывает у них поствакцинальных осложнений (см. таблицу).

Таблица Сравнительная характеристика изготовления вакцины по предлагаемому способу и прототипу № п/п Отличительные признаки Прототип Предлагаемый способ 1. Возбудители Вирус миксомы и штамм «B-87» вируса вирусной геморрагической болезни кроликов Salmonella typhimurium, Escherichia coli в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации и вирус вирусной геморрагической болезни кроликов, выделенный из эпизоотического очага 2. Сырье Вирус миксомы с активностью не менее
10⁴ ИД₅₀/см³ и 10-20%-ная суспензия печени с вирусом геморрагической болезни кроликов с активностью не менее 10³ ЛД₅₀/см³ Salmonella typhimurium, Escherichia coli в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0.2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд. микробных клеток в 1 см³ и вирус вирусной геморрагической болезни кроликов, выделенный из эпизоотического очага в виде 10-15%-ной суспензии печени с активностью не менее 10³ ЛД₅₀/см³ 3. Стабилизация Полученную смесь стабилизируют защитной средой при соотношении 10:1 Нет 4. Инактивация Формальдегид 0,1-0,14% в течение 3-4 суток при 27-28°C Формальдегид 0,1-0,4% в течение 48-96 часов при температуре 37°C 5. Лиофилизация После замораживания при минус 55±5°C в течение 10±2 ч путем выдерживания материала при температуре от минус 50±5°C до 0°C в течение 31±1 ч и затем от 0°C до плюс 20±1°C в течение 6±1 ч при вакууме 10±0,5 Па и досушивают в течение 3±1 ч Нет 6. Адъювант Нет Гель гидроокиси алюминия 20% 7. Длительность иммунитета 9 мес. 12 мес.

Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.

Изобретение относится к области ветеринарной медицины и касается способа изготовления вакцины ассоциированной против сальмонеллеза, эшерихиоза и вирусной геморрагической болезни кроликов. При осуществлении способа проводят отбор пораженных органов от павших кроликов из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды. Выделяют чистые культуры возбудителей болезни. Отдельно выращивают культуру Salmonella typhimurium, Escherichia coli в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд. микробных клеток в 1 см³. Затем заражают кроликов вирусом геморрагической болезни с активностью не менее 10³ ЛД₅₀/см³ и из печени павших кроликов готовят 10-15%-ную суспензию. Раздельно инактивируют культуры возбудителей болезней формалином до конечной концентрации не более 0,4%-ной конечной концентрации при температуре 37°C в течение не более 4-х суток, затем в смесь инактивированных культур вносят адъювант, в качестве которого используют гель гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, перед фасовкой тщательно смешивают конечный продукт. Представленное изобретение позволяет получить безвредную, высокоиммуногенную вакцину ассоциированную против сальмонеллеза, эшерихиоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, стабильную при хранении и может быть использовано при конструировании биопрепаратов. 1 табл.

Способ изготовления вакцины ассоциированной против сальмонеллеза, эшерихиоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, включающий раздельное выращивание антигенов, смешивание культур в равных соотношениях, инактивацию формальдегидом, фасовку, отличающийся тем, что проводят отбор пораженных органов павших кроликов из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию и делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей, отдельно выращивают культуру Salmonella typhimurium, Escherichia coli в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд. микробных клеток в 1 см³, затем заражают кроликов вирусом геморрагической болезни с активностью не менее 10³ ЛД₅₀/см³ и из печени павших кроликов готовят 10-15%-ную суспензию, после этого раздельно инактивируют культуры возбудителей формалином до конечной концентрации не более 0,4%-ной конечной концентрации при температуре 37°C в течение 48-96 часов, затем в смесь инактивированных культур вносят адъювант, в качестве которого используют гель гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, перед фасовкой тщательно смешивают конечный продукт.