СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УТРАТЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ ШТАММАМИ ЧУМНОГО МИКРОБА ВСЛЕДСТВИЕ ПОТЕРИ ОБЛАСТИ ПИГМЕНТАЦИИ Российский патент 2006 года по МПК C12Q1/68 C12N15/10 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, и может быть использовано для определения утраты вирулентных свойств штаммами чумного микроба вследствие потери области пигментации, в частности при конструировании вакцинных штаммов.

Известно, что вакцинный штамм чумного микроба Yersinia pestis EV, отличается от диких вирулентных штаммов отсутствием области пигментации, включающей «остров патогенности». Непигментированные и нечувствительные к пестицину штаммы чумного микроба (признаки детерминируются генами области пигментации) авирулентны для лабораторных животных при подкожном способе введения (Une Т., Brubaker R.R., 1984). Такой фенотип, как правило, обусловлен делецией области пигментации.

Известен способ определения стойкости утраты вирулентности аттенуированных штаммов чумного микроба путем многократных подкожных пассажей через организм морских свинок (Основные критерии отбора вакцинных штаммов чумного микроба: Методические указания. - Саратов, 1976; Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба: Методические указания. МУ 3.3.1.1113-02. - М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002). Существуют два способа проведения пассажей: непосредственный пассаж испытуемого штамма во взвеси органов от одного животного другому и пассажи, при которых каждому следующему животному вводят культуру, выделенную от животных предыдущего пассажа. Каждым методом проводят по 10 пассажей. Животных забивают на 4-е сутки после введения штамма. После окончания пассажей субкультуру десятого пассажа, а также все субкультуры, выделенные от погибших животных, забитых с явлениями генерализации, изучают на безвредность по укороченной схеме: дозы 100 м.к., 10 млн. м.к., 2 млрд. м.к. - для морских свинок; 100 м.к. и 10 млн. м.к. - для белых мышей, вскрытие и исследование животных производят на 7, 14 и 21-е сутки. После вскрытия проводят бактериологическое исследование - делают высев из органов и тканей. По результатам бактериологического исследования дают заключение о стойкости утраты вирулентных свойств у штаммов чумного микроба.

Испытуемые и эталонный вакцинный штаммы чумного микроба не должны вызывать гибель морских свинок, привитых 1·10²-1,5·10¹⁰ м.к.

Недостатки способа:

1) длительность эксперимента - подобная схема анализа штаммов позволяет дать ответ о стойкости утраты вирулентных свойств штаммами чумного микроба в лучшем случае через два месяца после начала работы; вероятность высева посторонней микрофлоры, в результате возможного инфицирования лабораторных животных, предполагает повторное проведение всего объема работы и удлиняет время эксперимента вдвое;

2) отсутствие достоверных данных о возможности реверсии вирулентных свойств у исследуемых штаммов;

3) негуманные и дорогостоящие эксперименты на большом количестве лабораторных животных.

Для первичного отбора штаммов - кандидатов в вакцинные штаммы или для отбора мутантов для генно-инженерных работ, несомненно, важна разработка быстрого способа выявления мутантов с делецией области пигментации без пассажей на лабораторных животных.

Современные молекулярно-генетические методы исследования штаммов (например, ПЦР-анализ) позволяют дать ответ о наличии или отсутствии генетического материала, на базе которого может произойти реверсия вирулентности, а значит, о принципиальной возможности реверсии, в течение суток.

Задача изобретения - создание быстрого и абсолютно достоверного способа определения утраты вирулентности штаммами чумного микроба, вследствие потери области пигментации.

Сущность способа состоит в том, что осуществляют выделение тотальной ДНК из штамма Y.pestis, при определенных условиях и режиме амплификации в ПЦР с праймерами IH1 и IY4, ограничивающими область пигментации, выявляют специфичные ампликоны - размером 2468 н.п. для штаммов основного подвида и 2666 н.п. для штаммов неосновных подвидов.

Для подбора праймеров, с помощью программы Gene Runner, проведен компьютерный анализ нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК чумного микроба, непосредственно примыкающих к области пигментации. Выбрана пара праймеров: IH 1-5'-TTT-ACC-GCA-ACA-ACA-TCA-TCC-3', IY 4-5'GGG-CTG-AAA-CCA-CTG-AGA-TG-3', позволяющая выявлять делецию области пигментации.

Для проведения ПЦР установлены оптимальные условия:

ПЦР смесь объемом 25 мкл содержит:

1 Х ПЦР - буфер (10х ПЦР-буфер - 2,5 мкл)

MgCl₂ - 2,5 mM (25 mM MgCl₂ - 2,5 мкл)

dNTP mix - 0,3 mM (5 mM dNTP mix - 1,5 мкл)

праймер IH-1-3,52 pmol (10 ОЕ/мл - 0,08 мкл)

праймер IY-4 - 0,645 pmol (10 ОЕ/мл - 0,015 мкл)

Taq DNA полимераза - 0,2 ед. (500 μ/мл - 0,4 мкл)

Исследуемая ДНК - 10 мкл

Режим амплификации:

Начальная денатурация 94°С - 2 мин.

1. Денатурация: 94°С - 1 мин.

2. Отжиг: 60°С - 1 мин.

3. Элонгация: 72°С - 4 мин.

Проводят 35 циклов, включающих ступени 1-3.

Продукты ПЦР анализируют в 0,9% агарозном геле; наличие специфичных ампликонов (2468 н.п. для штаммов основного подвида и 2666 н.п. для штаммов неосновных подвидов) свидетельствует об отсутствии области пигментации; отсутствие специфичных ампликонов - о том, что ДНК штаммов содержит область пигментации.

Определение авирулентности штаммов чумного микроба вследствие потери области пигментации проводят по следующей схеме.

Осуществляют выделение тотальной ДНК из штамма чумного микроба по стандартной методике для Y.pestis.

Для амплификации фрагментов 2468 н.п. или 2666 н.п. используют подобранные праймеры:

IH 1-5'ТТТ-АСС-ОСА-АСА-АСА-ТСА-ТСС-3',

IY 4-5'GGG-CTG-AAA-CCA-CTG-AGA-TG-3'.

ПЦР смесь объемом 25 мкл содержит:

1 Х ПЦР - буфер

MgCl₂ - 2,5 mM

dNTP mix - 0,3 mM

праймер IH-1 - 3,52 pmol

праймер IY-4 - 0,645 pmol

Taq DNA полимераза - 0,2 ед.

Исследуемая ДНК - 10 мкл.

Полимеразную цепную реакцию проводят на амплификаторе марки «Терцик», производитель ЗАО «ДНК-технология», Москва, согласно следующим подобранным условиям: 2 мин - 94°С начальная денатурация, затем 35 циклов, включающих следующие ступени 1 мин - 94°С денатурация; 1-60°С мин отжиг; 4 мин - 72°С элонгация.

Продукты амплификации анализируют в 0,9% агарозном геле. На гель наносят 3 мкл реакционной смеси, в качестве маркера используют ДНК фага λ, обработанного рест-риктазой HindIII. Агарозный гель прокрашивают бромистым этидием и просматривают под ультрафиолетовым излучением. В образцах с ДНК авирулентных штаммов, утративших область пигментации, синтезируются ампликоны размером 2468 н.п. или 2666 н.п., в образцах с ДНК вирулентных штаммов специфичные ампликоны не синтезируется.

Заявленный способ был успешно апробирован на вакцинном штамме Y.pestis EV и шести типовых штаммах разных подвидов (основного, кавказского, гиссарского, алтайского, таласского и улегейского) и их мутантов, утративших область пигментации.

Применение способа определения авирулентности штаммов чумного микроба вследствие потери области пигментации с использованием полной совокупности заявляемых признаков иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Апробирование способа на вакцинном штамме Y.pestis EV

Подготовка препарата ДНК:

1. Штамм Y.pestis EV выращивают на агаре LB в течение ночи при 28°С.

2. По стандарту мутности готовят взвесь микроорганизмов в дистиллированной воде в концентрации 1,0×10⁷-1,0×10⁹ м.т./мл (микробных тел в 1 мл).

3. В пробирку добавляют мертиолят натрия до концентрации 0,01% и взвесь инкубируют на водяной бане при 56°С для обеззараживания материала.

4. Образец разливают по 500 мкл в эппендорфовские пробирки и помещают на 10-15 минут в кипящую воду. Затем пробирки переносят на лед на 2-3 минуты для охлаждения.

5. Лизаты осветляют центрифугированием при 14000 об/мин 10-15 минут.

6. Надосадочную жидкость, содержащую ДНК, переносят в чистые пробирки и используют для постановки ПЦР или хранят до использования при минус 20°С.

Проведение ПЦР.

Полимеразная цепная реакция проводится в 0,5 мл пробирках.

Состав реакционной смеси в объеме 25 мкл:

1 Х ПЦР - буфер

MgCl₂ - 2,5 mM

dNTP mix - 0,3 mM

праймер IH-1 - 3,52 pmol

праймер IY-4 - 0,645 pmol

Taq DNA полимераза - 0,2 ед.

исследуемая ДНК - 10 мкл.

Режим амплификации:

Начальная денатурация 94°С - 2 мин.

1. Денатурация: 94°С - 1 мин.

2. Отжиг: 60°С - 1 мин.

3. Элонгация: 72°С - 4 мин.

Проводят 35 циклов, включающих ступени 1-3.

Продукты амплификации анализируются в 0,9% агарозном геле. На гель наносится 3 мкл реакционной смеси, в качестве маркера используется ДНК фага λ, обработанного рестриктазой HindIII. Агарозный гель прокрашивается бромистым этидием и просматривается под ультрафиолетовым излучением. Длина синтезированного ампликона соответствует размеру - 2468 н.п., что говорит об отсутствии области пигментации, следовательно, исследуемый штамм авирулентен.

Пример 2. Апробирование способа на штамме Y.pestis 231Δ pgm (отсутствует область пигментации) осуществляем аналогично примеру 1.

При анализе продуктов амплификации длина синтезированного ампликона составила - 2468 н.п., что говорит об отсутствии области пигментации, следовательно, исследуемый штамм авирулентен.

Пример 3. Апробирование способа на штамме Y.pestis 231 (вирулентный) осуществляем аналогично примеру 1 и 2.

При анализе продуктов амплификации отмечено отсутствие синтеза специфичного ампликона, что свидетельствует о наличии области пигментации, следовательно, исследуемый штамм вирулентный.

Пример 4. Апробирование способа на штаммах Y.pestis неосновного подвида (кавказский, гиссарский, алтайский, улегейский, таллаский) и их делеционных мутантах по области пигментации осуществляем аналогично примеру 1, 2 и 3.

При анализе продуктов амплификации длина синтезированного ампликона у делеционных мутантов по области пигментации соответствует размеру - 2666 н.п., что говорит об отсутствии области пигментации, следовательно, исследуемые штаммы авирулентены. У исходных штаммов ампликон не визуализируется, что говорит о наличии области пигментации, следовательно, штаммы вирулентны.

Таким образом, заявленный способ позволяет быстро и точно выявлять авирулентые, вследствие потери области пигментации, штаммы чумного микроба, а также позволяет избежать опасных, длительных, негуманных и дорогостоящих экспериментов на животных. Способ исключает возможность загрязнения отобранных клонов диким штаммом или отбора клонов с похожим фенотипом, сниженной вирулентностью, но с другим типом мутаций, который не исключает вероятности реверсии вирулентных свойств.

Заявляемый способ может быть использован при конструировании вакцинных штаммов, а также авирулентных генно-инженерных штаммов, пригодных для различных генетических экспериментов.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии. Описан способ определения утраты вирулентности штаммами чумного микроба вследствие потери области пигментации путем проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров IH 1-5'TTT-ACC-GCA-ACA-ACA-TCA-TCC-3', IY 4-5'GGG-CTG-AAA-CCA-CTG-AGA-TG-3' в реакционной смеси следующего состава: 1 Х ПЦР-буфер, MgCl₂-2,5 mM, dNTP mix-0,3 mM, праймер IH-1-3,52 pmol, праймер IY-4-0,645 pmol. Tag DNA полимераза -0,2 ед. в течение 35 циклов амплификации (денатурация 1 мин при 94°С, отжиг 1 мин при 60°С, элонгация 4 мин при 72°С). Авирулентность штамма определяют по наличию специфичных ампликонов размером 2468 н.п. для штаммов основного подвида и 2666 н.п. для штаммов неосновных подвидов, свидетельствующих об отсутствии области пигментации. Использование способов позволяет быстро и точно выявить авирулентные штаммы чумного микроба, а также избежать опасных, негуманных и дорогостоящих экспериментов на животных. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ определения утраты вирулентности штаммами чумного микроба вследствие потери области пигментации, включающий выделение тотальной ДНК исследуемого штамма, проведение полимеразной цепной реакции с праймерами IH 1-5'ТТТ-АСС-GCA-АСА-АСА-ТСА-ТСС-3' и IY 4-5'GGG-CTG-AAA-CCA-CTG-AGA-TG-3', выявление специфичного ампликона размером 2468 н.п. для штаммов основного подвида и 2666 н.п. для штаммов неосновных подвидов и по его наличию определяют авирулентность исследуемых штаммов, обусловленную потерей области пигментации.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что режим амплификации включает начальную денатурацию 2 мин при 94°С и 35 циклов, состоящих из этапов: денатурация 1 мин при 94°С, отжиг 1 мин при 60°С, элонгация 4 мин при 72°С.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакционную смесь ПЦР содержит 1 Х ПЦР-буфер, MgCl₂-2,5 mM, dNTP mix-0,3 mM, праймер IH-1-3,52 pmol, праймер IY-4-0,645 pmol, Tag DNA полимеразу-0,2 ед.