СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ ОСНОВНОГО И НЕОСНОВНЫХ ПОДВИДОВ И ВОЗБУДИТЕЛЯ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2011 года по МПК C12Q1/68 C12N15/31 C12R1/01 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы и дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов.

Чума, возбудителем которой является вид бактерий Yersinia pestis, все еще представляет реальную угрозу для здоровья людей, связанную с существованием на различных континентах многочисленных активных природных очагов чумы, а также с возможностью использования возбудителя чумы в биотеррористических актах. Ежегодно в мире регистрируется достаточно большое количество случаев заболевания чумой, которые часто приводят к летальному исходу. Ввиду этого важное значение имеет разработка точных методов детекции Y.pestis и дифференциации этого возбудителя от других бактерий, в частности от близкородственной Yersinia pseudotuberculosis. Сам вид Y.pestis неоднороден по составу и делится на основной подвид - subspecies (ssp) pestis и группу неосновных подвидов: алтайский - ssp.altaica, кавказский - ssp.caucasica, улегейский - ssp.ulegeica, гиссарский - ssp.hissarica. Подвиды возбудителя чумы отличаются по вирулентности и эпидемической значимости. Штаммы основного подвида характеризуются высокой вирулентностью и имеют высокий эпидемический потенциал. Штаммы неосновных подвидов имеют избирательную вирулентность, эпидемически малозначимы и практически не вызывают заболеваний человека. В связи с этим наряду с необходимостью дифференциации возбудителя чумы и псевдотуберкулезного микроба не менее важное значение имеет и дифференциация подвидов Y.pestis, и, в частности, детекция среди них штаммов основного подвида. Разработка эффективных и надежных методов быстрой идентификации основного подвида Y.pestis среди близкородственных патогенных иерсиний имеет важное практическое значение.

В настоящее время дифференциацию штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов проводят с учетом различной экспрессии ряда биохимических признаков: ферментации моносахаридов - рамнозы, мелиобиозы, продукции изоцитратлиазы и других. Однако проявление фенотипических свойств возбудителя чумы зависит от условий культивирования штаммов, качества используемых сред, а также от выделения культур возбудителя в чистом виде, что значительно усложняет и увеличивает сроки проведения анализа.

Большей эффективностью и быстротой получения результатов отличается метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанный на использовании генетических особенностей штаммов различных бактерий. Для проведения ПЦР не обязательно выделение чистых культур возбудителя, поскольку метод отличается высокой чувствительностью и позволяет проводить определение видовой и подвидовой принадлежности бактерии при наличии небольшого количества клеток в материале исследуемого образца.

До настоящего времени метод ПЦР использовали для детекции возбудителя чумы, а также для дифференциации его от возбудителя псевдотуберкулеза, но практически не применяли его для дифференциации основного и неосновных подвидов Y.pestis. При этом для детекции возбудителя чумы в ПЦР использовали нуклеотидные последовательности различных генов caf, pla, lcrV, 3a, irp-2 (Neubauer Н. et al., 2000; Rahalison L. et al., 2000; Hongwei Z.J.L., 2000; Балахонов С.В. с соавт.2000; Гаранина С.Б. с соавт., 2001; Сучков И.Ю. с соавт., 2001; Radnedge L. et al., 2001; Савостина Е.П., 2004; Kuske C.R. et al., 2006; Куклев B.E. с соавт. 2006).

Так, известен способ детекции бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных для человека видов иерсиний методом полимеразной цепной реакции (патент RU 2354700, опубликован 10.05.2009 г.) на основе использования последовательности участка гена ompF порина. Этот способ позволяет разделять виды патогенных иерсиний - возбудителей чумы, псевдотуберкулеза, кишечного иерсиниоза на видовом уровне, но он не предусматривает проведения идентификации штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов.

Известен другой способ быстрой детекции и дифференциации Y.pestis и Y.pseudotuberculosis (DE 10124342 (A1), опубликован 28.11.2002 г.), который предусматривает двухэтапную детекцию ДНК возбудителей чумы и псевдотуберкулеза: методом ПЦР и методом гибридизации со специфическими зондами, что повышает надежность и эффективность способа. Однако этот способ также не позволяет дифференцировать штаммы Y.pestis основного и неосновных подвидов.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба (RU 2332464, опубликован 27.08.2008 г.), который основан на использовании вариабельности нуклеотидной последовательности участка хромосомы hutG - YP01967. Однако недостаток способа заключается в том, что участок hutG - YP01967 расположен в нестабильной области генома Y.pestis, которая может часто утрачиваться у штаммов основного подвида, что делает невозможной дифференциацию таких штаммов с помощью предложенного метода. Кроме того, этот способ сложен в интерпретации, требует использования большой группы референтных штаммов, а также имеет некоторые погрешности, поскольку не позволяет избежать совпадения размеров ПЦР фрагментов у некоторых штаммов основного и неосновных подвидов, что требует проведения дополнительных исследований (например, секвенирования) для определения подвидовой принадлежности штамма. Другие публикации об использовании метода ПЦР для дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов в литературе отсутствуют, как отсутствуют и данные об участках генома Y.pestis, применение которых позволило бы быстро и эффективно провести такую дифференциацию.

Задачей изобретения является разработка простого в интерпретации, надежного и быстрого способа дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновного подвидов и штаммов возбудителя псевдотуберкулеза методом ПЦР.

Технический результат заключается в повышении эффективности дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов с одновременной дифференциацией штаммов возбудителя псевдотуберкулеза.

Заявляемый способ основан на использовании в качестве ДНК-мишеней хромосомных генов жизнеобеспечения terC, ilvN и inv, кодирующих соответственно белок резистентности к теллурию, ацетолактатсинтазу и инвазин-адгезин.

Технический результат достигается способом дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов и возбудителя псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции, который предусматривает выделение ДНК штамма, проведение полимеразной цепной реакции с амплификацией фрагментов генов terC, ilvN и inv исследуемого штамма, при этом праймеры на эти гены имеют следующие последовательности:

89-S - AATCAAATCTCGCCCAGC,

89-As - GCTGCGTATCATTTCACC;

45-S - AGTGGTCTGCTTCTCTGG,

45-As - CGGCATACACAGAATACC,

inv839 - TACCTGCACTCCCACAAC,

inv1007 - CCCATACGCTGATCTACC,

и определение размеров амплифицированных фрагментов с последующей дифференциацией исследуемых штаммов, которую проводят путем сравнения размеров полученных фрагментов генов terC, ilvN и inv с аналогичными фрагментами у типичных штаммов возбудителей чумы основного и неосновных подвидов.

Способ осуществляют следующим образом.

Выделение ДНК исследуемого штамма чумного микроба проводят по стандартной методике в соответствии с МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами 1-11 групп патогенности».

Полимеразную цепную реакцию осуществляют по стандартной методике (МУ 1.3.1794-03) с применением вышеуказанных праймеров на гены terC, ilvN и inv. Олигонуклеотидные праймеры, используемые для амплификации в ПЦР фрагментов terC, ilvN и inv, рассчитаны на основе нуклеотидных последовательностей этих генов у штаммов чумного микроба Y. pestis CO92, KIM, Antiqua, Nepal516, Angola, 91001, Pestoides F и Y. pseudotuberculosis IP31758, представленных в базе данных NCBI GenBank. С помощью рассчитанных праймеров проводят в ПЦР амплификацию фрагментов генов terC, ilvN и inv и определяют размеры полученных фрагментов генов. Праймеры на гены terC, ilvN и inv имеют следующие последовательности:

89-S - AATCAAATCTCGCCCAGC,

89-As - GCTGCGTATCATTTCACC;

45-S - AGTGGTCTGCTTCTCTGG,

45-As - CGGCATACACAGAATACC,

mv839 - TACCTGCACTCCCACAAC,

invl007- CCCATACGCTGATCTACC.

Полимеразную цепную реакцию с амплификацией фрагментов генов terC, ilvN и inv осуществляют по следующей программе: 1 цикл 94°С в течение 5 мин, затем 35 циклов при 94°С 45 сек, 55°С 1 мин, 72°С 45 сек и завершающий цикл 3 мин при 72°С. Определение размеров образованных в ПЦР фрагментов генов terC, ilvN и inv у исследуемых штаммов проводят методом электрофореза в 3% агарозном геле относительно стандарта маркеров молекулярных масс с размером от 100 до 1000 п.н. Нами установлено, что типичные штаммы возбудителя чумы основного подвида имеют размеры образуемых в ПЦР фрагментов генов terC - 300 п.н., ilvN - 515 п.н. и inv - 877 п.н.; штаммы неосновных подвидов соответственно 389, 560 и 877; а штаммы псевдотуберкулезного микроба - 389, 560 и 169 (таблица). В дальнейшем дифференциацию исследуемого штамма проводят путем сравнения с данными представленными в таблице.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Дифференциация штамма №1 (Модельный эксперимент).

Выделение ДНК штамма №1 проводят стандартным методом с помощью лизирующего раствора на основе 6М гуанидинизотиоцианата с предварительным обеззараживанием культуры путем добавления мертиолята натрия до концентрации 1:10000 с последующим прогреванием при температуре 56°C в течение 30 мин. (Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности. МУ 1.3.1794-03).

Полимеразную цепную реакцию проводят в объеме 25 мкл; реакционная смесь содержит: 1х буфер (10х ПЦР-буфер - 2,5 мкл), MgCl₂ - 2,0 мМ, смесь dNTP - 0,3 мМ, олигонуклеотидные праймеры - 2 пмол, Taq DNA полимераза - 0,1 ед., исследуемой ДНК - 10 мкл. Продукты амплификации анализируют в 3% агарозном геле с добавлением этидиум бромида и просматривают в УФ-свете.

Определяют размеры образовавшихся фрагментов генов terC, ilvN и inv. Они составляют 300, 515, 877 п.н., что соответствует размерам фрагментов генов у штаммов основного подвида. Исследуемый штамм №1 относят к основному подвиду Y.pestis.

Пример 2. Дифференциацию штамма №2 проводят аналогично примеру №1.

Размеры образуемых в ПЦР фрагментов генов terC, ilvN и inv составляют 389, 560 и 877 п.н., что соответствует размерам фрагментов, образуемых у штаммов возбудителя чумы неосновных подвидов. Штамм №2 относят к неосновным подвидам Y.pestis.

Пример 3. Дифференциацию штамма №3 проводят аналогично примеру №1.

Размеры образуемых в ПЦР фрагментов генов terC, ilvN и inv составляют 389, 560 и 169 п.н., что соответствует размерам фрагментов, образуемых у штаммов возбудителя псевдотуберкулеза. Штамм №3 относят к Y.pseudotuberculosis.

Таким образом, заявленный способ дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов методом ПЦР, основанный на вариабельности последовательностей генов жизнеобеспечения terC, ilvN и inv позволяет быстро, эффективно и надежно проводить дифференциацию штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов и Y.pseudotuberculosis.

Таблица Вид, подвид Размеры генов   terC ilvN inv Y.pestis основной подвид 300 515 877 Y.pestis неосновные подвиды 389 560 877 Y.pseudotuberculosis 389 560 169

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов и возбудителя псевдотуберкулеза. Способ предусматривает выделение ДНК исследуемого штамма, проведение ПНР с использованием нуклеотидных праймеров на гены terC, ilvN и inv, имеющих следующие последовательности: 89-S - AATCAAATCTCGCCCAGC, 89-As - GCTGCGTATCATTTCACC; 45-S - AGTGGTCTGCTTCTCTGG, 45-As - CGGCATACACAGAATACC; inv839 - TACCTGCACTCCCACAAC, inv1007 - CCCATACGCTGATCTACC. Дифференциацию исследуемых штаммов проводят путем сравнения размеров полученных фрагментов генов terC, ilvN и inv с аналогичными фрагментами у типичных штаммов возбудителей чумы основного и неосновных подвидов. Предложенное изобретение позволяет быстро, эффективно и надежно проводить дифференциацию штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов и Y. pseudotuberculosis. 1 табл.

Способ дифференциации штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов и возбудителя псевдотуберкулеза, включающий выделение ДНК, проведение ПЦР с амплификацией фрагментов генов исследуемого штамма, отличающийся тем, что при проведении ПЦР используют нуклеотидные праймеры на гены terC, ilvN и inv, имеющие следующие последовательности:
89-S - AATCAAATCTCGCCCAGC,
89-As - GCTGCGTATCATTTCACC;
45-S - AGTGGTCTGCTTCTCTGG,
45-As - CGGCATACACAGAATACC;
inv839 - TACCTGCACTCCCACAAC,
invl007 - CCCATACGCTGATCTACC;
дифференциацию штаммов проводят путем сравнения размеров полученных фрагментов генов terC, ilvN и inv исследуемых штаммов с аналогичными фрагментами у типичных штаммов возбудителей чумы основного, неосновных подвидов и псевдотуберкулезного микроба, при этом типичные штаммы возбудителя чумы основного подвида имеют размеры образуемых в ПЦР фрагментов генов terC - 300 п.н., ilvN - 515 п.н. и inv - 877 п.н.; штаммы неосновных подвидов соответственно 389, 560 и 877; а штаммы псевдотуберкулезного микроба - 389, 560 и 169.